使用 CRISPR-Cas9 对埃及黄热病蚊子进行基因组编辑

在这里，我们 描述了使用 CRISPR-Cas9 技术通过对埃及蚊子进行胚胎显微注射进行基因组编辑的详细方案。

我们的研究范围涉及使用 CRISPR-Cas9 技术建立转基因蚊子系。利用CRISPR-Cas9技术抑制蚊子种群PgSIT，建立基因表达的时空控制二元表达体系。

我们已经使用 CRISPR-Cas9 技术获得了敲除和敲入系。我们的敲入系包括插入 QF 反式激活因子，允许对下游基因进行空间时间控制，例如荧光标记物 GFP，用于组织特异性标记和神经元活动的报告基因 G-CaMP6。

新型蚊子突变系的建立将有助于更深入地了解基因功能和神经、生理和行为影响。这可能会导致开发预防蚊媒疾病传播的新方法。我们的实验室开发了蚊子种群抑制技术，该技术依靠 CRISPR-Cas9 技术敲除与男性生育能力和女性活力相关的基因。此外，我们还建立了多个蚊子线，用于研究蚊子的感官抗性，特别是嗅觉和视觉。

[采访者]要制备用于敲除突变体的注射构建体，请使用 Cas9 稀释缓冲液将 Cas9 蛋白稀释至所需浓度。然后用超纯水稀释体外合成的引导RNA或gRNA的等分试样。将稀释的Cas9蛋白与每个gRNA预混合，形成核糖核蛋白复合物。然后将多种预混合的核糖核蛋白复合物溶液混合。对于同源定向修复介导的基因盒插入，稀释并混合 Cas9 蛋白和 gRNA。用超纯水稀释供体质粒并混合所有构建体。接下来，使用石英丝准备显微注射针。使用以下程序。用激光微量移液器拉拔针头。设置手动吸气器后，润湿白色圆形滤纸，然后将它们放在内壁上或收集器内的湿棉布上。将 5 到 10 只五到十天前用血液喂养的雌性蚊子放入收集器中。然后将收集器置于黑暗中 45 分钟。然后，将蚊子从收集器中取出。孵育后，取出滤纸以收获胚胎。从收获纸中选择浅灰色的胚前胚层阶段胚胎。用湿刷将选定的胚胎转移到放置在盖玻片顶部的双面胶带上。将胚胎平行对齐，确保它们并排，所有后端都朝前，同时周围保持湿润。在对齐过程中，将卤化碳油 700 添加到胚胎上以防止干燥。在显微注射器上，设置 300 百帕斯卡的补偿压力和 500 百帕斯卡的注射压力。使用微型装载器，将三微升注射构建体加载到针头中。将胚胎对齐的盖玻片放在显微镜载玻片上，并将其放置在显微镜下进行注射。接下来，用微型机械手将针头以 10 度角朝向胚胎后端固定到持针器中。将针头的尖端轻轻接触盖玻片的边缘，轻轻打开针头。然后用质粒构建体注射胚胎。用注射构建体注射伊蚊后，使用无绒一次性湿巾去除胚胎周围的油脂。加入去离子水冲洗胚胎。将冲洗过的胚胎转移到湿滤纸上，然后将滤纸放在 9 克拉杯内的湿纸巾上。然后将湿棉花放在杯子底部以保持水分。保持胚胎湿润三到四天后，将装有胚胎的滤纸转移到Sterilite 6夸脱锅中的约3升去离子水中进行孵化。一旦 G 零幼虫孵化，将鱼食与水混合到锅中。在三龄至四龄幼虫阶段筛选G零幼虫的荧光标记。根据幼虫的荧光状态分离幼虫。将荧光阳性和荧光阴性幼虫维持在单独的平底锅中。当注射的蚊子化蛹时，按性别区分它们，并通过它们较小的体型、更突出和尖的生殖叶以及更宽的桨来识别雄性。通过较大的体型、不太明显的生殖叶和较窄的桨来识别雌性。在汇集每种性别的荧光阳性或荧光阴性蚊子后，每个池中与来自野生型利物浦 A. agyptie 菌株的异性蚊子杂交，每个荧光筛选个体的比例为三到五个野生型个体，让它们交配四天。三到四天后，筛选G1幼虫在第三至四龄幼虫阶段的荧光标记物。