从兔肌肉中纯化肌质网-内质网 Ca²⁺-ATP 酶

我们的研究聚焦于纯化具有高结构质量和催化活性的SERCA，并探究海藻糖是否在纯化过程中稳定SERCA，从而增强其稳定性和功能。研究P型ATP酶在寡聚状态下的三维结构。利用人工智能进行ATP酶的结构建模、结构动力学模拟以及配体分子对接，以探索疾病治疗策略，提升蛋白质功能分析能力并推动新技术发展。当前面临的挑战包括：阐明P型ATP酶中的能量转换机制，揭示四级结构如何调控其功能与活性，以及鉴定可用于人类疾病治疗的有效抑制剂。我们证实了GS质膜质子-ATP酶的六聚体状态，并证明其结构动力学依赖于介质黏度，符合Kramers理论的描述。

[旁白] 首先，获取野生型欧洲兔（Oryctolagus cuniculus）的快肌组织。将其悬浮于三倍体积的100毫摩尔氯化钾溶液中以进行机械分散。匀浆1分钟，随后在冰上静置1分钟。在4摄氏度下以1,500 ×g离心5分钟，去除组织碎片。收集上清液至离心管中，然后使用组织研磨器进行匀浆。接着，对匀浆液进行离心，再收集其上清液。将沉淀物重悬于约40毫升的0.5摩尔蔗糖溶液中。随后，在4摄氏度下以12,000 ×g离心15分钟。将所得上清液用含0.6摩尔氯化钾和0.15摩尔蔗糖的溶液稀释后再次离心。将含有肌浆网囊泡片层的沉淀物重悬于缓冲液中，该缓冲液包含0.3摩尔蔗糖、0.1摩尔氯化钾和5毫摩尔Tris-盐酸（pH 7.0）。将肌浆网囊泡按每份1毫升分装。将肌浆网囊泡悬液在冰上轻轻振荡孵育10分钟，然后离心。将沉淀物重悬于少于3毫升的25毫摩尔Tris-盐酸缓冲液中。再次匀浆后，用Tris-盐酸缓冲液定容至10毫升。采用Lowry法测定蛋白浓度。加入卵磷脂（azolectin），终浓度为5毫克/毫升，随后加入0.85 Zwittergent 3-14。再次匀浆后，在4摄氏度下以100,000 ×g离心60分钟。将上清液收集至新的离心管中。用pH 7.2的2毫摩尔EGTA溶液以1:2比例稀释。将悬液轻柔地铺加至Tris缓冲液中的不连续海藻糖浓度梯度上。按前述条件再次离心，并收集透明略带黄色的沉淀物。将沉淀物轻柔地重悬于少量Tris缓冲液中。测定蛋白浓度后，用缓冲液稀释至终蛋白浓度为2毫克/毫升。进行ATP酶活性测定时，配制1毫升反应体系。涡旋混匀反应液，于37摄氏度孵育10分钟。加入0.9单位L-乳酸脱氢酶和1.5单位丙酮酸激酶。加入10微克SERCA以启动ATP酶反应。使用带有恒温比色皿槽的分光光度计，在340纳米波长下每秒监测一次吸光度变化，持续600秒，以检测NAD的生成。对于用异硫氰酸荧光素（FITC）标记SERCA的实验，首先将20微克SERCA悬浮于50微升标记缓冲液中。涡旋混匀。然后将样品在室温避光条件下分别孵育15、10、7、5和2分钟。为终止标记反应，加入等体积预冷的终止缓冲液。在冰上避光孵育5分钟。将FITC标记的SERCA进行SDS-PAGE电泳。将透明凝胶置于302纳米波长的紫外光下照射，并拍照记录结果。最后用考马斯亮蓝染色凝胶，再次拍照记录。进行圆二色光谱分析时，首先将SERCA悬浮于400微升pH 7.0的10毫摩尔磷酸缓冲液中，温度设为25摄氏度。将样品加载至光程为0.1厘米的比色皿中。设定远紫外光谱范围为190至260纳米，仪器分辨率和带宽均为1纳米。在25摄氏度下以50纳米/分钟的扫描速度记录圆二色信号。考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE凝胶显示，随着纯化步骤的进行，SERCA蛋白条带逐渐富集。通过海藻糖浓度梯度超速离心完成的最终SERCA纯化步骤，获得的纯度超过90%。肌浆网囊泡中含有大量SERCA，其中约73%的总蛋白为该P型ATP酶。在ATP水解速率随ATP浓度变化的曲线中，纯化的SERCA表现出典型的米氏动力学特征，证实其具有酶学功能。Lineweaver-Burk双倒数作图显示，ATP的米氏常数约为10微摩尔，与已有文献报道值一致。FITC对SERCA的标记结果表明其核苷酸结合位点完整。考马斯亮蓝染色显示的SERCA条带与FITC标记的条带位置完全对应。圆二色光谱分析证实所纯化的SERCA具有高质量的空间结构，其光谱图显示出明确的二级结构特征。