小鼠脑脊髓样品的提取和组织透明化制备

我们的研究重点是中枢神经系统如何介导认知功能，并与免疫系统相互作用。我们的目标是改进检查大脑和脊髓的方法，解决有关这些相互作用的基本问题。这些方法保持整个大脑和脊髓完好无损，这有助于我们使用组织清除更彻底地绘制细胞图。与传统的切片和成像方法相比，它还使过程更快、更准确，减少了时间和错误。

我们绘制了大脑和与肺部相连的脊髓区域的图，从而产生 。我们的研究将侧重于探索大脑、脊髓和肺部之间的神经免疫通讯。以及这种相互作用如何影响免疫反应。

[导师]首先，使用钢夹将鼠标的四肢固定在宽亚克力板上。使用剪刀剪开两条股骨之间的皮肤，然后继续向上剪，直到到达横膈膜。通过横膈膜打开胸部两侧，用剪刀和直镊子露出心脏。将连接到灌注管的 0.7 毫米输液针插入左心室，并在右心耳处切开一到两毫米的切口。灌注后，用眼科剪刀分离小鼠背部和头部的皮肤。在连接双肢上后缘的线与脊柱相交处切断脊柱。去除小鼠颈部和背部的肌肉和脂肪组织，露出脊柱和头骨。用静脉剪刀从椎管下端沿脊柱左右两侧和脊髓之间的中线间隙剪开。然后切除切断脊柱的上部和双侧，露出脊髓。重复这些步骤，直到到达大脑连接。将静脉剪刀的一根刀片的尖端放在枕骨枕和大脑之间。沿矢状中缝线滑动并切割以打开颅骨。使用镊子取出头骨并暴露大脑。现在，使用镊子和静脉剪刀，从颅端取出小鼠脑脊髓组织。使用解剖镊子在体视显微镜下去除脊髓膜。接下来，用缝合线将脑脊髓样本固定到固定板上。加入至少 20 倍样品体积的 4% 多聚甲醛。固定后，弃去多聚甲醛，用PBS洗涤样品3次。首先，将提取的小鼠脑脊髓固定在多聚甲醛中。对于脂质去除溶液，将溶液 A 和 B 以 9 比 1 的质量比混合。将 50 毫升脂质去除溶液加入 50 毫升离心管中，并将固定组织放入其中。在溶液C中孵育后，更换溶液，将样品完全浸入溶液C中的培养皿放在带有刻度线的灯箱上。要制备凝胶溶液，请将 147 克溶液 C 和 3 克琼脂糖加入 200 毫升玻璃瓶中。用搅拌棒将组分充分混合，然后微波炉直至琼脂糖溶解。将凝胶溶液转移到设置为 37 摄氏度的实验室烤箱中。将两毫米深的37摄氏度回火凝胶溶液倒入模具中，放入四摄氏度的冰箱中冷却30分钟，直至呈半固体。将折射率匹配的样品放入模具中，并加入凝胶溶液至样品顶部的水平或略低于样品的顶部。将模具放回四摄氏度的冰箱中两个小时。盖上盖玻片并再次冷藏。用镊子取下盖玻片，取出嵌入的样品。将 30 毫升成像溶液加入 50 毫升管中，并将样品浸入溶液中。在将支架固定到成像设备上之前，先涂上 502 粘合剂将样品牢固地固定在样品架上。运行扫描软件并在放大部分选择 4 倍放大级别。单击校准按钮以激活校准模式。单击预览按钮进入预览模式。然后点击Z方向移动按钮，将样品从样品室底部缓慢向上移动，直到生成的光片穿过样品。选择适当的激光通道和照明模式选项。选择样品的扫描路径方向。单击自动扫描按钮开始捕获样品的图像。该方案成功地保留了整个小鼠大脑和脊髓，同时保持完整的荧光信号以实现清晰的成像。脑脊髓样本的荧光成像清晰地可视化了详细的神经结构。 更高放大倍率的图像增强了单个荧光标记细胞的可视化。