用于研究 结核分枝杆菌 与免疫受体 SLAMF1 相互作用的荧光检测

我们的研究为研究结核微细菌与表达人类微噬细胞的微生物传感器之间的生化相互作用提供了有用的指南，并且将与在结核微杆菌进入纤维细胞中发挥作用的较硬分子相关。多年来，人们一直使用通常使用报告机、密封分子、水平重组蛋白、敲除、敲低、低表达模型的方法研究受体相互作用。这些技术可能具有挑战性、耗时且有时成本高昂。

使用已发表的方案，我们首次表明，在巨噬细胞中，SLMF1 受体与结核分枝杆菌相互作用，促进细菌摄取并导致内溶酶体成熟。我们已经克服了与基因表达实验相关的困难，并描述了新治疗策略的新靶点。我们的方案提供了两种使用流式细胞术和荧光显微镜检测结核微生物和 SLMF1 微生物传感器之间的生化相互作用的替代方案，这两种技术通常可用且使用丰富。

这种方法有许多潜在的用途，可以很容易地应用于其他研究环境。我们提供了一种简单的方案，使用全细胞灭活和超声处理细菌评估结核分枝杆菌受体相互作用，这可以在 BSL2 条件下进行，但很容易适应其他受体和活菌株。如果需要，这些检测也可以在 BSL3 条件下使用不同的活病原体进行。

首先，小心地将从健康捐献者那里收集的血液转移到 50 毫升试管中，然后用生理盐水将其稀释至其体积的一半。制备密度梯度培养基并离心样品以分离外周血单核细胞 PBMC。从白色光晕中收集 PBMC。

在细胞计数室中计数细胞后，使用 CD14 珠子进行磁性选择以收集 CD14 阳性单核细胞。然后将分离的细胞重悬于 RPMI 1640 培养基中。在无血清的情况下，将 500 微升浓度为 1 乘以 10 倍/毫升 6 个细胞的浓度的 CD14 阳性单核细胞接种到 24 孔细胞培养板的每个孔中，以促进粘附。

2 小时后，用预热的 RPMI 1640 培养基洗涤孔，以去除非贴壁细胞。使用 1 毫升 RPMI 1640 完全培养基将单核细胞分化为巨噬细胞 16 至 18 小时。第二天，用 1 毫升 PBS 洗涤孔，并向每个孔中加入 1 毫升完全 RPMI 1640 培养基。

用 10 μL 超声处理的结核分枝杆菌抗原刺激巨噬细胞 24 小时。第二天，使用 P-1000 移液器，从板孔中丢弃完整的 RPMI 培养基。加入冷 PBS 并上下移液以收获巨噬细胞。

将细胞转移到 1.5 ml 微量离心管中。将试管在 4 摄氏度下以 500 G 离心 5 分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于补充的放射免疫沉淀测定缓冲液中。

将悬浮液在冰上孵育 1 小时，每 10 分钟涡旋一次。将悬浮液以 14， 000G 离心 15 分钟，并收集上清液。将 6 个完整灭活结核分枝杆菌细胞的 1 次功率与 50 微升蛋白质提取物从 1 次 10 次到 6 个巨噬细胞的 1 次功率在 4 摄氏度下在 4 摄氏度下孵育过夜。

第二天，为了对蛋白质细菌复合物进行染色，将抗人 SLAMF1 抗体加入微管中，涡旋混合物，并在 4 摄氏度下避光孵育 30 分钟。用 FACS 洗涤蛋白质细菌复合物后，将它们重悬于 FACS 缓冲液中，并在流式细胞仪上采集样品。使用圆头手术镊子，将 12 毫米的圆形盖玻片放入 24 孔培养板的孔中。

将盖玻片与结核分枝杆菌罗丹明抗原在 37 摄氏度下孵育 1 小时。孵育后，加入 100 微升蛋白提取物，用 300 微升 PBS 稀释，并在室温下搅拌孵育 2 小时。用石蜡膜包裹培养板的盖子。

将 60 μL 先前滴定的抗 SLAMF1 一抗滴加到石蜡膜覆盖的盖子上。使用弯曲的细尖手术镊子和针头小心地从板上取下盖玻片。与一抗和二抗溶液孵育后，去除多余的液体，并将盖玻片安装在放置在载玻片上的一滴封固液上。

将载玻片置于荧光显微镜下，并使用适当的滤光片观察细胞。从纯度为 95% 或更高的 PBMC 中成功分离出单核细胞，并在贴壁和过夜培养后生成单核细胞衍生的巨噬细胞。在结核分枝杆菌抗原刺激的巨噬细胞中诱导 SLAMF1 表面表达，并采用流式细胞术确认其水平。

使用交联测定和流式细胞术证明 SLAMF1 与结核分枝杆菌全细胞之间的相互作用。使用荧光显微镜观察 SLAMF1 和结核分枝杆菌抗原之间的相互作用，并通过合并图像确认共定位。