Name: 体外研究 心室辅助装置的血栓形成试验 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-21T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: 了解心室辅助装置血栓形成评估的体外实验方法，使用循环测试平台识别血栓生成热点区域。该标准化方案可在动物实验前优化装置抗血栓性能，减少动物使用并提升研发效率。

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本工作得到了美国国立卫生研究院资助项目R01HL089456以及美国陆军医学研究采购活动项目编号W81XWH2010387的支持。

本研究中使用的绵羊全血购自商业供应商，因此无需康奈尔大学机构动物护理和使用委员会进行审查。
1. 测试流动回路的构建
注意：有关本实验方案中使用的环路组件及其他所有材料的详细列表，请参见材料表。
<ol>
	<li>改造静脉输液袋（IV袋）。
	<ol>
		<li>使用塑料热封器改造静脉输液袋，以调整其体积和形状，如图1所示。 
		注：袋体的形状有助于排气，并允许使用止血钳在输液管线上进行夹闭30,31。热封线的位置应根据心室辅助装置（VAD）及管路的预充体积来确定，以实现总预充体积为150 mL。</li>
		<li>在输液袋顶部做一个4 mm的切口，作为通气口。将带倒刺的雌性鲁尔锁接头插入切口，并用RTV硅橡胶粘合剂密封切口部位。将一个单向止流阀连接至鲁尔锁接头。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用改造后的静脉输液袋、聚氯乙烯（PVC）管路、聚碳酸酯带倒刺接头以及三通和单通止流阀组装测试回路，如图1所示。</li>
	<li>连接压力计。
	<ol>
		<li>将6英寸延长管连接至入口和出口侧的压力端口。在延长管的另一端连接一个单向止流阀。 
		注：止流阀可在启动泵之前断开压力计管路，以便用液体预充延长管，具体操作见步骤4.3。</li>
		<li>将每根内径（ID）为1/8&#34;的管路一端连接至压力计倒刺接头，另一端插入雄性鲁尔接头。</li>
		<li>将雄性鲁尔接头连接至单向止流阀。打开止流阀以获取压力读数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>安装夹持式超声波流量探头以测量流量。</li>
	<li>在出口压力端口远端放置一个霍夫曼夹（Hoffman clamp），以调节流动阻力。</li>
</ol>
2. 氯化钙（CaCl2）溶液的配制
<ol>
	<li>将粉末状 CaCl2 溶解于 1× TRIS 缓冲盐水（pH 7.4）中，配制 1 M 溶液。避免使用含磷酸盐的缓冲液（如 PBS 或 DPBS），因为钙离子与磷酸根会反应生成不溶性沉淀。</li>
	<li>若需大量配制 CaCl2 溶液，应分步少量加入 CaCl2 粉末，因其溶解过程为放热反应。</li>
	<li>如有必要，可用盐酸（HCl）或氢氧化钠（NaOH）调节溶液 pH 至 6–8。</li>
</ol>
3. 血液的制备
注意：本研究中使用的绵羊血液来自 材料表 中列出的商业供应商。采血时使用14号针头，动物保持标准的农业站立姿势进行固定。从针头插入到采血完成共耗时10–12分钟。血液采用CPD抗凝，比例为每86份血液加入14份CPD（CPD配方：26.3 g/L 柠檬酸钠、25.2 g 葡萄糖、3 g/L 柠檬酸和2.2 g/L 磷酸钠溶于去离子水[DI水]中）。血袋置于带冰袋的保温容器中隔夜运输，并在采血后24小时内用于实验。
<ol>
	<li>准备供体血液以供使用。
	<ol>
		<li>将血袋置于倾斜平台上 15–30 分钟，以轻柔混匀血液并使其达到室温（RT）。</li>
		<li>将磁力搅拌子放入指定用于血液转移的聚碳酸酯烧杯或容器中。</li>
		<li>通过输血滤器将血液转移至烧杯中，以去除大块聚集物。操作过程中应轻柔处理血液，防止细胞成分受损。倾倒时沿容器壁缓缓流入，避免自由下落，以最大限度减少细胞损伤。 
		注意：若发现存在大块血栓或滤器堵塞，应弃用该血液。</li>
		<li>将烧杯或容器置于磁力搅拌器上，调节转速，使血液表面开始缓慢旋转但不形成明显涡流。持续搅拌至少 5 分钟。</li>
		<li>测定血细胞比容和血小板计数，确保其值处于该物种正常范围内。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行滴定实验以确定目标 CaCl2 浓度。 
	注意：采用枸橼酸盐抗凝的血液需重新加入钙离子以启动凝血和血栓形成检测，同时添加肝素以防止过度凝血。实验开始时的目标活化凝固时间（ACT）为 300 秒。请注意，本节中提供的参考 ACT 值是使用供体绵羊血液获得的，可能因物种差异以及采血时所用抗凝程度不同而有所变化。此外，不同仪器测得的 ACT 值也可能存在差异32,33,34。可能需要经过若干次尝试与调整，才能确定特定实验室条件下的最佳 ACT 范围。
	<ol>
		<li>从原厂包装中取出 2 mL 配制好的 1 M CaCl2 溶液和 0.5 mL 肝素钠（1000 U/mL），分别转移至微量离心管中，以避免污染储备液。</li>
		<li>将 10 mL 血液转移至 14 mL 聚丙烯试管中。共准备四支试管。</li>
		<li>为在血液中达到 0.5 U/mL 的肝素浓度，向 10 mL 血液样品中加入 5 µL 肝素钠。</li>
		<li>为在血液中达到 5 mM 的钙离子浓度，向 10 mL 血液样品中加入 50 µL 的 1 M CaCl2 溶液。加样时轻轻晃动移液器吸头，使 CaCl2 在更大范围内分散。</li>
		<li>立即上下颠倒试管 10 次，水平滚动（在平坦表面或掌心之间）混匀，再上下颠倒 10 次，确保充分混合。</li>
		<li>按照制造商说明书，使用床旁全血凝固检测系统测定 ACT。初始 ACT 通常在 400–500 秒之间。</li>
		<li>保持肝素浓度不变，逐步提高 CaCl2 浓度（至约 7–8 mM），使 ACT 达到 300 秒。</li>
		<li>在另一管血液中验证最终浓度及其对应的 ACT 值。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 测试前准备步骤
注意：本节所述所有步骤均适用于第5和第6节。在使用牛血清白蛋白（BSA）或血液循环运行泵之前，请执行以下步骤。通过重力引流方式在容器之间转移血液，以尽量减少机械应力。避免使用注射器活塞推动血液，以免产生过高压力。此外，避免使血液通过狭窄开口节流，以防对细胞成分造成损伤。
<ol>
	<li>填充和排空测试回路
	<ol>
		<li>将一根30英寸的延长管连接到注射端口，并连接一个60 mL注射器筒作为漏斗。打开储液罐的旋塞，作为排气口。</li>
		<li>将液体倒入漏斗中，根据需要抬高漏斗以加快填充速度。将回路填充至袋顶排气口下方1–2 cm处。关闭排气口和注射端口的旋塞。</li>
		<li>排液时，打开排气口和注射端口的旋塞，并将漏斗降至实验台水平以下。将泵抬高至排液口以上，以排空残留液体。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>排除测试回路中的空气 
	注意：在启动泵之前，当使用BSA或血液填充回路时，需执行此操作。
	<ol>
		<li>确保回路中任何位置均无空气滞留。通过轻轻敲击和挤压管路及储液罐，使附着在表面的气泡脱离。</li>
		<li>若评估轴流式血泵，将其旋转至垂直位置，利用浮力释放空气。若使用离心泵，则将其倒置并旋转，确保次级流道中无空气滞留。</li>
		<li>仔细检查管路的水平段以及管路与连接件之间的接头，确保无气泡存在。</li>
		<li>挤压输液袋，使液面接近顶部狭窄部分，并用止血钳夹住液体通路，以消除液-气界面。关闭排气口旋塞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>预充压力管路和采样端口
	<ol>
		<li>关闭压力管路末端的旋塞，取下压力计管路，连接一个3 mL注射器。打开旋塞，将1–2 mL液体抽入延长管中（约4 cm）。</li>
		<li>关闭旋塞，取下注射器，重新连接压力计管路。打开旋塞以进行压力读数。</li>
		<li>使用注射器预充采样端口。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>清洁注射和采样端口
	<ol>
		<li>将一片无绒擦拭布剪成或撕成三个相等的小块。将其中一块的一角拧成尖端，插入端口中以吸收任何残留血液。</li>
		<li>将第二块擦拭布拧成尖端，用生理盐水润湿，将湿润的尖端插入端口，旋转清洁，以彻底清除残留血液。</li>
		<li>使用第三块擦拭布吸收端口中任何残留的生理盐水。 
		注意：在采集血样后或当端口中存在残留血液时，应立即执行此清洁程序。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 封闭血液接触表面
<ol>
	<li>用1% BSA溶液填充回路，并运行VAD使其循环至少30分钟。</li>
	<li>检查回路是否泄漏，必要时重新组装。</li>
	<li>完全排出BSA溶液，以避免血液稀释。</li>
</ol>
6. 血栓形成检测
<ol>
	<li>准备测试回路。
	<ol>
		<li>用150 mL血液填充回路。</li>
		<li>排出环路中的空气，并按照步骤 4.2–4.4 所述对压力管路和采样口进行预充。</li>
		<li>以低速启动泵，运行约5秒，以排除泵内可能滞留的气泡，然后停止泵。</li>
		<li>如果袋中有气泡出现，重复步骤4.2再次进行除气。</li>
		<li>以低速重新启动泵，以循环回路中的血液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在循环血液中加入肝素。
	<ol>
		<li>从原厂包装中分别取1 mL肝素钠（1000 U/mL）和1.5 mL乙二胺四乙酸（EDTA；0.5 M）至单独的离心管中，以便在检测过程中便于操作。</li>
		<li>使用注射器通过三通旋塞的横向端口向回路中注入物质。旋转旋塞上的雄性鲁尔锁，使注射端口朝上，以便将气泡 trapped 在顶部。</li>
		<li>通过将75 U肝素钠加入150 mL血液中，使环路中的肝素浓度达到0.5 U/mL。使用微量移液器吸取75 U肝素（若使用1000 U/mL浓度，则为75 µL），在同时排出移液器内容物的同时抽动3 mL注射器的活塞，将肝素转移至该注射器中。确保所有液体完全转移，避免洒出。</li>
		<li>将注射器通过鲁尔锁紧接头连接至向上放置的注射端口，注射器尖端垂直向下。拉动注射器活塞以抽取血液，同时在抽吸过程中将肝素与血液混合，并吸入少量空气至注射器内。使气泡上升至注射器顶部。将混合液注入环路中，确保无空气进入。</li>
		<li>将血液在注射器内来回推送4-5次，以确保肝素化血液不会局限于端口空间内。注意避免空气进入管路。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>滴定环路中血液的活化凝血时间（ACT）。
	<ol>
		<li>通过加入750 µL的1 M CaCl₂，使循环液中的初始钙离子浓度达到5 mM2 使用与肝素相同的步骤，将溶液加入150 mL血液中。
		<ol>
			<li>血液暴露于高浓度钙溶液中可能在注射器内开始凝固。去除残留空气后，应迅速注入液体。可选择性地用氯化钙稀释2 用1 ml TRIS缓冲盐水冲洗注射器，以降低过早凝固的风险。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>让注入的 CaCl₂ 静置2 循环&#160;在环路中&#160;在采集血样以测定初始活化凝血时间（ACT）之前，至少应等待2分钟。</li>
		<li>将1 mL注射器连接至采样口。抽取并弃去0.5 mL废血，以清除采样口内的滞留血液。</li>
		<li>连接一个新的1 mL注射器，抽取0.5 mL血液用于分析，并测定ACT。使用4.4步骤中的程序清洁采样口。</li>
		<li>参考步骤 3.2 中的滴定值，以确定目标 CaCl2 浓度。逐步增加钙浓度以达到300秒的活化凝血时间（ACT）。避免一次性加入全部CaCl₂2 立即操作，以防止快速凝固。 
		注意：本研究中采用的检测条件显示，初始钙离子浓度为 5 mM 时，活化凝血时间（ACT）为 450 ± 50 秒；最终钙离子浓度达到 7–8 mM 时，ACT 降至 300 ± 20 秒。尽管个体反应可能存在差异，但应尽量使 ACT 达到或低于 300 秒后再开始实验。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>开始测试。
	<ol>
		<li>当循环中达到300秒的活化凝血时间（ACT）后，开始进行1小时的测试。通过调节转子转速并使用霍夫曼夹（Hoffman clamp）调节阻力，将泵调整至所需的流速和压力。</li>
		<li>每完成6.3.3-6.3.4步骤后，每隔15分钟测量一次ACT。</li>
		<li>若活化凝血时间（ACT）低于200秒，则向回路中追加注射25单位肝素钠。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>结束测试。
	<ol>
		<li>1小时结束时，向环路中注入EDTA以抑制进一步凝血，使血液中EDTA终浓度达到5 mM。（若使用0.5 M EDTA溶液，注入1.5 mL。）</li>
		<li>让EDTA循环混合2分钟，然后停止泵。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>断开并冲洗泵。
	<ol>
		<li>使用止血钳夹紧连接泵入口和出口的管路，将止血钳置于距入口和出口接头3-4 cm处。</li>
		<li>小心断开管路以卸下泵。</li>
		<li>将泵和循环管路中的血液排入容器中。</li>
		<li>通过重力灌注或使用移液管将生理盐水经泵的入口和出口冲洗，以去除泵内残留的血液。 
		注意：步骤 6.7 和 6.8 需同时进行。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>检查泵的流路。
	<ol>
		<li>使用内窥镜/孔探仪相机拍摄泵的入口和出口图像。</li>
		<li>拆卸泵体（如适用）。将部件置于生理盐水浴中清洗，并使用解剖显微镜或微距镜头检查血栓。</li>
		<li>拍摄血液接触表面的照片以供记录。 
		注意：一致的检查和详尽的记录对于对比测试至关重要。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>过滤使用过的血液。
	<ol>
		<li>裁剪一块足够覆盖收集容器开口的100-µm尼龙网片。</li>
		<li>将滤网置于容器上方，稍呈下垂状，以利于血液有效通过。固定滤网边缘，防止过滤过程中滑动。</li>
		<li>将使用过的血液通过尼龙滤网过滤。根据机构的生物废弃物处理指南处置血液。</li>
		<li>检查滤网中捕获的血栓并记录结果。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行组织学分析前的准备。
	<ol>
		<li>如果计划进行组织学分析，应按照适当的安全操作规程，将发现的血栓固定于福尔马林溶液中。 
		警告：操作甲醛时务必使用通风橱。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 清洁程序
<ol>
	<li>拆卸流路系统。丢弃PVC血袋和管路。</li>
	<li>将所有其他与血液接触的组件（连接器、旋塞阀、鲁尔锁等）浸泡于1%酶活性粉状洗涤剂溶液中过夜。用温自来水冲洗，再用去离子水冲洗，然后晾干。
	<ol>
		<li>若仍有血凝块残留，将组件在洗涤剂溶液中进行超声处理。彻底冲洗后晾干。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>清洁泵体。
	<ol>
		<li>若泵可拆卸，将与血液接触的部件依次浸泡并超声于1%通用清洁剂/脱脂剂溶液中，随后再置于1%酶活性粉状洗涤剂溶液中处理。</li>
		<li>若泵不可拆卸，则将其连接至充满清洁液的新流路系统，以高速运行至少30分钟。必要时重复操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用温自来水彻底冲洗泵体，再用去离子水冲洗，然后晾干。</li>
</ol>

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</ol>

S.E.O. 目前担任 Magenta Medical 的顾问，曾担任 Boston Scientific 的顾问。其他作者均无相关财务披露或利益冲突需要报告。

首次人体试验新型泵具始终是一项高风险的尝试，因为临床前研究无法可靠预测心室辅助装置在人体内的血栓形成倾向26值得注意的是，一些在动物试验中表现出无血栓形成特性的VAD，在临床应用中 later 出现了显著的血栓形成倾向36一种侵袭性的 体外 专门设计用于诱发血栓形成的测试方案，为在研发早期识别潜在的设计或制造缺陷提供了宝贵机会。尽管该方案无法对未来情况做出确切预测 体内 通过评估VAD在促凝条件下的性能，这种主动方法可揭示可能出现的潜在血栓形成热点。
现有 体外 VAD血栓形成的研究方法在测试时长和抗凝策略上存在显著差异。Hastings等人使用高度肝素化的猪血进行了为期48小时的测试，成功复现了临床上在ECMO泵中观察到的血栓形成模式37相比之下，Schima 等人的开创性研究使用鱼精蛋白将肝素化血液的活化凝血时间（ACT）降低至其基线值的3倍作为实验起始点，并在ACT降至基线值的1....

心室辅助装置（VAD）已成为治疗晚期心力衰竭患者的标准手段，然而血栓形成和卒中的风险仍然是一个重大挑战1,2。VAD内的血栓形成通常在临床前动物实验中进行评估，尽管这类研究具有重要价值，但仍存在显著的成本和后勤挑战。这些研究耗费大量资源、耗时较长，且单个缺陷可能导致整个试验失败，从而需要额外的试验。这不仅增加了经济负担，也因需重复进行动物实验而引发伦理方面的担忧。
尽管目前已存在许多用于预测血小板沉积和血栓形成的数值模型3,4,5,6，但其中仅有少数适用于模拟心室辅助装置（VAD）等宏观尺度设备中的血栓形成过程7,8,9。此外，现有模型不可避免地假设了理想化的表面和简化的&#34;密闭&#34;几何结构，无法准确反映真实泵体组件的复杂性与缺陷。当考虑血小板与表面相互作用时，这些宏观尺度模型通常采用统一设定的材料属性（通常在表面通量边界条件中以系数形式建模）10,11,12。因此，数值模型尚无法完全替代血液实验测试。
材料选择和表面光洁度在VAD表面血小板黏附过程中均起着关键作用13,14,15,16,17。表面粗糙区域或不规则等缺陷可能促进血小板黏附及血栓形成。此外，流路中部件之间的缝隙可成为血栓形成的起始点，为血凝块的形成和生长提供受保护的环境18,19。在装配过程中使用润滑脂、润滑剂或密封剂也可能带来风险，因为这些物质可能渗入流路并与血液相互作用，进一步增加并发症风险。
因此，有必要建立一个明确定义的 体外 一种可在动物实验或临床应用前可靠评估心室辅助装置（VAD）抗血栓性能的测试方案。尽管目前已有广泛采用的ASTM标准用于溶血评估20，目前尚无针对心室辅助装置（VAD）在临床相关运行条件下进行血栓形成性测试的统一标准21尽管三十年前的开创性研究已证明其可行性 体外 血泵血栓检测22,23,24,25迄今为止，动物实验仍然是评估血栓形成的实际常规做法26. 阻碍更广泛应用的因素 体外 方法的复杂性可能源于凝血过程本身的复杂性，以及众多可能影响检测结果的混杂因素，这使得区分内在泵的血栓形成倾向与因方法学局限性和操作误差引起的人工假象变得极具挑战性。
这促使我们分享一份详细的实验方案，以指导研究人员避免常见问题，从而促进该方法的应用 体外 测试并减轻对动物实验的依赖。本文所述方案源自 Maruyama 等人。27在5的设计过程中进行了优化和验证th 第五代 PediaFlow（PF5）儿科心室辅助装置28,29该检测方法在动物实验前系统性地识别和解决VAD原型中潜在的血栓形成风险方面发挥了关键作用。

<table><tbody><tr><td>14 mL 试管</td><td>Falcon</td><td>352059</td><td>带 snap-cap 盖的圆底聚丙烯试管</td></tr><tr><td>单向止流阀</td><td>Qosina</td><td>99759</td><td>雌性鲁尔锁，带旋转锁的雄性鲁尔</td></tr><tr><td>三通旋塞阀</td><td>Qosina</td><td>99771</td><td>2 个雌性鲁尔锁接头，旋转式雄性鲁尔锁接头</td></tr><tr><td>用于Hemochron的ACT+比色皿</td><td>Werfen</td><td>000JACT+</td><td>45/盒</td></tr><tr><td>通用清洁剂/除油剂</td><td>简单绿</td><td>2710200613005</td><td>简易绿色清洁剂和去污剂。使用1%溶液。</td></tr><tr><td>带倒刺接头</td><td>Qosina</td><td>73311</td><td>材料：聚碳酸酯 &amp;frac14;&amp;rdquo; x &amp;frac14;&amp;rdquo; 直连器</td></tr><tr><td>带鲁尔锁的鱼骨型接头</td><td>Qosina</td><td>73316</td><td>材料：聚碳酸酯 &amp;frac14;&amp;rdquo; x &amp;frac14;&amp;rdquo; 带鲁尔锁的直型接头</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>赛默飞世尔科技化学品</td><td>AAJ6465522</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>氯化钙，CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>赛默飞世尔科技化学品</td><td>AA89866-30</td><td>无水的， &amp;ge;96.0% ACS</td></tr><tr><td>解剖显微镜（推荐）</td><td>Olympus</td><td>https://www.olympus-lifescience.com/zh/技术/博物馆/显微镜/1984/</td><td>奥林巴斯 SZH10（连续变倍放大倍数 7x - 70x）或类似型号</td></tr><tr><td>不含钙和镁的DPBS</td><td>Gibco</td><td>14200075</td><td>杜氏磷酸盐缓冲液，不含钙、镁，10倍浓缩液（使用前需稀释至1倍浓度）</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>优质生物材料</td><td>351-027-721EA</td><td>0.5 M，pH 7.0&amp;ndash;8.0（乙二胺四乙酸）</td></tr><tr><td>内窥镜/孔探仪/耳镜相机（可选）</td><td>Bebird</td><td>https://bebird.com/products/earsight-pro-耳垢清除器</td><td>3&amp;ndash;4 mm 探头直径</td></tr><tr><td>酶活性粉状洗涤剂</td><td>Alconox</td><td>1304-1</td><td>Alconox Tergazyme，使用1%溶液。</td></tr><tr><td>延伸线，30&quot;</td><td>Qosina&amp;nbsp;</td><td>36218</td><td>30&quot; 长度，&amp;nbsp; 雌性鲁尔锁扣接头转雄性鲁尔锁扣接头</td></tr><tr><td>延伸线，6&quot;</td><td>Qosina&amp;nbsp;</td><td>36212</td><td>6&quot; 长度&amp;nbsp; 雌性鲁尔锁扣接头转雄性鲁尔锁扣接头</td></tr><tr><td>雌性鲁尔锁，带倒刺</td><td>Qosina</td><td>11548</td><td>适配1/8英寸内径管路；材质：聚碳酸酯；</td></tr><tr><td>流量计</td><td>Transonic</td><td>https://www.transonic.com/t402-t403-consoles</td><td>Transonic TS410 模块</td></tr><tr><td>止血钳</td><td>Fisherbrand</td><td>13-820-004</td><td>尖端长度至少为5 cm的锁扣式止血钳</td></tr><tr><td>肝素钠</td><td>麦克森包装服务</td><td>949513</td><td>1000 U/mL 浓度</td></tr><tr><td>霍夫曼钳</td><td>洪堡</td><td>H8720</td><td>细螺纹夹</td></tr><tr><td>IV袋（合规性血袋）</td><td>Qosina</td><td>51494</td><td>材料：PVC，2 个管路接口，0.258&amp;rdquo; ID。使用热封器对100 ml袋进行改造</td></tr><tr><td>无尘擦拭布</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>34120</td><td>Kimtech Science 擦拭巾</td></tr><tr><td>磁力搅拌器</td><td>INTLLAB</td><td>MS-500</td><td>或类似情况</td></tr><tr><td>雄性鲁尔锁，带倒刺</td><td>Qosina</td><td>11549</td><td>适配1/8英寸内径管路；材质：聚碳酸酯；</td></tr><tr><td>数字压力计</td><td>Sper Scientific</td><td>840081</td><td>SPER-840081 或类似物</td></tr><tr><td>尼龙过滤网</td><td>McMaster-Carr</td><td>9318T21</td><td>100-&amp;mu;米（0.0039&quot;开口尺寸</td></tr><tr><td>绵羊血液</td><td>Lampire</td><td>7209004</td><td>经ACD 14:86抗凝的供体全血，隔夜运送</td></tr><tr><td>塑料袋热封机</td><td>Uline</td><td>H-190</td><td>Uline H-190 或类似型号（不带切割器）</td></tr><tr><td>硅橡胶粘合剂</td><td>Smooth-On&amp;nbsp;</td><td>B00IRC1YI0</td><td>Sil-Poxy 或类似产品</td></tr><tr><td>1 mL 带鲁尔锁接头的注射器</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-646</td><td>Fisherbrand 手动注射器（无针头），用于科研用途</td></tr><tr><td>带鲁尔锁的注射器，3 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-457</td><td>Fisherbrand 手动无针注射器，用于科研用途</td></tr><tr><td>带鲁尔锁的注射器，60 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-461</td><td>Fisherbrand 手动无针注射器，用于科研用途</td></tr><tr><td>输血滤器</td><td>Haemonetics Corporation&amp;nbsp;</td><td>SQ40S/SQ40NS</td><td>Haemonetics Corporation SQ40S Pall 血液输注过滤器</td></tr><tr><td>TRIS缓冲盐水</td><td>赛默飞世尔科技化学品</td><td>AAJ62938K2</td><td>TBS 10倍浓缩液（使用前须稀释至1×），pH 7.4</td></tr><tr><td>导管</td><td>Tygon</td><td>ADF00017</td><td>Tygon ND-100-65 管道（医用级）</td></tr><tr><td>超声波流量传感器</td><td>Transonic</td><td>https://www.transonic.com/hqxl-flowsensors</td><td>根据所用导管尺寸选择合适的流量传感器型号。ME6PXL 夹持式传感器适用于 3/8&amp;rdquo; OD 管。传感器由 Transonic 针对测试流体（例如，血液）进行校准&amp;nbsp; 24℃和管路等级（例如 Tygon ND-100-65）</td></tr><tr><td>超声波破碎仪（可选）</td><td>Branson Ultrasonics</td><td>CPX952238R</td><td>Branson CPX2800H 或类似型号</td></tr><tr><td>VAD 系统</td><td>PediaFlow</td><td>PF5</td><td>待测试的VAD系统；包括泵和控制器</td></tr><tr><td>全血凝血系统</td><td>沃芬</td><td>https://www.werfen.com/na/zh/即时检测设备/ACT-机器-hemochron-signature-elite</td><td>Hemochron Signature Elite 或 Signature Jr</td></tr></tbody></table>

体外心室辅助装置血栓形成测试

In Vitro Thrombosis Test for Ventricular Assist Devices

血栓形成的风险在心室辅助装置（VAD）的研发和临床应用中仍然是一个重大问题。传统的VAD血栓形成性评估主要依赖动物实验，这类方法成本高、耗时长，存在伦理问题，且最终可能无法准确反映人类的临床结果。为克服这些局限性，我们开发了一种强化的 体外 旨在诱发血栓形成并识别血流路径中潜在高风险区域的检测方案。该方案受Maruyama等人研究工作的启发，采用改良的抗凝策略，并利用易于获取的组件，使其适用于大多数开展相关研究的实验室 体外 通过VAD的血液检测，我们通过迭代测试和优化一种微型磁悬浮小儿心室辅助装置（PediaFlow PF5）验证了该方法的实用性。该方法已有效识别出早期VAD原型因设计和制造缺陷导致的血栓形成热点区域，从而在进入动物实验前实现针对性改进。尽管存在缺乏脉动血流以及供体血液特性影响等局限性，该方案仍可作为VAD早期研发阶段的风险评估与控制的实用工具。

成功实施本方案可识别出血小板沉积的局部区域，揭示泵体流路中的问题部位。持续应用该方案可通过解决这些已识别的“热点”问题，实现逐步改进。
例如，在开发 PediaFlow PF5 VAD 的过程中，由于部件尺寸微小，我们在手动抛光定子叶片压力面时遇到了挑战。体外血栓形成试验凸显了这一问题，因为血小板沉积始终出现在叶片根部，如图2A所示。随后在一项急性动物实验中也证实了类似的沉积模式，该实验将泵体外连接至绵羊循环系统并运行3小时（本论文未详细描述）。为解决此问题，我们采用电化学抛光技术，使这些钛合金部件表面达到镜面光洁度，从而成功消除了这些区域的血栓形成（图2B）。该泵随后被用于绵羊的为期7天的体内研究，结果同样显示无血栓形成。 
我们在泵的原型中发现的另一个问题特征是前部和后部壳体组件之间的连接处。该连接处若对接不严密，可能形成缝隙，导致血液渗入并发生凝固，正如在 <stro...

我们提供一种在循环测试平台上于心室辅助装置（VAD）中诱导血栓形成的台式实验方案。该方法可用于识别血流路径中的血栓高发区域，有助于在开展动物模型的临床前测试之前提升装置的抗血栓性能。

血栓形成的风险在心室辅助装置（VADs）的研发和临床应用中仍然是一个重大问题。传统的评估方法……

我们的目标是开发一种实用且易于操作的台式实验方案，用于识别心室辅助装置中潜在的血栓形成热点，从而弥合早期原型设计与动物实验之间的关键空白。目前，动物实验仍是评估心室辅助装置血栓形成风险的主要方法。尽管计算流体动力学已成为设计验证中不可或缺的工具，但尚无法完全替代体外和体内验证。血液凝固过程具有复杂的特性，且存在多种混杂因素，使得难以区分实际的装置致血栓性与实验假象。目前，用于评估心室辅助装置（VAD）血栓形成的研究方法在体外仍未能得到充分利用，且至今尚无标准化的方法。通过提供一套全面的实验方案及视频指南，我们希望促进台式实验方法的更广泛应用。该方法解决了医疗器械开发中的技术与伦理挑战，减少了对动物实验的依赖，同时提高了在开发早期检测血栓风险的能力。首先，用150毫升血液填充测试回路，彻底排除回路中残留的所有空气。若使用轴流式血泵，将其旋转至垂直位置，利用浮力释放空气。若使用离心泵，则将其倒置并旋转，确保次级流道中无空气滞留。轻敲管路和储液器表面，并挤压任何气泡以将其排出。仔细检查管路的水平段以及管路与连接器之间的接头，确保无气泡存在。挤压静脉输液袋，使液面接近上方狭窄部位。然后用止血钳夹闭输液管路，以消除液体与空气的界面，并关闭通气孔旋塞阀。接下来，关闭压力管路末端的旋塞。取下压力计管路，连接一个3毫升的注射器。打开旋塞，将1至2毫升液体抽入延长管中，长度约为4厘米。关闭旋塞，取下注射器，重新连接压力计管路。打开旋塞以进行压力读数。最后，使用注射器对采样口进行预冲洗。接下来，将一片无尘擦拭布剪成或撕成三个相等的碎片。将其中一个碎片的一角拧成尖端，插入进样口以吸收残留血液。再将第二个碎片拧成尖端。用生理盐水润湿，并将湿润的尖端插入端口以清除所有残留血液。使用第三块碎片吸收端口内任何残留的生理盐水。现在以低速启动心室辅助装置（VAD），并运行约五秒钟，以排出泵内任何滞留的气泡。停止泵。如果袋中出现任何气泡，需重复进行除气操作。以低速重新启动泵，以使血液在回路中循环。将1毫升肝素钠、2毫升配制好的氯化钙溶液和1.5毫升EDTA分别转移至不同的试管中。将肝素加入循环血液时，用微量移液器吸取75单位肝素，同时将移液器中的液体排出并拉动三毫升注射器的活塞，将肝素注入该注射器中，注意避免洒出。使用三通旋塞阀的横向端口，通过注射器将物质注入循环管路中。旋转止血阀上的公端接头锁，使注射端口朝上，以便将气泡截留在顶部。然后将注射器通过接头锁连接到注射端口，确保端口朝上，注射器垂直向下。拉动注射器活塞，使血液进入注射器，同时在抽吸过程中将任何空气吸入注射器内，并使肝素与血液充分混合。让气泡上升至注射器顶部。然后将混合物注入环路中，确保无空气进入。将血液在注射器内来回推送四到五次，以确保肝素化血液不会局限于端口内的空间。为了滴定环路中血液的活化凝血时间（ACT），首先将750微升的1摩尔氯化钙溶液加入环路中的150毫升血液中。为防止血液凝固，在去除残留空气后应迅速注入液体。或者，可在注射器中用1毫升三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水稀释氯化钙，以减少过早凝固的发生。在注入的氯化钙循环至少两分钟后，将一个1毫升注射器连接到采样口。抽取并弃去0.5毫升废血，以清除采样口内的滞留血液。接着，将一个新的1毫升注射器连接到采样口，抽取0.5毫升血液用于分析。使用床旁全血凝固系统测量活化凝血时间。使用无绒布清洁采样口，操作方法同前。参考滴定值以确定目标氯化钙浓度。逐步增加钙离子浓度，直至达到激活凝血时间（ACT）为300秒。当环路中的ACT达到300秒时，开始体外血栓形成试验。通过调节转子转速并使用Hoffman夹调节阻力，将泵调整至目标流速和压力。通过从回路中抽取血样，并将一滴血液放入ACT仪中，每15分钟测量一次ACT，操作方法如前所述。如果ACT值降至200秒以下，向回路中追加注射25单位的肝素钠。一小时后，向回路中注射1.5毫升0.5摩尔的EDTA，以抑制进一步凝血。让EDTA循环混合两分钟，然后停止泵。使用止血钳夹住连接泵入口和出口的管路，将夹子置于距离入口和出口接头3至4厘米的位置。小心断开管路，以卸下泵。然后将泵和流动回路中的血液排入容器中。最后用移液管吸取生理盐水通过泵的入口和出口，以冲洗残留的血液。在泵的原型中，血小板沉积 consistently 出现在叶片根部区域。对钛合金部件进行电化学抛光后，这些区域的血栓形成被消除。该原型在前后壳体组件的连接处存在贴合不完全的问题，导致出现缝隙，血液渗入并在其中凝结。通过研磨和抛光改进了组件之间的配合，减少了血栓的形成。操作错误以及循环管路排气不完全可能引入伪影。在此情况下，注射氯化钙时发生实验操作失误，导致局部凝血，形成的血栓进入离心式磁悬浮泵，堵塞了流道。在表面观察到的球形、附着松散的凝块通常是气泡被包裹在血栓内部所致。循环回路中的异物和碎屑也被包裹在血栓中，并黏附于泵表面。管路连接处形成的环状血栓提示试验期间活化凝血时间（ACT）处于理想范围。

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科研

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Bioengineering

生物工程

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