Name: 使用 CRISPR-Cas9 对埃及黄热病蚊子进行基因组编辑 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-21T13:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: 了解使用CRISPR-Cas9技术对埃及伊蚊进行基因组编辑的方法，建立基因敲除和敲入品系，实现基因表达的时空控制。该技术有助于研究基因功能并开发病媒控制新策略。

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作者感谢Judy Ishikawa和Ava Stevenson在蚊虫饲养方面提供的帮助。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目（R01AI151004、RO1AI148300、RO1AI175152）支持，上述项目授予O.S.A.；此外，N.H.R. 获得K22AI166268资助。图示使用&#160;BioRender绘制。

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O.S.A. 是 Agragene, Inc. 和 Synvect, Inc. 的创始人，持有股权利益。此安排的条款已根据加州大学圣地亚哥分校的利益冲突政策进行审查并获得批准。其余作者声明不存在竞争利益。

CRISPR-Cas 技术通过促进染色体上特定位点的靶向改变，彻底改变了基因组编辑的格局1。尽管转座元件在首批转基因蚊子的构建中发挥了关键作用，但其插入位点具有一定的随机性，且由于基因组位置效应（即插入位点）的影响，所携带构建体（启动子 + 基因）的表达模式可能与目标基因的实际表达谱不一致，通常会导致异位表达21。在 CRISPR-Cas9 分子剪刀技术出现之前，已有技术通过特定蛋白结构域与 FokI 限制性内切酶融合，利用这些结构域的 DNA 结合特性，在特定位点诱导 DNA 双链断裂，例如 TALEN22 和锌指核酸酶（Zinc Finger）23。尽管后者已成功应用于蚊子的遗传改造24,25，但由于设计此类结构域成本高昂，且存在脱靶切割的风险，这类技术已逐渐被淘汰。自此以后，CRISPR-Cas9 技术已成为首选的分子剪刀工具...

随着CRISPR-Cas分子剪刀技术的建立，精确的基因组编辑已变得不仅可行，而且更为简便1。这些技术利用了原核生物免疫系统用于抵御噬菌体感染的一种机制2。在这些系统中，成簇规律间隔的短回文重复序列（CRISPR）与Cas9核酸酶通常依赖于20个碱基对长度的RNA，即向导RNA（gRNA），其序列与靶向DNA同源，并紧随一个NGG型原间隔序列邻近基序（PAM）序列3。gRNA与Cas9结合后，可将核酸酶精确引导至基因组中的特定靶位点，从而引发DNA双链断裂3。
DNA双链断裂会诱导修复机制来修补双螺旋结构4。尽管所有DNA修复通常都应精确进行，但也存在一些准确性较低的DNA修复机制，可能留下序列疤痕，进而导致功能缺失突变4。在这些易错的DNA修复机制中，非同源末端连接（Non-Homologous End-Joining, NHEJ）可引起移码突变，包括小片段缺失、插入以及核苷酸改变（SNPs），从而导致功能缺失突变。而同源定向修复（Homology Directed Repair, HDR）机制则依赖同源染色体作为模板，复制未受损等位基因的精确序列，实现对靶向DNA序列的完美修复4。
基于这一原理，CRISPR-Cas9 技术已被开发用于精确编辑基因组，理论上可在任何包含 PAM 位点的序列上进行编辑3。在蚊子中，通过向胚胎显微注射 Cas9 与 gRNA 的混合物，利用非同源末端连接（NHEJ）修复机制，CRISPR-Cas9 技术已被用于敲除多种基因5,6。类似地，将 gRNA 与 Cas9 的混合物注射到成年雌蚊的血淋巴中，也可实现生殖系突变7。该技术被称为 ReMOT 控制（ReMOT Control），其依赖于一种经过改造的 Cas9 蛋白，该蛋白被添加了一段肽标签，可在卵黄发生（vitellogenesis）过程中通过内吞作用被卵巢摄取7。将特定基因表达盒插入基因组的操作仅能通过胚胎显微注射实现，即共注射 gRNA 与 Cas9（或表达这些分子的质粒）以及携带目标 DNA 表达盒的质粒8。利用同源定向修复（HDR）机制，将含有目标 DNA 表达盒的质粒作为修复模板，该表达盒两侧带有同源序列（上游和下游各 500–1,000 bp）9,10，用于修复双链断裂，并将 DNA 表达盒一并复制到目标序列中9。
CRISPR-Cas9 技术已被用于敲除蚊子中主要参与感觉系统的多个基因 埃及伊蚊11，还包含与雄性生育力和雌性存活率相关的基因（PgSIT），用于种群控制12通过将编码荧光标记物的基因敲入特定基因的编码序列，也已实现对目标基因的敲除。13,14该策略的优势不仅在于能够诱导移码突变，还可利用荧光信号对新敲除品系的个体进行分选。13,14。该 埃及伊蚊 基因组还使用了二元表达系统（如 Q 系统（QF-QUAS））的序列进行编辑11将编码QF转录激活因子的基因敲入特定基因启动子的下游，可确保该转录激活因子具有明确的时空表达模式15,16一旦表达QF的蚊子品系与另一个含有QF结合位点（QUAS）的蚊子品系杂交，QF便会结合到QUAS序列上，并启动位于QUAS序列下游的基因表达。15,16该系统总体上可实现效应基因在特定组织和特定时间的表达，这些效应基因可以是用于细胞定位或神经元活性检测的荧光标记，也可以是用于在特定组织中敲除基因的Cas9核酸酶（即体细胞敲除）。11. 
鉴于目前已有大量关于埃及伊蚊（A. aegypti）遗传转化的信息，本文提供了一套详细的实验方案，逐步指导如何通过胚胎显微注射利用CRISPR-Cas9系统进行基因组编辑。文中讨论了通过非同源末端连接（NHEJ）介导的移码突变和缺失实现基因敲除，以及通过同源定向修复（HDR）介导的基因盒插入构建基因敲入品系的策略。

<table><tbody><tr><td>10x Cas9 反应缓冲液</td><td>PNA Bio&amp;nbsp;</td><td>CB01</td><td></td></tr><tr><td>Benchling 软件</td><td>Benchling</td><td>N/A</td><td>www.benchling.com</td></tr><tr><td>Cas9 稀释缓冲液</td><td>PNA Bio&amp;nbsp;</td><td>CB03</td><td></td></tr><tr><td>Cas9 蛋白</td><td>PNA Bio&amp;nbsp;</td><td>CP01-50</td><td></td></tr><tr><td>DH5&amp;alpha; E. coli 感受态细胞</td><td>New England Biolabs</td><td>C2987</td><td></td></tr><tr><td>双面胶带</td><td>Scotch Permanent</td><td>3136</td><td></td></tr><tr><td>果蝇培养管</td><td>Genesee Scientific&amp;nbsp;</td><td>32-109</td><td></td></tr><tr><td>滤纸&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare Life Science&amp;nbsp;</td><td>1450-042</td><td></td></tr><tr><td>鱼食&amp;nbsp;</td><td>Tetra</td><td>B00025Z6YI</td><td>金鱼薄片饲料&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>果蝇培养瓶</td><td>Genesee Scientific&amp;nbsp;</td><td>AS273</td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>Leica Microsystems&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;M165 FC</td><td></td></tr><tr><td>基因片段</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>gRNA</td><td>Synthego</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>卤代烃油 700&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8898</td><td></td></tr><tr><td>显微注射显微镜</td><td>Leica Microsystems&amp;nbsp;</td><td>DM2000</td><td></td></tr><tr><td>JM109 &amp;nbsp;E. coli 感受态细胞&amp;nbsp;</td><td>Zymo Research</td><td>T3005</td><td></td></tr><tr><td>显微注射仪</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>FemtoJet 4x&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>填充 Femtotips 用 Microloader 吸头&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>E5242956003</td><td></td></tr><tr><td>显微操作器&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>TransferMan 4r&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>微量移液器拉制仪&amp;nbsp;</td><td>Sutter Instrument&amp;nbsp;</td><td>P-2000</td><td></td></tr><tr><td>显微镜盖玻片&amp;nbsp;</td><td>Fisherbrand&amp;nbsp;</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片&amp;nbsp;</td><td>Eisco</td><td>12-550-A3</td><td></td></tr><tr><td>小鼠血液（用于喂食的活体小鼠）</td><td>加州大学</td><td>IACUC，动物使用方案 #S17187</td><td>用于蚊虫血液喂养；详细信息符合动物伦理协议</td></tr><tr><td>NEB Q5 高保真 DNA 聚合酶&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0491S</td><td></td></tr><tr><td>PCR 纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td></td></tr><tr><td>质粒小提试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Zymo Research</td><td>D4036</td><td></td></tr><tr><td>石英丝&amp;nbsp;</td><td>Sutter Instruments</td><td>QF100-70-10</td><td></td></tr><tr><td>体外转录纯化试剂盒</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM1908</td><td></td></tr><tr><td>超纯水&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>10977-023</td><td></td></tr></tbody></table>

利用 crispr-cas9 对埃及伊蚊 aedes aegypti 进行基因组编辑

Genome Editing in the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti using CRISPR-Cas9

成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）-Cas9 技术的出现彻底改变了基因工程领域，为包括非模式生物在内的多种物种实现精确基因组编辑打开了大门。在埃及伊蚊（Aedes aegypti）中，已利用该技术成功实现了基因功能缺失突变和 DNA 插入。本文详细描述了一种利用 CRISPR-Cas9 技术在埃及伊蚊（A. aegypti）中通过胚胎显微注射进行基因组编辑的实验方案，重点聚焦于基因敲除和基因敲入品系的建立。在本方案中，石英玻璃针头被注入包含向导 RNA、重组 Cas9 蛋白以及一段编码荧光标记基因的 DNA 片段的质粒（如需实现基因敲入）的混合物。将处于囊胚前阶段的胚胎排列在载玻片上双面胶带的一条带上，随后将盖玻片固定于载玻片上。借助显微注射仪，将针头轻柔地插入胚胎后端，并注入少量 CRISPR 混合物。胚胎孵化后，幼虫在荧光显微镜下进行检测，蛹期个体按性别分选并置于不同饲养笼中。成虫羽化后，将其与野生型个体进行正反交配，饲血后用于产卵。待所产卵孵化后，收集到的荧光阳性幼虫即为 DNA 片段稳定整合至基因组中的个体。这些幼虫继续培养至成虫阶段，再次与野生型个体杂交，并通过分子生物学技术进一步验证 DNA 片段是否精确插入蚊子基因组的预期位点。通过所提供的杂交策略和分子筛选流程，还可获得纯合品系。

gRNA介导的HDR同源重组基因靶向设计与验证 
为确保准确靶向目标基因，我们建议选择若干gRNA，并将5'和3'同源臂定位在HDR介导的同源重组切割位点附近（图1A）。例如，我们设计了两个gRNA，分别靶向目的基因起始密码子的两侧，并使用QF2-Hsp70-OpIE2-ECFP-SV40片段作为标记，通过HDR机制利用1 kb的同源臂将其插入目标基因中（图1B）。双链断裂将导致gRNA切割位点之间的短DNA片段被删除（图1A）。
通过检测gRNAs对目标基因的切割效率及其切割能力来验证 体外 Cas9 切割实验。来自靶基因的 PCR 片段被装载了 gRNA 的 Cas9 切割成两个片段（<strong class="...

本文介绍了一种利用CRISPR-Cas9技术通过胚胎显微注射对蚊子A. aegypti进行基因组编辑的详细实验方案。

利用 CRISPR-Cas9 对埃及伊蚊 Aedes aegypti 进行基因组编辑

成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）-Cas9 技术的出现彻底改变了基因工程领域……

我们的研究范围包括利用CRISPR-Cas9技术建立基因修饰的蚊子品系。该技术用于蚊子种群压制（PgSIT），以及建立用于基因表达时空控制的双元表达系统。我们已利用 CRISPR-Cas9 技术获得了基因敲除和基因敲入品系。我们的基因敲入品系包括插入 QF 转录激活因子，该因子可实现对下游基因（如荧光标记物 GFP）的时空特异性调控，用于组织特异性标记以及神经元活动报告分子 G-CaMP6 的表达。建立新的蚊子突变品系将有助于更深入地理解基因功能及其对神经、生理和行为的影响，这可能为预防蚊媒疾病传播提供新的方法。本实验室已开发出依赖CRISPR-Cas9技术的蚊子种群抑制技术，通过敲除与雄性生育力和雌性存活能力相关的基因实现控制。此外，我们还建立了多个蚊子品系，用于研究蚊子的感觉抗性，特别是嗅觉和视觉。[采访者] 为了制备用于基因敲除突变体的注射构建体，使用Cas9稀释缓冲液将Cas9蛋白稀释至所需浓度。然后用超纯水稀释体外合成的向导RNA（gRNA）分装样品。将稀释后的Cas9蛋白与每种gRNA预先混合，形成核糖核蛋白复合物。随后将多个预混合的核糖核蛋白复合物溶液合并。对于同源定向修复介导的基因盒插入，需稀释并混合Cas9蛋白和gRNAs。用超纯水稀释供体质粒，并将所有构建体混合。接下来，使用石英细丝制备显微注射针，采用以下程序，用激光微电极拉制仪拉制针尖。设置手动吸液装置后，润湿白色圆片滤纸，并将其放置在收集器内壁或内部湿润棉絮的上方。将5至10只5至10天前吸过血的雌蚊放入收集器中。然后将收集器置于黑暗环境中45分钟。之后，将蚊子从收集器中取出。孵育结束后，移除滤纸以收集胚胎。从收集纸上挑选处于前囊胚期、呈浅灰色的胚胎。用湿润的刷子将选中的胚胎转移至盖玻片上预先贴好的双面胶带上。将胚胎平行排列，确保它们并排且所有后端朝前，同时保持周围湿润。在排列过程中，向胚胎上滴加Haloalkane Oil 700（卤代烃油700）以防止干燥。在显微注射仪上，设置补偿压力为300百帕，注射压力为500百帕。使用微量加样器，将3 µL注射构建体装入注射针中。将带有排列整齐胚胎的盖玻片放置在载玻片上，并置于显微镜下进行注射。接下来，使用显微操作器将注射针固定在持针器上，使其与胚胎后端呈10度角。通过轻轻触碰针尖至盖玻片边缘的方式轻柔打开针尖。然后向胚胎中注射质粒构建体。在向埃及伊蚊（Aedes aegypti）注射构建体后，使用无尘一次性擦拭纸清除胚胎周围的油。加入去离子水冲洗胚胎。将冲洗后的胚胎转移至湿润的滤纸上，并将滤纸放置在Karat九盎司杯内湿润的纸巾上。然后在杯底放置湿润棉絮以保持湿度。在保持胚胎湿润3至4天后，将带有胚胎的滤纸转移至Sterilite六夸脱盘中约3升的去离子水中以促进孵化。一旦G0代幼虫孵化，向盘中加入与水混合的鱼食。在三龄至四龄幼虫阶段，对G0代幼虫进行荧光标记筛选。根据荧光状态将幼虫分开。将荧光阳性与荧光阴性幼虫分别饲养在不同的盘中。当幼虫化蛹后，按性别分离蚊子：通过较小的体型、更明显且尖锐的生殖节叶以及更宽的尾鳍来鉴定雄性；通过较大的体型、较不明显的生殖节叶以及较窄的尾鳍来鉴定雌性。在将每种性别的荧光阳性或荧光阴性蚊子分别汇集后，将每一组与野生型利物浦株埃及伊蚊（A. aegypti）中相反性别的个体进行杂交，杂交比例为每一只经荧光筛选的个体对应3至5只野生型个体，并允许其交配4天。在3至4天后，在三龄至四龄幼虫阶段对G1代幼虫进行荧光标记筛选。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

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利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建人类疟原虫P. falciparum的条件性突变体

高效位点特异性突变的胚胎显微注射技术 致倦库蚊

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使用 CRISPR/Cas9 技术制备并注射 Culex 蚊胚胎以产生无效突变

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定点 φC31介导的整合与盒式交换 按蚊属 疟疾的传播媒介

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东方果实蝇 Bactrocera dorsalis 的 CRISPR/Cas9 诱变实验方案

本实验方案描述了如何测量埃及伊蚊（Aedes...

量化转基因中的适合度代价 埃及伊蚊 蚊子

了解使用CRISPR-Cas9技术对埃及伊蚊进行基因组编辑的方法，建立基因敲除和敲入品系，实现基因表达的时空控制。该技术有助于研究基因功能并开发病媒控制新策略。

利用 CRISPR-Cas9 对埃及伊蚊 Aedes aegypti 进行基因组编辑

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