Name: 酿酒酵母 阿尔茨海默病模型筛选通过 γ-分泌酶影响淀粉样蛋白 β 生成的基因、突变和化学物质 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-24T12:50:00.000+00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: 了解如何在酿酒酵母中重建γ-分泌酶以研究家族性阿尔茨海默病突变对其活性的影响，并筛选能够恢复酶功能、降低致病性Abeta 42水平的抑制突变和化学调节剂。

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本研究由日本学术振兴会（JSPS）科研费补助金（编号 22K06121）资助。作者谨向东北大学酶学实验室的各位成员致以感谢。

1. 利用酵母报告系统检测γ-分泌酶活性
<ol>
	<li>使用标准的醋酸锂法将质粒（表1）转化至酵母PJ-69-4A菌株（表2），以表达γ-分泌酶及其底物14。为重建切割反应，需共转化三个质粒：两个用于表达γ-分泌酶，一个用于表达底物。在缺乏亮氨酸、色氨酸和尿嘧啶的SC琼脂培养基（SC-LWU）上筛选转化子。</li>
	<li>为通过生长情况评估底物切割效果，将酵母菌株划线接种于同时缺乏组氨酸和腺嘌呤的SC-LWU培养基（SC-LWHUAde）上，并在30 °C下培养3天。</li>
	<li>通过菌落大小评估HIS3和ADE2的表达水平。菌落大小评估标准如下：+++ 表示野生型生长，菌落直径大于1 mm；- 表示无生长；++ 或 + 分别表示部分生长，菌落直径大于0.5 mm或小于0.5 mm。这些基因的表达是γ-分泌酶活性的间接测量指标（图1）。</li>
	<li>通过β-半乳糖苷酶活性（即lacZ的表达水平，图1）评估底物切割情况：在30 °C下于SC-LWU培养基中培养菌株，直至菌液浓度达到1 × 107 个细胞/mL，对应OD600为0.8–1.0。
	<ol>
		<li>取1.5 mL培养液，于1.5 mL离心管中在4 °C下以21,100 × g离心3 min收集细胞，用100 µL冰水洗涤一次，再用含1 mM二硫苏糖醇（DTT）及蛋白酶抑制剂混合液（PIs/water，1000×溶液：1 M对氨基苯甲脒（pABA）、1 mg/mL抑肽酶（antipain）、1 mg/mL抑蛋白酶肽（aprotinin）、1 mg/mL亮抑酶肽（leupeptin））和PIs/DMSO（1000×溶液：1 M苯甲基磺酰氟（PMSF）、0.1 M N-对甲苯磺酰-L-苯丙氨酸氯甲基酮（TPCK）、1 mg/mL抑肽酶（Chymostatin）、1 mg/mL胃蛋白酶抑制剂（Pepstatin））的D缓冲液（20 mM Tris/Cl（pH 8.0）、10 mM MgCl2、50 mM KCl、1 mM EDTA、5%甘油）30 µL重悬细胞。</li>
		<li>加入酸洗玻璃珠至液面以下，将混合物置于冰上，以最大速度涡旋振荡10次，每次1 min，两次之间间隔1 min冰浴。</li>
		<li>在4 °C下以21,100 × g离心裂解液10 min，收集上清液作为粗提裂解物。</li>
		<li>取5–10 µL粗提裂解物与0.4 mL Z缓冲液（40 mM NaH2PO4、60 mM Na2HPO4、10 mM KCl、1 mM MgSO4）混合，加入80 µL 0.4%邻硝基苯-β-D-半乳吡喃糖苷（ONPG）溶液启动反应，37 °C孵育至溶液因生成硝基苯酚而变为淡黄色。</li>
		<li>加入0.2 mL 1 M Na2CO3溶液终止反应，测定420 nm处的吸光度以计算β-半乳糖苷酶活性。</li>
		<li>使用基于考马斯亮蓝法（Bradford法）的蛋白定量试剂盒测定粗提裂解物中的蛋白浓度，以牛血清白蛋白（BSA）作为标准品。将染料母液与去离子双蒸水（DDI水）按1:4稀释制备染料工作液。</li>
		<li>在微孔板孔中混合1–5 µL裂解液或BSA标准品与100 µL稀释后的染料，室温孵育5 min后测定595 nm处的吸光度，根据BSA标准曲线确定蛋白浓度。 
		β-半乳糖苷酶单位 = (1,000 × A420) / (t × c × V) 
		&#8203;其中t为反应时间（min），c为蛋白浓度（mg/mL），V为测定中所用裂解物体积（mL）。一个β-半乳糖苷酶单位定义为每分钟每毫克蛋白催化水解1 µmol ONPG生成o-硝基苯酚和D-半乳糖所需的酶量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为验证γ-分泌酶亚基及底物的表达，在30 °C下于SC-LWU培养基中培养菌株，直至菌液OD600达到0.8–1.0。
	<ol>
		<li>取10 mL培养液，在50 mL离心管中于4 °C下以2,100 × g离心10 min收集细胞，用1 mL冰水洗涤，再转移至1.5 mL离心管中于4 °C下以21,100 × g离心3 min，最后用含1 mM DTT及蛋白酶抑制剂混合液（PIs/water和PIs/DMSO）的B88缓冲液（20 mM Hepes/KOH（pH 6.8）、250 mM山梨醇、150 mM KOAc、5 mM Mg(OAc)2）100 µL重悬细胞。</li>
		<li>加入玻璃珠至液面以下，将混合物置于冰上，以最大速度涡旋振荡10次，每次1 min，两次之间间隔1 min冰浴以裂解细胞。</li>
		<li>在4 °C下以845 × g离心裂解液2 min，收集上清液作为总裂解物，其中包含膜组分。</li>
		<li>取100 µL总裂解物，加入96 mg尿素和40 µL 6× SDS上样缓冲液（0.4 M Tris/Cl（pH 6.8）、12% SDS、0.6 M DTT、0.05%溴酚蓝、50%甘油），65 °C孵育10 min。加入尿素可防止早老素（presenilin）发生聚集。</li>
		<li>通过12.5% Tris/甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样品，并进行免疫印迹分析，检测γ-分泌酶及其底物的表达。</li>
		<li>使用针对早老素、nicastrin、Aph1、Gal4、FLAG、HA或Pgk1（上样对照）的一抗，以及针对小鼠IgG（用于FLAG、HA和Pgk1）、兔IgG（用于早老素、Aph1和Gal4）或豚鼠IgG（用于nicastrin）的辣根过氧化物酶（HRP）标记二抗进行检测。</li>
		<li>进行化学发光检测时，使用前立即混合溶液A（50 mM Tris/Cl（pH 8.5）、1.25 mM鲁米诺、0.02 mM对香豆酸）与溶液B（50 mM Tris/Cl（pH 8.5）、0.009% H2O2）。将印迹膜置于适量混合液中孵育1 min，所需体积依膜大小而定；对于10 cm × 6 cm的膜，使用4 mL。使用化学发光成像仪显影并量化信号强度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Aβ 生成的测定方法 体外 微粒体测定
<ol>
	<li>按照步骤1.1所述方法，将APP C55、APP C99或γ-分泌酶质粒（表1）转化至酵母菌株PJ-69-4A pep4Δ中，以分别表达γ-分泌酶及其底物（表2；γ311、γ312和γ313菌株）14。在SC-U琼脂培养基上筛选C55和C99菌株，在SC-LW琼脂培养基上筛选γ-分泌酶菌株。</li>
	<li>根据标准方案11，从表达APP C55、APP C99或γ-分泌酶的酵母菌株中分离微粒体。通过蔗糖密度梯度离心分离微粒体，并使用一次性塑料移液管从1.2 M–1.5 M蔗糖界面回收。将微粒体溶于0.2% SDS后，测定其在260 nm处的吸光度以确定蛋白浓度。</li>
	<li>制备反应混合物，包含两种微粒体（即含APP C55或γ-分泌酶的微粒体），每种含40 µg蛋白，加入γ缓冲液（50 mM PIPES/KOH (pH 7.0)，250 mM蔗糖，1 mM EGTA），终体积为12.5 µL。加入等体积（12.5 µL）含2% CHAPSO的γ缓冲液混匀，于1% CHAPSO中孵育1小时。</li>
	<li>开始反应时，用含有1×蛋白酶抑制剂（PI）混合物的γ缓冲液将上述混合物稀释四倍至终体积100 µL，使CHAPSO终浓度为0.25%，蛋白终浓度为400 µg/mL。蛋白酶抑制剂混合物组成为：50 µM二异丙基氟磷酸盐（DIFP）、50 µM苯甲基磺酰氟（PMSF）、0.1 µg/mL Nα-对甲苯磺酰-L-赖氨酸氯甲基酮（TLCK）、0.1 µg/mL抑蛋白酶肽、0.1 µg/mL亮抑蛋白酶肽、0.1 mM EGTA、1 mM硫吩、5 mM菲咯啉（PNT）。将反应混合物在37 °C孵育24小时。必要时可添加0.1%磷脂酰胆碱（PC）、10 µM L685,458或DAPT（γ-分泌酶抑制剂）。</li>
	<li>加入500 µL氯仿/甲醇（2:1）终止反应，间歇涡旋振荡，孵育1小时。加入900 µL甲醇，混匀后于21,100 x g离心15分钟，使Aβ肽富集于沉淀中。</li>
	<li>用500 µL氯仿/甲醇/水（1:2:0.8）洗涤沉淀，晾干后悬浮于40 µL SDS上样缓冲液中，煮沸10分钟。通过16.5% Tris/Tricine聚丙烯酰胺凝胶电泳分析Aβ的生成。为区分不同形式的Aβ，可使用含8 M尿素（pH 8.45）的10% Tris/Tricine聚丙烯酰胺凝胶。</li>
	<li>采用特异性识别人Aβ天冬氨酸-1位点的抗体82E1及HRP标记的抗小鼠IgG二抗，通过免疫印迹法检测Aβ。进行化学发光检测时，参照步骤1.5.7的方法，在使用前等量混合溶液A和溶液B，将印迹膜浸入适量该混合液中孵育1分钟。所需体积取决于膜的大小；对于10 cm × 6 cm的膜，使用4 mL。</li>
	<li>显影印迹膜，并使用化学发光图像分析仪对信号强度进行定量。</li>
</ol>
3. 筛选具有调节作用的γ-分泌酶或APP突变
<ol>
	<li>通过易错PCR引入随机突变时，设计引物，使其在每个引物的5'端包含目的基因40 bp的重叠区域。</li>
	<li>在1x Taq缓冲液中配制50 µL的易错PCR反应体系，包含50 ng模板DNA、0.2 mM dGTP、1 mM dATP/dTTP/dCTP、3 mM MgCl2、0.5 mM MnCl2、1.25 U Taq DNA聚合酶和400 nM引物。采用以下PCR程序：94 °C预变性5 min，随后进行30个循环（94 °C变性30 s，55 °C退火30 s，72 °C延伸120 s），最后72 °C延伸10 min。该条件可产生约每千碱基1.9个突变的突变率10。</li>
	<li>将突变后的DNA片段（4 µg）与线性化质粒DNA（4 µg）共转化至含有FAD APP或PS1突变的PJ69-4A酵母菌株中14。引物中的40 bp重叠序列可促进酵母中片段间的同源重组，从而重建完整质粒。在SC-LWU平板上筛选转化子，方法见步骤1.1。</li>
	<li>计数SC-LWU平板上的转化子，并使用尼龙绒布将其复制到SC-LWHUAde平板上。复制时，将转化子平板压在覆盖尼龙绒布的圆柱形木块上，再将新的SC-LWHUAde平板压在绒布上以转移菌落。表达APP或PS1 FAD突变体的菌株在SC-LWHUAde平板上生长较差，而携带调控性突变的菌株则生长旺盛并形成明显菌落。</li>
	<li>为从阳性克隆中回收质粒DNA，将菌株在3 mL SC-LWU培养基中于30 °C过夜培养，直至OD600 &#62;1.0。将细胞在15 mL离心管中于4 °C、2,100 x g离心10 min，用0.8 mL冰水洗涤后转移至1.5 mL离心管中，在4 °C、21,100 x g离心3 min，弃上清后重悬于0.3 mL裂解液（10 mM Tris/Cl (pH 8.0)、100 mM NaCl、1 mM EDTA、2% Triton X-100、1% SDS）中。</li>
	<li>加入0.3 mL苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）和0.3 g玻璃珠以裂解细胞。最大速度涡旋振荡10 min，然后在室温下21,100 x g离心10 min。</li>
	<li>离心后，样品分为上层水相和下层酚相。小心吸取水相，加入30 µL 3 M乙酸钠和700 µL 100%乙醇。避免吸取两相之间的界面物质。</li>
	<li>在4 °C、21,100 x g离心10 min，弃上清后用70%乙醇洗涤沉淀，空气干燥后溶于15 µL TE缓冲液中。</li>
	<li>由于质粒DNA浓度通常较低，难以直接用于后续分析，需在E. coli中扩增。采用高效转化方法将质粒DNA转化至E. coli DH5α菌株15，提取质粒并纯化用于后续分析。通过Sanger测序法确定突变位点16。</li>
	<li>本方法适用于不同方法构建的突变质粒（如步骤3.1和3.2所述）。若需靶向特定蛋白区域，可设计带有随机核苷酸的反向PCR引物。经PCR扩增及连接环化后，获得突变质粒文库。也可使用定点突变试剂盒引入特定突变。</li>
</ol>
4. 在酵母中筛选γ-分泌酶抑制剂（GSI）
<ol>
	<li>采用基于酵母生长或β-半乳糖苷酶检测法开发的GSI高通量化学筛选方法，具体如下所述。</li>
	<li>使用酵母菌株 γ124、γ126 和 γ190 进行 GSI 筛选（表2). 选择能够降低野生型γ-分泌酶在APP（γ124）和/或Notch（γ126）上生长或β-半乳糖苷酶活性的化合物作为GSI候选物（表3).</li>
	<li>选择底物特异性的 APP 保留型或 Notch 保留型 γ-分泌酶抑制剂（GSIs）。通过可溶性 Gal4 表达的反向筛选排除有毒化合物。GSIs 候选物不应影响 Gal4 对照菌株（γ190）的生长或 β-半乳糖苷酶活性。表3).</li>
	<li>生长实验中，在含有潜在GSI的SC-LWHUAde培养基中，于384孔板中培养菌株至OD600 0.03。在30 °C下静置培养过夜。培养24小时后通过OD监测生长情况。600.</li>
	<li>对于384孔板格式的β-半乳糖苷酶检测，将菌株培养至浓度为1 × 107 细胞/mL，置于含潜在GSI的SC-LWU培养基中。使用Beta-Glo检测系统裂解细胞，并利用6-o-β-半乳糖吡喃糖基-荧光素素作为底物，按照制造商的说明书操作。</li>
	<li>对于GSI候选物，通过测量Aβ的产生来评估 体外 微粒体实验以验证抑制作用。</li>
</ol>
在酵母中筛选γ-分泌酶调节剂（GSM）
<ol>
	<li>采用基于酵母生长或β-半乳糖苷酶检测法建立的GSM高通量化学筛选方法，具体步骤如下所述。</li>
	<li>使用酵母菌株γ106、γ112和γ5进行GSM筛选表2）。选择能够增强FAD PS1（γ106和γ112）或FAD APP突变菌株生长或β-半乳糖苷酶活性的化合物作为GSM候选物表4）。通过使用不含γ分泌酶催化亚基的菌株进行反向筛选，排除非特异性的报告基因激活化合物。GSM候选化合物不应影响不含PS1（γ5）的对照菌株的生长或β-半乳糖苷酶活性。表4).</li>
	<li>生长实验中，在含有潜在GSMs的SC-LWHUAde培养基中，于384孔板中培养菌株至OD600 0.03。30 °C下静置培养过夜。培养48小时后通过OD监测生长情况。600.</li>
	<li>对于384孔板格式的β-半乳糖苷酶检测，将菌株培养至浓度为1 × 107 细胞/mL，置于含潜在GSMs的SC-LWU培养基中。使用Beta-Glo检测系统裂解细胞，并利用6-o-β-半乳糖吡喃糖基-荧光素素作为底物，按照制造商的说明书进行操作。</li>
	<li>对于GSM候选物，通过测量Aβ的产生来评估 体外 微粒体检测以确认其调节作用，即减少毒性Aβ形式Aβ42和Aβ43。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

实验方案中的关键步骤与故障排除 
利用遗传学与生物化学方法在酵母中重建 γ-分泌酶相对简便，但有一些关键步骤需确保成功。
在酵母转化过程中（步骤 1.1、2.1 和 3.3），应同时引入多个质粒：两个用于 γ-分泌酶组分，一个用于底物。也可采用依次转化（一次一个质粒）的方法，但较为耗时。需要注意的是，同时引入多个质粒会降低转化效率；转化后可能需要涂布更多的酵母。
在 Aβ 的 SDS-PAGE（步骤 2.6）中，缓冲液的 pH 值（pH 8.45）至关重要。在含有 8 M 尿素的 Tris/Tricine SDS-PAGE 中，C55、Aβ43 和 Aβ42 的迁移距离相似（图 2C，下图）。如果出现某些分离问题，务必检查 pH 值，并在必要时进行调整。CO2 的吸收可能导致缓冲液在储存过程中 pH 值下降。可通过调节使 pH 值更偏碱性（例如 pH 8.55）。
<p class="jove_...

γ-分泌酶负责对超过150种I型跨膜蛋白进行膜内切割，其中包括淀粉样前体蛋白（APP）和Notch1。膜内切割的重要性不仅在于蛋白质的 turnover，还在于通过产生的片段介导信号转导。例如，APP的加工会产生小分子的淀粉样β肽（Aβ）。尽管Aβ应作为降解产物被清除，但在阿尔茨海默病中，它会在脑内积聚并形成老年斑块2。另一方面，Notch的加工对于NOTCH信号通路至关重要3，该通路在发育过程中发挥关键作用。γ-分泌酶由四种跨膜蛋白组成：早老素（PS1或PS2）、Nicastrin（NCT）、前咽部缺陷蛋白1（Aph-1a或1b）以及早老素增强子2（Pen2）4。这些蛋白共含有19个跨膜结构域：PS中有9个，Aph1中有7个，Pen2中有2个，NCT中有1个。PS作为催化亚基，其跨膜结构域TM6和TM7中包含两个天冬氨酸残基5。在复合物成熟过程中，PS在其亲水性环HL6内发生自水解切割，生成氨基末端和羧基末端片段4。家族性阿尔茨海默病（FAD）相关的突变存在于APP和PS基因中2。这些致病性错义突变会负面影响γ-分泌酶活性，降低其有效加工APP的能力，从而导致易于聚集的Aβ42形式增加，而非常见的Aβ406。这些突变干扰切割过程的具体机制尚不明确。γ-分泌酶调节剂（GSMs）能够改变Aβ42与其他Aβ形式的比例，通过降低Aβ42水平，在阿尔茨海默病的治疗中展现出潜在的治疗前景7。
酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae长期以来被用作研究真核细胞关键功能的模式生物，例如细胞分裂、蛋白质转运和自噬。研究人员已利用功能互补方法研究人类同源基因，包括细胞分裂周期&#160;(CDC)、分泌&#160;(SEC)以及自噬相关&#160;(ATG)基因。通过将人类基因转化至酵母突变体中，研究人员能够从功能角度分析细胞过程。在已知的五类膜内蛋白酶中，酵母仅具有其中三类：信号肽酶（Ypf1）、菱形蛋白酶（Pcp1和Rbd2）以及Ras转化酶（Rce1）。然而，酵母中不存在γ-分泌酶或位点2蛋白酶的同源物8，因此互补方法不适用于这些蛋白酶的研究。尽管这些蛋白酶在酵母中没有对应的同源蛋白，S. cerevisiae在研究人类蛋白质方面仍然具有重要价值。诸如酵母单杂交、双杂交和三杂交实验等技术利用酵母转录激活因子Gal4，用于检测DNA、转录因子、蛋白质或RNA之间的相互作用9。我们对Gal4系统进行了改造，以监测由γ-分泌酶介导的膜内蛋白水解过程。
我们通过在酵母中引入人源γ-分泌酶以及与Gal4融合的人工底物，成功重建了γ-分泌酶的切割反应（图1）10。该切割反应通过Gal报告系统进行追踪，可通过监测酵母生长或测定β-半乳糖苷酶活性来实现。此外，我们通过免疫印迹法在酵母微粒体中鉴定出多种释放的Aβ形式（Aβ38、Aβ40、Aβ42、Aβ43和Aβ45）（图1）11。
当将与家族性阿尔茨海默病（FAD）相关的PS1或APP突变体引入该系统时，观察到不同程度的功能丧失活性12。我们开展了一项基于生长的筛选，以鉴定能够恢复这些FAD突变体受损功能的抑制性突变（图2）。这些抑制性突变不仅挽救了功能缺陷，还独立增强了γ-分泌酶的剪切活性。具体而言，它们以类似于降低Aβ42水平的γ-分泌酶调节剂（GSMs）的方式，减少了较长形式Aβ（尤其是Aβ42）的水平。酵母重建系统可用于筛选调控γ-分泌酶活性的突变、基因和化合物，包括γ-分泌酶抑制剂（GSI）和调节剂（GSM）13。
本实验方案旨在实现两个主要目标：i）建立基于酵母的γ-分泌酶筛选系统；ii）提供在酵母中重建人类酶促反应的重组技术示例，强调重组方法的核心原理。我们分三个关键步骤概述该方法，具体包括以下核心环节：1）在酵母中重组γ-分泌酶；2）进行 体外 使用酵母微粒体进行γ-分泌酶活性检测，以及在酵母中筛选γ-分泌酶突变体和化学调节剂。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;抗体&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗淀粉样蛋白&amp;beta;（N）（82E1）抗体</td><td>IBL</td><td>Cat# 10323</td><td></td></tr><tr><td>抗Aph1a，245-265（C末端）抗体</td><td>BioLegend</td><td>Cat# 823101</td><td></td></tr><tr><td>抗FLAG（M2）抗体</td><td>Sigma</td><td>Cat# F3165</td><td></td></tr><tr><td>抗Gal4抗体</td><td>Sigma</td><td>Cat# G9293</td><td></td></tr><tr><td>抗HA（12CA5）抗体</td><td>Sigma</td><td>Cat# 11 583 816 001</td><td></td></tr><tr><td>抗Nicastrin抗体</td><td>Chemicon</td><td>Cat# AB5890</td><td></td></tr><tr><td>抗PGK1（22C5D8）抗体</td><td>abcam</td><td>Cat# ab197960</td><td></td></tr><tr><td>抗PS1 N末端（G1Nr）或环区（GIL）抗体</td><td>Takasugi et.al., J. Biol. Chem., 277, 50198-50205</td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗兔&amp;nbsp;IgG，HRP标记抗体</td><td>Cell Signaling</td><td>Cat# 7074</td><td></td></tr><tr><td>抗豚鼠IgG-HRP</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>Cat# sc-2438</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠IgG，HRP标记抗体</td><td>Cell Signaling</td><td>Cat# 7076</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;细菌与酵母菌株&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; DH5&amp;alpha;</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# 18265017</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;S. cerevisiae &lt;/em&gt;PJ-69-4A</td><td>James P. et. al., Genetics 144:1425-1436 (1996)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;化学品、多肽、重组蛋白&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(3,5-二氟苯乙酰基)-Ala-Phg-OBu&lt;sup&gt;t &lt;/sup&gt;(DAPT)</td><td>Peptide Institute</td><td>Cat# 3219-v</td><td></td></tr><tr><td>淀粉样蛋白&amp;beta;-蛋白（人，1-38）</td><td>Peptide Institute</td><td>Cat# 4484-v</td><td></td></tr><tr><td>淀粉样蛋白&amp;beta;-蛋白（人，1-40）</td><td>Peptide Institute</td><td>Cat# 4307-v</td><td></td></tr><tr><td>淀粉样蛋白&amp;beta;-蛋白（人，1-42）</td><td>Peptide Institute</td><td>Cat# 4349-v</td><td></td></tr><tr><td>淀粉样蛋白&amp;beta;-蛋白（人，1-43）</td><td>Peptide Institute</td><td>Cat# 4370-v</td><td></td></tr><tr><td>抑氨肽酶，二盐酸盐</td><td>Peptide Institute</td><td>Cat# 4062</td><td></td></tr><tr><td>抑肽酶</td><td>Sigma</td><td>Cat# A1153</td><td></td></tr><tr><td>CHAPSO</td><td>Dojindo</td><td>Cat# 343-05163</td><td></td></tr><tr><td>抑肽素</td><td>Sigma</td><td>Cat# C7268</td><td></td></tr><tr><td>二异丙基氟磷酸酯（DIFP）</td><td>Wako chemical</td><td>Cat# 049-18921</td><td></td></tr><tr><td>L685,458</td><td>Peptide Institute</td><td>Cat# 4394-v</td><td></td></tr><tr><td>亮抑蛋白酶肽</td><td>Peptide Institute</td><td>Cat# 4041</td><td></td></tr><tr><td>N-p-甲苯磺酰-L-苯丙氨酸氯甲基酮（TPCK）</td><td>Sigma</td><td>Cat# T4376</td><td></td></tr><tr><td>N&lt;sup&gt;&amp;alpha;&lt;/sup&gt;-对甲苯磺酰-L-赖氨酸氯甲基酮（TLCK）</td><td>Sigma</td><td>Cat# T7254</td><td></td></tr><tr><td>邻硝基苯基-&amp;beta;-D-半乳吡喃糖苷（ONPG）</td><td>Sigma</td><td>Cat# N1127</td><td></td></tr><tr><td>对氨基苯甲脒（pABA），二盐酸盐</td><td>Sigma</td><td>Cat# 857661</td><td></td></tr><tr><td>胃蛋白酶抑制剂A</td><td>Sigma</td><td>Cat# P5318</td><td></td></tr><tr><td>菲咯啉（PNT）</td><td>Sigma</td><td>Cat# P9375</td><td></td></tr><tr><td>苯甲基磺酰氟（PMSF）</td><td>Sigma</td><td>Cat# P7626</td><td></td></tr><tr><td>磷脂酰胆碱（PC），蛋黄，XVI-E型</td><td>Sigma</td><td>Cat# P3556</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA聚合酶</td><td>Takara</td><td>Cat# R001A</td><td></td></tr><tr><td>硫吩</td><td>Sigma</td><td>Cat# T6031</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;商用试剂盒、其他材料与仪器&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beta-Glo 检测试剂系统</td><td>Promega</td><td>Cat# E4720</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad 蛋白检测试剂盒</td><td>Bio-Rad</td><td>Cat# 5000001</td><td></td></tr><tr><td>玻璃珠，酸洗（425-600 &amp;mu;m）</td><td>Sigma</td><td>Cat# G8772</td><td></td></tr><tr><td>ImageQuant LAS4000</td><td>GE Healthcare</td><td>ImageQuant LAS4000</td><td></td></tr><tr><td>QuikChange 定点突变试剂盒</td><td>Agilent</td><td>Cat# 200518</td><td></td></tr></tbody></table>

saccharomyces cerevisiae 阿尔茨海默病模型用于筛选影响 γ-分泌酶介导的淀粉样蛋白 β 生成的基因、突变及化学物质

Saccharomyces cerevisiae Models of Alzheimer's Disease to Screen Genes, Mutations, and Chemicals Affecting Amyloid Beta Production by &#947;-Secretase

γ-分泌酶是一种嵌入细胞膜中的蛋白酶复合物，由催化性亚基早老素（PS1或PS2）以及三种辅助因子——Nicastrin、Aph-1和Pen2组成。该复合物可切割Ⅰ型跨膜蛋白的跨膜结构域，例如淀粉样前体蛋白（APP）和Notch。APP的切割产生淀粉样β肽（Aβ），这些肽段在阿尔茨海默病患者体内发生积聚。尽管已有大量研究，但这种发生在脂双层内部的独特蛋白水解作用的确切机制仍尚未完全阐明。为了研究γ-分泌酶的酶学特性，我们建立了一种基于酵母的报告系统，该系统使用人工构建的γ-分泌酶底物，其中包含与转录激活因子Gal4融合的APP或Notch片段。当γ-分泌酶将膜结合底物中的Gal4切割释放后，可激活报告基因的转录，通过检测酵母生长情况或β-半乳糖苷酶活性来评估γ-分泌酶的活性。此外，我们还开发了一种 体外 用于鉴定酵母微粒体中产生的不同形式Aβ的检测方法。这些酵母模型为筛选影响γ-分泌酶功能的突变、基因和化合物提供了平台。通过研究早发性家族性阿尔茨海默病（FAD）相关PS1突变体的功能缺失特性，可进一步筛选FAD抑制性突变以及γ-分泌酶调节剂（GSMs），此外还可筛选γ-分泌酶抑制剂（GSIs）。本报告中，我们描述了在酵母系统中研究γ-分泌酶活性所采用的遗传学与生物化学方法，并概述了本视频实验方案的关键步骤。

利用迄今为止所描述的技术，我们已将基因、突变、化学物质和肽分析为影响 γ-分泌酶活性的因素10,11,12,13,17,18,19。基于生长的基因和突变筛选可检测大量克隆（100,000–1,000,000）。相较于使用培养的哺乳动物细胞的其他系统，大规模筛选具有优势。
我们对γ-分泌酶亚基PS110,12,17和Aph1a<sup cl...

本文描述了一种重建人源γ-分泌酶的酵母系统。该系统可用于鉴定和研究影响酶活性的突变，并可用于筛选γ-分泌酶抑制剂（GSIs）。利用家族性阿尔茨海默病突变体的功能丧失特性，还可用于筛选γ-分泌酶调节剂（GSMs）。

Saccharomyces cerevisiae 阿尔茨海默病模型用于筛选影响 γ-分泌酶介导的淀粉样蛋白 β 生成的基因、突变及化学物质

γ-分泌酶是一种嵌入细胞膜中的蛋白酶复合物，由催化性早老素亚基（PS1 或 PS2）和三个额外的……

我们正在酵母中重建γ-分泌酶，以研究与家族性阿尔茨海默病（FAD）相关的突变如何影响其活性，以及抑制性突变或化学调节剂如何恢复其功能并降低致病性Aβ42水平。我们结合哺乳动物细胞和酵母系统的功能分析与冷冻电镜（cryo-EM）的结构分析，研究γ-分泌酶调节的机制。我们利用酵母中的γ-分泌酶重建系统分析了FAD突变，鉴定了能够恢复γ-分泌酶FAD突变活性并降低Aβ42水平的抑制因子，其效果模拟了γ-分泌酶调节剂的作用。本方案能够在酵母中快速、可扩展地进行γ-分泌酶活性的功能筛选，无需依赖复杂的哺乳动物系统，即可分析人类突变及调节因子。我们将重点鉴定γ-分泌酶A的新型遗传或化学调节剂和抑制剂，阐明Aβ42产生的机制，并进一步拓展基于酵母的人源膜内蛋白水解重建系统。首先，采用标准的乙酸锂法将质粒转化至酵母PJ69-4A菌株中，以表达γ-分泌酶及其底物。将转化后的酵母菌株划线接种于缺乏亮氨酸、色氨酸、组氨酸和腺嘌呤的SC-LWHUA培养基上，通过观察生长情况来评估底物的切割效果。于30摄氏度下培养平板三天。通过评估菌落大小来判断HIS3和ADE2基因的表达情况。为了通过β-半乳糖苷酶活性评估底物切割情况，将酵母菌株在SC-LWU液体培养基中于30摄氏度下培养，直至菌液浓度达到每毫升10的7次方个细胞。取1.5毫升培养物移入离心管中，于4摄氏度下以21,100 ×g离心3分钟（使用1.5毫升离心管）。用100微升预冷的冰水洗涤菌体沉淀，并将沉淀重悬于30微升含有1毫摩尔二硫苏糖醇（DTT）以及用蒸馏水和二甲基亚砜配制的蛋白酶抑制剂混合液的裂解缓冲液中。加入一颗酸洗过的玻璃珠，使其刚好位于溶液表面下方。在最大转速下涡旋混合10次，每次1分钟。用一根加热的25号针头在管底打一个孔。将裂解后的细胞再次在865G离心2分钟，然后在4摄氏度下以21,100 G离心10分钟。收集上清液作为粗裂解液。接下来，将5至10微升粗裂解液与0.4毫升Z缓冲液混合。然后加入 80 µL 的 0.4% 邻硝基苯基-β-D-半乳糖苷溶液，涡旋混匀。在 37 °C 下孵育，直至溶液因硝基苯酚的生成而变为淡黄色。加入 0.2 mL 的 1 M 碳酸钠溶液以终止反应。在420纳米处测定吸光度以确定β-半乳糖苷酶活性。使用基于Bradford法的蛋白检测试剂盒，以牛血清白蛋白作为标准品，定量粗裂解液中的蛋白浓度。通过将1份储备液与4份双蒸去离子水混合，配制染料试剂。在微孔板的每个孔中，将1至5微升的每种裂解液或标准品与100微升稀释后的染料混合。将微孔板在室温下孵育5分钟后，在595纳米处测定吸光度，利用标准曲线确定蛋白质浓度。首先，将两个微粒体混合，每个微粒体含有40至80微克蛋白质，加入γ缓冲液，最终体积为12.5微升。在孵育前一小时，用移液器加入等体积的含2% CHAPSO的γ缓冲液。为启动反应，

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酿酒酵母 阿尔茨海默病模型筛选通过 γ-分泌酶影响淀粉样蛋白 β 生成的基因、突变和化学物质

被广泛研究的线虫秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）可通过转基因技术表达人类β-淀粉样蛋白肽（Aβ）。在秀丽隐杆线虫（C.

使用转基因 C. elegans 模型检测β-淀粉样蛋白毒性

高通量酵母质粒过表达筛选

我们介绍了在秀丽隐杆线虫（C.

一种用于淀粉样病变研究的 Caenorhabditis elegans 模式系统

虽然细胞表面蛋白的运输相对容易研究，但可视化细胞内蛋白的转运过程则困难得多。在此，我们使用包含光激活型GFP的构建体，展示了一种精确追踪淀粉样前体蛋白从高尔基体向下游区室转运及其清除过程的方法。...

利用光激活型GFP成像APP的细胞内转运过程

我们开发了一种定量三维方法 计算机模拟 脑部建模（q3DISM） 淀粉样蛋白-β（Aβ） 阿尔茨海默病啮齿类动物模型中单核吞噬细胞的吞噬作用。该方法可广泛用于几乎任何吞噬事件的定量分析 体内.

阿尔茨海默病啮齿类动物模型中脑内淀粉样蛋白-β吞噬作用的定量三维in silico建模（q3DISM）

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评估淀粉样蛋白-β和Tau神经病理学转基因小鼠模型中的自发交替、新物体识别和肢体抓握行为

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基于基质辅助激光解吸/电离成像质谱技术（MALDI-IMS）的分子成像可实现对生物样本中多种分析物的同步定位。本文介绍了一种利用MALDI-IMS检测和可视化阿尔茨海默病及脑淀粉样血管病样本脑组织中β淀粉样蛋白的实验方案。...

利用基质辅助激光解吸/电离成像质谱法可视化人脑中的淀粉样蛋白β沉积

本方案概述了在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）模型中，针对与肌萎缩侧索硬化症（ALS）和帕金森病相关蛋白过表达所引发的组蛋白翻译后修饰（PTM）全基因组水平变化的表征实验流程。经SDS-PAGE分离后，通过特异性识别修饰位点的抗体，利用蛋白质印迹法（Western...

表征酵母神经退行性蛋白病模型中的组蛋白翻译后修饰变化

本方案通过海藻酸盐的快速物理凝胶化来包封细胞，从而实现细胞的固定化。所获得的微珠能够随时间可控且持续地分泌β-淀粉样蛋白，可用于研究分泌型β-淀粉样蛋白在体外和体内模型中的作用。...

用于阿尔茨海默病建模的β-淀粉样蛋白分泌海藻酸盐微珠的制备

研究和理解帕金森病的发病机制需要一种α-突触核蛋白的体内生理模型。我们描述了一种利用人源化酵母模型监测α-突触核蛋白细胞毒性及聚集体形成的方法。...

一种利用人源化酵母模型研究α-突触核蛋白毒性和聚集的方法

了解如何在酿酒酵母中重建γ-分泌酶以研究家族性阿尔茨海默病突变对其活性的影响，并筛选能够恢复酶功能、降低致病性Abeta 42水平的抑制突变和化学调节剂。

Saccharomyces cerevisiae 阿尔茨海默病模型用于筛选影响 γ-分泌酶介导的淀粉样蛋白 β 生成的基因、突变及化学物质

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