小鼠脑脊髓样品的提取和组织透明化制备
2025年4月11日
本研究提出了一种提取和制备保留荧光信号的透明化全脑和脊髓样品的方案，以提高实验效率和数据完整性，以推进神经科学研究。
我们的研究重点是中枢神经系统如何介导认知功能，并与免疫系统相互作用。我们的目标是改进检查大脑和脊髓的方法，解决有关这些相互作用的基本问题。这些方法保持整个大脑和脊髓完好无损，这有助于我们使用组织清除更彻底地绘制细胞图。与传统的切片和成像方法相比，它还使过程更快、更准确，减少了时间和错误。
我们绘制了大脑和与肺部相连的脊髓区域的图，从而产生 。我们的研究将侧重于探索大脑、脊髓和肺部之间的神经免疫通讯。以及这种相互作用如何影响免疫反应。
[导师]首先，使用钢夹将鼠标的四肢固定在宽亚克力板上。使用剪刀剪开两条股骨之间的皮肤，然后继续向上剪，直到到达横膈膜。通过横膈膜打开胸部两侧，用剪刀和直镊子露出心脏。将连接到灌注管的 0.7 毫米输液针插入左心室，并在右心耳处切开一到两毫米的切口。灌注后，用眼科剪刀分离小鼠背部和头部的皮肤。在连接双肢上后缘的线与脊柱相交处切断脊柱。去除小鼠颈部和背部的肌肉和脂肪组织，露出脊柱和头骨。用静脉剪刀从椎管下端沿脊柱左右两侧和脊髓之间的中线间隙剪开。然后切除切断脊柱的上部和双侧，露出脊髓。重复这些步骤，直到到达大脑连接。将静脉剪刀的一根刀片的尖端放在枕骨枕和大脑之间。沿矢状中缝线滑动并切割以打开颅骨。使用镊子取出头骨并暴露大脑。现在，使用镊子和静脉剪刀，从颅端取出小鼠脑脊髓组织。使用解剖镊子在体视显微镜下去除脊髓膜。接下来，用缝合线将脑脊髓样本固定到固定板上。加入至少 20 倍样品体积的 4% 多聚甲醛。固定后，弃去多聚甲醛，用PBS洗涤样品3次。首先，将提取的小鼠脑脊髓固定在多聚甲醛中。对于脂质去除溶液，将溶液 A 和 B 以 9 比 1 的质量比混合。将 50 毫升脂质去除溶液加入 50 毫升离心管中，并将固定组织放入其中。在溶液C中孵育后，更换溶液，将样品完全浸入溶液C中的培养皿放在带有刻度线的灯箱上。要制备凝胶溶液，请将 147 克溶液 C 和 3 克琼脂糖加入 200 毫升玻璃瓶中。用搅拌棒将组分充分混合，然后微波炉直至琼脂糖溶解。将凝胶溶液转移到设置为 37 摄氏度的实验室烤箱中。将两毫米深的37摄氏度回火凝胶溶液倒入模具中，放入四摄氏度的冰箱中冷却30分钟，直至呈半固体。将折射率匹配的样品放入模具中，并加入凝胶溶液至样品顶部的水平或略低于样品的顶部。将模具放回四摄氏度的冰箱中两个小时。盖上盖玻片并再次冷藏。用镊子取下盖玻片，取出嵌入的样品。将 30 毫升成像溶液加入 50 毫升管中，并将样品浸入溶液中。在将支架固定到成像设备上之前，先涂上 502 粘合剂将样品牢固地固定在样品架上。运行扫描软件并在放大部分选择 4 倍放大级别。单击校准按钮以激活校准模式。单击预览按钮进入预览模式。然后点击Z方向移动按钮，将样品从样品室底部缓慢向上移动，直到生成的光片穿过样品。选择适当的激光通道和照明模式选项。选择样品的扫描路径方向。单击自动扫描按钮开始捕获样品的图像。该方案成功地保留了整个小鼠大脑和脊髓，同时保持完整的荧光信号以实现清晰的成像。脑脊髓样本的荧光成像清晰地可视化了详细的神经结构。 更高放大倍率的图像增强了单个荧光标记细胞的可视化。
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概览
本研究提出了一种在提取和准备透明化全脑和脊髓样本时保留荧光信号的协议。该方法提高了实验效率并维护数据完整性，以推进神经科学研究。所开发的方法为传统的切片和成像技术提供了更快速、更准确的替代方案。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 神经免疫学
- 组织透明化技术
背景
- 调查中枢神经系统在认知功能中的作用。
- 探索大脑、脊髓和免疫系统之间的相互作用。
- 解决有关神经-免疫通讯的基本问题。
研究目的
- 改进检查大脑和脊髓结构的方法。
- 促进完整组织中细胞结构的映射。
- 与传统方法相比减少错误和处理时间。
使用的方法
- 研究采用了小鼠大脑和脊髓样本的组织透明化协议。
- 使用全脑和脊髓组织进行详细的细胞映射。
- 涉及多个关键步骤，包括灌流和样本固定，以维持荧光信号。
- 遵循了一种系统的方法来嵌入和成像样本。
主要结果
- 该协议成功地保留了荧光信号，实现了神经结构的清晰成像。
- 详细的神经结构被可视化，提供了对大脑和脊髓连接性的洞察。
- 增强的成像允许观察到单个标记的细胞，有助于更好地理解神经解剖学。
结论
- 本研究表明，完整和透明化的大脑和脊髓样本可以显著提高成像质量。
- 研究结果有助于更好地理解神经-免疫相互作用。
- 研究结果延伸到健康和疾病背景下神经元机制的探索。
常见问题
Executive Industry Relevance
Preserving intact brain-spinal cord connectivity through advanced tissue clearing enables comprehensive mapping of neural and immune interactions, addressing a critical bottleneck in CNS target validation. This protocol streamlines sample preparation and imaging, reducing manual error and accelerating data acquisition for early discovery and translational research. Enhanced imaging fidelity supports predictive confidence in mechanistic studies and portfolio triage for neuroimmunology programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables high-resolution mapping of neural circuits and immune interfaces in intact CNS tissue.
- Supports mechanistic de-risking by preserving spatial relationships critical for target validation.
- Facilitates hypothesis-driven interrogation of neuroimmune pathways relevant to disease models.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, reproducible whole-organ samples for downstream imaging workflows.
- Delivers quantitative, high-content imaging outputs suitable for comparative analysis.
- Improves assay readiness by maintaining fluorescent signal integrity throughout processing.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant system studies by enabling visualization of CNS-immune connectivity.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by preserving anatomical context.
- Reduces translational risk by enabling more accurate modeling of neuroimmune mechanisms.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates at the interface of early discovery and preclinical research, supporting lead identification and mechanistic studies in neuroimmunology.
- Discovery Biology: Advances hypothesis testing and pathway clarification by enabling intact tissue analysis.
- Screening: Standardizes sample preparation for reproducible, quantitative imaging outputs.
- Analytics: Provides high-resolution, multi-channel imaging data for robust statistical comparison.
- Translational Research: Maintains anatomical and molecular fidelity for biomarker alignment and disease modeling.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reusable workflow for CNS tissue clearing and imaging across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CNS target validation.
- Operational Value: Streamlines sample processing, enhances reproducibility, and supports high-throughput imaging.
- Strategic Value: Enables more informed go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in neuroimmunology portfolios.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of CNS and immune-modulating assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in CNS dissection, tissue clearing, and advanced imaging techniques.
- Demands access to specialized imaging platforms and analytical infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization for reproducible sample preparation and imaging protocols.
- May require adaptation for different animal models or tissue types based on research focus.
- Potential limitations include tissue integrity challenges and the need for careful handling to preserve fluorescent signals.
