Name: 靶向癌细胞中非编码 RNA 之间合成致死相互作用的双重 CRISPR 干扰策略 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: 了解双重CRISPR干扰策略在黑色素瘤细胞中靶向长链非编码RNA的合成致死相互作用。该方法通过组合基因敲低筛选，识别癌症特异性lncRNA互作网络，为克服肿瘤耐药性提供新的治疗靶点。

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我们感谢斯特凡·劳瑟（Stefan Raunser，马克斯·普朗克分子生理学研究所，多特蒙德）提供生物安全二级实验室空间。特别感谢王伊瑞（Eric Wang）的学术贡献，以及伊米格（Imig）实验室所有过去和现任成员的宝贵讨论。乔亨·伊米格（Jochen Imig）目前由辉瑞公司（Pfizer Inc.）在CGC III项目中资助。

人黑色素瘤细胞系 501-mel（RRID: CVCL_4633）由纽约大学 Aifantis 实验室惠赠。Lenti-X 293T HEK 细胞系购自 Takara Bio。这些细胞系在含 10% 胎牛血清（FBS）的高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）中培养，培养条件为 37 °C、5% CO2 及无菌环境。细胞传代至融合度达到 80%–90% 时进行。细胞系定期检测支原体污染。
1. 使用在线gRNA设计平台设计gRNA
<ol>
	<li>设计一条特异于 SpCas9 和一种特异于 Sa针对每个目标lncRNA使用Cas9，以评估哪种变体可产生更优的敲低效果。</li>
	<li>使用针对目标lncRNA的最高效gRNA，此处为RP11-120D5.1（RP11）和XLOC_030781（XLOC） S. pyogenes (gRNA-sp) Cas9 和 S. aureus (gRNA-sa) Cas9 
	注意： S. pyogenes gRNAs 可从 Petroulia 等人处获取28.</li>
	<li>遵循位点特异性建议，优先选择由gRNA设计工具推荐的高靶向评分所体现的最高靶向活性，同时尽量减少脱靶匹配。
	<ol>
		<li>选择基因组 GRCh38（hg， 智人）。为特定的PAM位点进行选择 SpCas9（NGG）和 萨Cas9（NNGRRT）</li>
		<li>采用 Hsu 等人提出的脱靶评分方法29将gRNA定位在转录起始位点上游-150 bp至下游+50 bp的窗口范围内，以获得最佳效果。</li>
		<li>选择具有最高靶上和脱靶评分的gRNA（参见 补充表1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将非靶向或随机对照gRNA（此处针对Rosa26）与各靶向gRNA组合，构建双gRNA载体，以靶向一个lncRNA。将靶向gRNA组合于同一质粒中，可实现对两个靶位点的位点特异性修饰。 
	注意：含有对照 gRNA 和靶向 gRNA 的双 gRNA 载体可实现对一个靶向 lncRNA 的敲低，而含有靶向不同位点 gRNA 的双 gRNA 载体则可用于同时敲低多个靶向 lncRNA&#160;位点可实现靶向lncRNA的同步敲低。</li>
</ol>
2. gRNA 克隆
<ol>
	<li>使用包含 gRNA 序列的两个 DNA 片段进行重叠延伸 PCR。按照 Najm 等人27所述方法，使用 U6 正向引物和 H1 反向引物（见补充表 2）进行扩增。
	<ol>
		<li>在 50 µL PCR 体系中加入 25 µL 的 2x 高保真 PCR 预混液（含 HF 缓冲液）以及各 1 µL 含有 S. pyogenes 或 S. aureus gRNA 的 DNA 片段。按照以下循环条件运行反应：98 °C 初始变性 30 s，随后进行 15 个循环，每个循环包括 98 °C 变性 5 s、55 °C 退火 10 s 和 72 °C 延伸 15 s。</li>
		<li>完成初始 15 个循环后，加入 2.5 µL U6 正向引物和 2.5 µL H1 反向引物，并在相同条件下再进行 20 个循环，最后在 72 °C 延伸 5 min。</li>
		<li>根据制造商说明书，使用 PCR 纯化试剂盒纯化 PCR 产物。</li>
		<li>在 10 µL 反应体系中，加入 1 µg 修饰质粒、1 µL BsmB1 限制性内切酶和 1 µL 10x 缓冲液，在 37 °C 孵育 30 min，进行酶切。</li>
		<li>按照其他研究者描述的 HiFi DNA 组装反应方案30，将 PCR 产物克隆至经酶切的 dual-gRNA-Zeo-GFP 质粒中（见补充图 1和补充文件 1）。</li>
		<li>将 4 µL 组装产物与 50 µL 感受态 E. coli 细胞混合，根据制造商说明书进行化学转化。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 慢病毒制备
警告：操作活性慢病毒时，所有步骤均需遵循适当的安全规范。操作病毒时必须始终在二级生物安全柜内进行，以防止不可避免的气溶胶产生带来的危害。所有在生物安全柜外进行的操作（如离心），必须使用经批准可用于第二类风险组生物的防气溶胶密闭容器和转子。在工作区域内，应始终穿戴适当的防护装备，包括实验服、一次性手套和护目镜。工作台面必须用消毒液处理，其他废弃物也需用消毒液处理，并在密闭的生物安全柜内经紫外线照射至少240分钟。使用过的血清移液管和移液器吸头在丢弃至可高压灭菌瓶之前，必须先用消毒液冲洗。随后，废弃物应丢弃至S2级生物废弃物容器中。S2级废弃物将通过高压灭菌进行灭活处理。转导后的细胞系只有在转导后至少2天，并且在使用无病毒培养基完成至少两次完全换液之后，才可在S1条件下操作。
<ol>
	<li>用血细胞计数板将10 µL细胞与10 µL台盼蓝溶液混合，对Lenti-X 293T HEK细胞进行计数。每10 cm培养皿接种4 × 106个Lenti-X 293T HEK细胞，以确保次日细胞融合度达到约80%。</li>
	<li>从本步骤&#160;起在二级生物安全实验室中操作。将500 µL适当的转染培养基与11.25 µg转移载体SpdCas9-KRAB-MeCP2（见补充文件2）、5.5 µg包膜质粒VSV-G以及16.5 µg pPAX2载体混合，室温孵育5分钟。对于第二种dCas9变体，使用转移载体SadCas9-KRAB-MeCP2（见补充文件3）。</li>
	<li>在另一管中，将500 µL低血清培养基与36 µL PEI试剂（储存液：1 mg/mL）混合，室温孵育5分钟。</li>
	<li>将上述两种混合液合并，室温孵育15分钟。将混合液小心逐滴加入细胞培养基（6 mL）中，于37 °C、5% CO2条件下过夜孵育。确保细胞保持贴壁状态，以避免慢病毒产量降低。</li>
	<li>转染后12–15小时，使用移液管将培养基弃入可高压灭菌的废液瓶中。此后，所有一次性耗材（包括移液管和枪头）在丢弃至高压灭菌废物容器前，均需先用消毒液冲洗。使用新的移液管向转染后的细胞中加入5 mL新鲜DMEM培养基。</li>
	<li>转染48小时后，使用移液管将上清液转移至50 mL标准离心管中以收集慢病毒。将该离心管置于冰箱中保存。向细胞中再加入5 mL新鲜培养基，并继续孵育24小时。</li>
	<li>再次将上清液转移至同一支含有第一次收获物的50 mL标准离心管中，重复收集慢病毒。同样，再次加入5 mL新鲜培养基，孵育24小时后将上清液转移至该50 mL标准离心管。将第一次、第二次和第三次收获的上清液合并后储存在50 mL标准离心管中，于4 °C保存，直至进行过滤和离心处理。</li>
	<li>将合并后的上清液在适用于危险等级2级生物体操作的防气溶胶密闭容器和转子中，于4 °C、500 × g条件下离心5分钟，以沉淀脱落的细胞和碎片。随后通过0.2 µm无菌细胞培养级注射器滤器过滤上清液。</li>
	<li>使用截留分子量为100 kDa的离心过滤装置，在4 °C、1,000 × g条件下浓缩滤过的上清液至约500 µL。将病毒分装为50–100 µL每份，于-80 °C保存，以备后续使用。</li>
</ol>
4. 慢病毒转导及稳定转染细胞的筛选
警告：操作病毒时务必在二级生物安全柜中进行。
<ol>
	<li>转导前一天，将501-mel细胞以每孔2 × 105个细胞、终体积2 mL的接种量接种于6孔板中。</li>
	<li>更换为2 mL预热的DMEM培养基，其中添加polybrene，终浓度为6 µg/mL。</li>
	<li>此后操作需在二级生物安全实验室中进行。同时向细胞中加入50 µL含有SpdCas9-KRAB-MeCP2和SadCas9-KRAB-MeCP2的慢病毒。使用过的耗材（包括刻度移液管和移液枪头）在丢弃至高压灭菌废物桶前，须用消毒液冲洗。轻轻摇动培养板，于37 °C、5% CO2条件下孵育。</li>
	<li>转导后16小时，用刻度移液管将培养基弃入可高压灭菌的瓶子中，并加入含blasticidin（10 µg/mL）和puromycin（2 µg/mL）的新鲜培养基2 mL。</li>
	<li>转导后第2天，更换为含blasticidin（10 µg/mL）和puromycin（2 µg/mL）的新鲜培养基2 mL，继续筛选。转导后7天起，可在生物安全一级（S1）条件下操作转导细胞。 
	注意：抗生素筛选需持续进行，直至所有未转导的对照细胞全部死亡。根据转移载体中的抗性盒，可采用其他筛选策略。如有需要，可通过杀灭曲线优化抗生素浓度。为获得dCas9融合蛋白表达水平足够的细胞群体，可能需通过流式细胞术或连续稀释铺板进行单细胞克隆筛选，并随后进行蛋白定量分析。</li>
</ol>
5. 蛋白质定量与蛋白质印迹分析
<ol>
	<li>用血细胞计数板将10 µL细胞与10 µL台盼蓝溶液混合，对稳定转染的501-mel细胞进行计数。取1 × 106个细胞，在500 × g、4 °C条件下离心5分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于1 mL预冷的PBS中。</li>
	<li>再次离心，将细胞沉淀重悬于50 µL含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液中。冰上孵育15分钟，然后在4 °C、13,000 × g条件下离心10分钟以去除细胞碎片。将上清液储存于-20 °C，或立即用于蛋白质定量分析，方法见其他文献31。</li>
	<li>取10 µg蛋白质，加入4 × LDS缓冲液和50 mM DTT，用蒸馏水定容至20 µL。使用Tris/甘氨酸SDS-PAGE系统，在135 V电压下电泳1小时，于10%分离胶中分离蛋白质，操作步骤参照先前描述32。采用湿转法，在90 V电压下电转90分钟，将蛋白质转移至PVDF膜上。</li>
	<li>将膜置于封闭缓冲液（含5%脱脂奶粉的TBS-T）中，在室温、180 rpm条件下孵育1小时。</li>
	<li>在封闭缓冲液中加入1:10,000稀释的抗GAPDH小鼠单克隆抗体作为内参。同时，在封闭缓冲液中按1:1,000稀释加入抗Cas9（S. pyogenes）或抗Cas9（S. aureus）一抗，4 °C轻柔振荡孵育过夜。</li>
	<li>用TBST缓冲液洗涤膜3次，每次10分钟。室温下加入1:10,000稀释的HRP标记的二抗（抗小鼠），孵育1小时。</li>
	<li>再次用TBST缓冲液洗涤3次，每次10分钟。使用ECL底物和成像系统检测信号。</li>
</ol>
6. 双重lncRNA抑制存活率检测
警告：操作病毒时务必在二级生物安全柜中进行。
<ol>
	<li>在转导前1天，将转导后7天的稳定转染 SadCas9-KRAB 和 SpdCas9-KRAB 的 0.1 × 105 个细胞，以每孔100 µL预温的DMEM培养基接种于96孔板中。</li>
	<li>转导当天，将培养基更换为含终浓度为6 µg/mL多聚素（polybrene）的100 µL预温DMEM培养基。此后操作需在二级生物安全实验室中进行。向细胞中加入适量体积的慢病毒颗粒。 
	注意：含双gRNA载体的慢病毒体积需通过GFP表达滴定，绘制线性曲线以确定最佳用量。</li>
	<li>转导后16小时，更换为新鲜培养基，其中含500 µg/mL Zeocin、5 µg/mL杀稻瘟菌素（blasticidin）和1 µg/mL嘌呤霉素（puromycin）。</li>
	<li>转导后第5天，按照试剂盒说明书使用细胞活力检测试剂进行发光检测。</li>
</ol>

<ol><li>Lander, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+sequencing+and+analysis+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Initial sequencing and analysis of the human genome.</a> Nature. 409 (6822), 860-921 (2001).</li>
<li>ENCODE Project Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li>
<li>Szcześniak, M. W., Wanowska, E., Mukherjee, N., Ohler, U., Makałowska, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+deeper+annotation+of+human+lncRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Gene+Regul+Mech%22%5BJournal%5D)">Towards a deeper annotation of human lncRNAs.</a> Biochim Biophys Acta Gene Regul Mech. 1863 (4), 194385(2020).</li>
<li>Fang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NONCODEV5%3A+a+comprehensive+annotation+database+for+long+non-coding+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">NONCODEV5: a comprehensive annotation database for long non-coding RNAs.</a> Nucl Acids Res. 46 (D1), D308-D314 (2018).</li>
<li>Lin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human-specific+lncRNAs+contributed+critically+to+human+evolution+by+distinctly+regulating+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Human-specific lncRNAs contributed critically to human evolution by distinctly regulating gene expression.</a> eLife. 12, RP89001.2(2023).</li>
<li>Sarropoulos, I., Marin, R., Cardoso-Moreira, M., Kaessmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+dynamics+of+lncRNAs+across+mammalian+organs+and+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Developmental dynamics of lncRNAs across mammalian organs and species.</a> Nature. 571 (7766), 510-514 (2019).</li>
<li>Melé, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+genomics.+The+human+transcriptome+across+tissues+and+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human genomics. The human transcriptome across tissues and individuals.</a> Science. 348 (6235), 660-665 (2015).</li>
<li>Cabili, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+annotation+of+human+large+intergenic+noncoding+RNAs+reveals+global+properties+and+specific+subclasses%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Integrative annotation of human large intergenic noncoding RNAs reveals global properties and specific subclasses.</a> Genes Dev. 25 (18), 1915-1927 (2011).</li>
<li>Liu, S. J., Dang, H. X., Lim, D. A., Feng, F. Y., Maher, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+noncoding+RNAs+in+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Long noncoding RNAs in cancer metastasis.</a> Nat Rev Cancer. 21 (7), 446-460 (2021).</li>
<li>Ahmad, M., Weiswald, L. B., Poulain, L., Denoyelle, C., Meryet-Figuiere, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+lncRNAs+in+cancer+cells+migration%2C+invasion+and+metastasis%3A+cytoskeleton+and+ECM+crosstalk%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Involvement of lncRNAs in cancer cells migration, invasion and metastasis: cytoskeleton and ECM crosstalk.</a> J Exp Clin Cancer Res. 42 (1), 173(2023).</li>
<li>Jain, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LncPRESS1+Is+a+p53-Regulated+LncRNA+that+Safeguards+Pluripotency+by+Disrupting+SIRT6-Mediated+De-acetylation+of+Histone+H3K56%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">LncPRESS1 Is a p53-Regulated LncRNA that Safeguards Pluripotency by Disrupting SIRT6-Mediated De-acetylation of Histone H3K56.</a> Mol Cell. 64 (5), 967-981 (2016).</li>
<li>Bergmann, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+ESC+transcriptome+by+nuclear+long+noncoding+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of the ESC transcriptome by nuclear long noncoding RNAs.</a> Genome Res. 25 (9), 1336-1346 (2015).</li>
<li>Kretz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+somatic+tissue+differentiation+by+the+long+non-coding+RNA+TINCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Control of somatic tissue differentiation by the long non-coding RNA TINCR.</a> Nature. 493 (7431), 231-235 (2013).</li>
<li>Yoon, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LincRNA-p21+suppresses+target+mRNA+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">LincRNA-p21 suppresses target mRNA translation.</a> Mol Cell. 47 (4), 648-655 (2012).</li>
<li>Huarte, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+role+of+lncRNAs+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">The emerging role of lncRNAs in cancer.</a> Nat Med. 21 (11), 1253-1261 (2015).</li>
<li>Badowski, C., He, B., Garmire, L. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-derived+lncRNAs+as+biomarkers+for+cancer+diagnosis%3A+the+Good%2C+the+Bad+and+the+Beauty%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Precis+Oncol%22%5BJournal%5D)">Blood-derived lncRNAs as biomarkers for cancer diagnosis: the Good, the Bad and the Beauty.</a> NPJ Precis Oncol. 6 (1), 40(2022).</li>
<li>Zong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+nuclear-retained+long+noncoding+RNAs+using+modified+DNA+antisense+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Knockdown of nuclear-retained long noncoding RNAs using modified DNA antisense oligonucleotides.</a> Meth Mol Biol. 1262, 321-331 (2015).</li>
<li>Gagnon, K. T., Li, L., Chu, Y., Janowski, B. A., Corey, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+factors+are+present+and+active+in+human+cell+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">RNAi factors are present and active in human cell nuclei.</a> Cell Rep. 6 (1), 211-221 (2014).</li>
<li>Zeng, Y., Cullen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+in+human+cells+is+restricted+to+the+cytoplasm%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">RNA interference in human cells is restricted to the cytoplasm.</a> RNA. 8 (7), 855-860 (2002).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+noncoding+RNA+editing+in+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated noncoding RNA editing in human cancers.</a> RNA Biol. 15 (1), 35-43 (2018).</li>
<li>Liu, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPRi-based+genome-scale+identification+of+functional+long+noncoding+RNA+loci+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CRISPRi-based genome-scale identification of functional long noncoding RNA loci in human cells.</a> Science. 355 (6320), aah7111(2017).</li>
<li>Tsung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPRi+screen+of+long+non-coding+RNAs+identifies+LINC03045+regulating+glioblastoma+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">CRISPRi screen of long non-coding RNAs identifies LINC03045 regulating glioblastoma invasion.</a> PLoS Genet. 20 (6), e1011314(2024).</li>
<li>Gilbert, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-mediated+modular+RNA-guided+regulation+of+transcription+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes.</a> Cell. 154 (2), 442-451 (2013).</li>
<li>Boettcher, M., McManus, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choosing+the+right+tool+for+the+job%3A+RNAi%2C+TALEN%2C+or+CRISPR%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Choosing the right tool for the job: RNAi, TALEN, or CRISPR.</a> Mol Cell. 58 (4), 575-585 (2015).</li>
<li>Yeo, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enhanced+CRISPR+repressor+for+targeted+mammalian+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">An enhanced CRISPR repressor for targeted mammalian gene regulation.</a> Nat Meth. 15 (8), 611-616 (2018).</li>
<li>Parrish, P. C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+synthetic+lethal+and+tumor+suppressor+paralog+pairs+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Discovery of synthetic lethal and tumor suppressor paralog pairs in the human genome.</a> Cell Rep. 36 (9), 109597(2021).</li>
<li>Najm, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthologous+CRISPR-Cas9+enzymes+for+combinatorial+genetic+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Orthologous CRISPR-Cas9 enzymes for combinatorial genetic screens.</a> Nat Biotechnol. 36 (2), 179-189 (2018).</li>
<li>Petroulia, S., et al. CRISPR-inhibition screen for lncRNAs linked to melanoma growth and metastasis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPetroulia%2C+S+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. , (2024).</li>
<li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nat Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).</li>
<li>New England Biolabs. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22NEBuilder+HiFi+DNA+Assembly+Reaction+%28E2621%29+v2%22">NEBuilder HiFi DNA Assembly Reaction (E2621) v2</a>. , (2020).</li>
<li>Cortés-Ríos, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+quantification+by+bicinchoninic+acid+%28BCA%29+assay+follows+complex+kinetics+and+can+be+performed+at+short+incubation+times%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Protein quantification by bicinchoninic acid (BCA) assay follows complex kinetics and can be performed at short incubation times.</a> Anal Biochem. 608, 113904(2020).</li>
<li>Junior, N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJunior%2C+N+%22Polyacrylamide+Gel+Electrophoresis+%28SDS-PAGE%29+v1%22">Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) v1</a>. , (2019).</li>
<li>Chen, X., Liu, J., Janssen, J. M., Gonçalves, M. A. F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chromatin+structure+differentially+impacts+high-specificity+CRISPR-Cas9+Nuclease+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Nucl+Acids%22%5BJournal%5D)">The chromatin structure differentially impacts high-specificity CRISPR-Cas9 Nuclease strategies.</a> Mol Ther Nucl Acids. 8, 558-563 (2017).</li>
<li>Schep, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+chromatin+context+on+Cas9-induced+DNA+double-strand+break+repair+pathway+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Impact of chromatin context on Cas9-induced DNA double-strand break repair pathway balance.</a> Mol Cell. 81 (10), 2216-2230.e10 (2021).</li>
<li>Daer, R. M., Cutts, J. P., Brafman, D. A., Haynes, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+chromatin+dynamics+on+Cas9-Mediated+genome+editing+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Syn+Biol%22%5BJournal%5D)">The impact of chromatin dynamics on Cas9-Mediated genome editing in human cells.</a> ACS Syn Biol. 6 (3), 428-438 (2017).</li>
<li>Chavez, M., Rane, D. A., Chen, X., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+expression+of+large+transgenes+via+the+knock-in+of+an+integrase-deficient+lentivirus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Stable expression of large transgenes via the knock-in of an integrase-deficient lentivirus.</a> Nat Biomed Eng. 7 (5), 661-671 (2023).</li>
<li>Ellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+and+variegation+of+gammaretrovirus+and+lentivirus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Silencing and variegation of gammaretrovirus and lentivirus vectors.</a> Human Gene Ther. 16 (11), 1241-1246 (2005).</li>
<li>Shrestha, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomics+and+epigenetics+guided+identification+of+tissue-specific+genomic+safe+harbors%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Genomics and epigenetics guided identification of tissue-specific genomic safe harbors.</a> Genome Biol. 23 (1), 199(2022).</li>
<li>Chu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+gene+transfection+and+induction+of+apoptosis+in+melanoma+cells+by+branched+poly%28%CE%B2-amino+ester%29s+with+uniformly+distributed+branching+units%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Enhanced gene transfection and induction of apoptosis in melanoma cells by branched poly(β-amino ester)s with uniformly distributed branching units.</a> J Control Release. 367, 197-208 (2024).</li>
<li>Han, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleofection+is+a+highly+effective+gene+transfer+techfnique+for+human+melanoma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Nucleofection is a highly effective gene transfer techfnique for human melanoma cell lines.</a> Exp Dermatol. 17 (5), 405-411 (2008).</li>
</ol>

Jochen Imig 目前由辉瑞公司（Pfizer Inc.）资助的 CGCIII 项目支持。CGCIII 由辉瑞公司（Pfizer Inc.）、默克公司（Merck KGaA）和阿斯利康公司（AstraZeneca PLC）赞助。赞助方在本研究的设计、实施、结果解读或论文撰写过程中均未参与。所有作者均无利益冲突需要披露。

在本研究中，我们利用来自两种正交物种的基于dCas9-KRAB-MeCP2的CRISPRi技术，在黑色素瘤细胞中实施了双长链非编码RNA（lncRNA）靶向策略。通过该系统，我们成功抑制了一对合成致死的lncRNA——RP11和XLOC，导致细胞死亡增加，而单独抑制时则未出现此效应。然而，CRISPRi系统存在脱靶基因抑制的风险，可能影响结果的解读。尽管未进行实验验证，我们在gRNA设计过程中通过in silico方法最大限度地减少了潜在的脱靶效应。
转导效率的差异可能影响实验的可重复性。因此，我们通过标准曲线校准不同浓度的慢病毒，确定其用量，从而实现等量慢病毒的转导优化。然而，新设计载体较大的载荷尺寸可能限制慢病毒的包装效率，进而降低转导效率，尤其是在难转导的细胞系中。因此，在某些情况下，为实现充分的转导和强效的dCas9表达，可能需要使用高滴度的病毒。此外，可通过定期监测dCas9-KRAB-MeCP2蛋白水平以及靶向lncRNA的RNA表达水平，以避免基因沉默效果不足的问题。或者，也可选用仅携带单一抑制系统的dCas9版本来克服这一局限，但其代价是抑制效率有所下降25。
只有 XLOC-sa-RP11-sp 组合表现出成功的活性，而相反的 XLOC-sp-RP11-sa 构型则无效。这种基因沉默效率差异的一个合理解释是 PAM 特异性与染色质可及性之间的相互作用33。由于 SaCas9 和 SpCas9 识别不同的 PAM 序列，XLOC-sp-RP11-sa 方向中 SpCas9 的靶位点可能缺乏最优的 PAM，从而降低其结合亲和力及后续活性。此外，两种 dCas9 融合蛋白变体的空间排列可能影响染色质结构和可及性34,35，可能限制了在 XLOC-sp-RP11-sa 构型中转录机器或相关调控因子的招募。这些发现表明，在特定基因组背景下，SaCas9 与 SpCas9 的相对位置可能对其功能效率产生关键影响，这一方面值得进一步研究，以优化基于 CRISPR 的调控策略。
通过修改双gRNA载体，该已建立的方案可适用于靶向或筛选其他合成致死的非编码RNA组合。一旦目标细胞系稳定表达两种dCas9变体，便可采用多种研究策略。尽管RNA干扰（RNAi）、反义寡核苷酸（ASOs）和短发夹RNA（shRNAs）均可用于基因沉默，CRISPR干扰（CRISPRi）则提供了一种更为简便的筛选方法，且其还可与小分子化合物或抑制剂联合使用。通过将双gRNA载体替换为双gRNA文库，本方案可实现对癌细胞中合成致死组合或其他遗传依赖关系的系统性筛选，从而提高靶向癌细胞的精确性。
尽管我们通过慢病毒转导实现了dCas9-KRAB-MeCP2变体的整合，但也可采用其他稳定的转染方法将所需酶导入501-mel细胞。这一点尤为重要，因为根据我们的经验，像dCas9-KRAB-MeCP2这样的大构建体可能会随着时间推移发生沉默36,37。相比之下，dCas9-KRAB已被证明是更小的替代方案23。根据我们的经验，使用来源于Cas9正交同源物的较小dCas9-KRAB融合蛋白进行转导，在长期培养过程中会导致蛋白表达水平降低（见补充图2）。因此，应定期在多个时间点持续监测蛋白表达的一致性。此外，同时转导两个大型融合蛋白、筛选标记以及双gRNA表达盒，可能引发细胞应激，或达到慢病毒包装容量的上限。
在双重CRISPRi中实现100%的基因敲低效率可能具有挑战性，原因包括gRNA设计次优或dCas9表达不足。为解决这一问题，应使用先进的设计工具针对每个靶点测试多个gRNA，以鉴定最有效的序列。此外，通过优化载体设计以及对单克隆细胞系进行表征，以增强dCas9-KRAB-MeCP2的表达，可提高基因敲低效率。
整合CRISPRi系统的替代策略包括使用转座酶载体或CRISPR引导的整合方法，以实现将系统稳定插入基因组的安全港位点，这些位点以能够长期维持稳定表达而著称38。然而，许多细胞类型（包括黑色素瘤细胞）转染难度较高39，因此慢病毒转导成为首选方法。通过电穿孔递送基于转座酶或Cas的酶可能为将dCas9-KRAB-MeCP2构建体整合到黑色素瘤细胞中提供另一种途径40。采用可诱导的基因敲除系统将具有优势，可根据需要激活dCas9-KRAB-MeCP2的表达，而非持续表达，从而最大限度地减少细胞应激。
最后，该方法不仅限于黑色素瘤细胞，还可推广至任何正在研究合成致死性的细胞类型。该方法明确旨在扩展为gRNA文库筛选模式。然而，由于组合复杂性增加，例如每个基因对需要超过三个gRNAs，并包含对照以及至少300倍覆盖深度，实际操作中仅能靶向表达lncRNA的一小部分转录组范围。因此，用户在进行文库筛选前，必须结合lncRNA的表达水平及其在特定细胞环境中的已知相关性等因素，谨慎预先筛选候选目标。尽管如此，该方法在组合上的灵活性使其成为研究多种癌症类型乃至其他疾病中lncRNA的合成致死相互作用及其他遗传依赖性的有力工具，从而拓展了目前可用于在细胞中研究此类网络相互作用的技术手段。

尽管人类基因组中编码蛋白质的序列不足3%，但约80%的基因组可被转录1,2。在非编码转录单位中，已有数万个被归类为长度超过200个核苷酸的长链非编码RNA（lncRNA），且人类lncRNA的总数估计超过100,000个3,4。与编码蛋白质的基因相比，lncRNA在不同物种间的保守性较低。鉴于人类与黑猩猩等灵长类动物共享99%的基因组序列，推测lncRNA在表型进化过程中可能发挥更为重要的作用5,6。这些发现表明lncRNA具有重要的细胞功能。尽管lncRNA的调控机制及其与RNA结合蛋白和其他RNA的相互作用尚未完全阐明，且许多lncRNA尚未被充分注释，但已明确lncRNA在健康和疾病状态（如癌症）中呈现细胞和组织特异性的表达模式7,8,9,10。lncRNA参与多种生物学功能，包括基因转录调控、染色质相互作用11、RNA加工12、RNA稳定性维持13以及翻译调控14。
在癌症中，高度多样化的细胞类型特异性长链非编码RNA通过调控基因表达影响肿瘤的发生和发展及转移，凸显了其作为重要治疗靶点的潜力15. 肿瘤样本中长链非编码RNA作为生物标志物的检测应用16靶向肿瘤特异性长链非编码RNA以破坏其下游功能，在临床应用和基础研究中均具有重要意义。用于阐明长链非编码RNA功能的RNA技术手段包括反义寡核苷酸（ASOs）、短发夹RNA和小干扰RNA（siRNAs）17,18尽管siRNA常用于基因沉默筛选，但基于siRNA的基因敲低作用局限于细胞质中19然而，lncRNA 通常在细胞核内发挥作用。
此外，成簇规律间隔短回文重复序列干扰（CRISPRi）可用于抑制人类癌症中的长链非编码RNA（lncRNA）20。而且，全基因组范围的CRISPRi筛选可轻松编程，靶向大量编码和非编码基因，以研究其功能影响21,22。在CRISPRi中，催化失活的Cas9（dCas9）与转录抑制结构域（如Krüppel相关盒（KRAB）结构域）融合23。dCas9-KRAB通过向导RNA（gRNA）引导至目标区域，实现基因的抑制。CRISPRi在DNA水平调控基因，相较于在转录后水平发挥作用的RNA干扰，具有更高的效率并可获得预期的基因功能缺失表型24。针对KRAB在靶基因沉默中效率有限的问题，已提出将KRAB与MeCP2共同与dCas9融合，作为一种更有效的抑制策略25。
尽管单个基因沉默可能影响癌细胞的存活性，但合成致死的双重或多重相互作用可能使癌细胞免于死亡26。合成致死涉及两个或多个基因，其中每一个基因均可补偿另一个基因的功能。为了克服单基因敲降筛选中存在的问题，靶向致死蛋白编码基因对的双重CRISPR策略提供了一种有前景的方法27。
本文介绍了一种在人黑色素瘤细胞中利用Staphylococcus aureus和Streptococcus pyogenes的dCas9蛋白（与KRAB-MeCP2融合）正交靶向长链非编码RNA（lncRNA）或其他非编码RNA成对位点的组合策略（见图1）。该方案可用于组合性经典CRISPR基因敲低，也可用于癌症中合成致死基因对的基于CRISPRi的筛选。在CRISPRi策略中使用两种不同的dCas9蛋白——SpCas9和SaCas9，可实现对不同基因组位点的独立靶向，交叉反应性极低，从而提高靶向特异性和实验灵活性，同时确保高靶向选择性。该系统利用不同的原间隔序列邻近基序（PAM）：NGG用于SpCas9，NNGRRT用于SaCas9。双dCas9系统解决了单一类型dCas9使用过程中sgRNA兼容性受限的问题，通过实现精确且同步的调控，并减少sgRNA与核糖核蛋白复合物（RNP）之间的竞争，提升了双sgRNA文库筛选的稳健性和适用性。综上所述，我们提供了一种在黑色素瘤细胞中完全可用的双CRISPRi系统，作为癌症研究的模型工具。
<img alt="包含重叠延伸、慢病毒转导、双gRNA和合成致死性的基因编辑示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67752/67752fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：靶向非编码RNA合成致死相互作用的双CRISPRi系统示意图。（A）双gRNA载体的克隆流程。（B）将包膜质粒VSV-G、包装质粒PAX2和转移载体共转染HEK293细胞，以产生慢病毒，随后转导至501-mel细胞中。携带SpdCas9-KRAB-MeCP2（蓝色）和SadCas9-KRAB-MeCP2（红色）遗传信息的慢病毒同时整合进入501-mel细胞。经抗生素筛选后，进行第二次慢病毒转导，以整合所需的双gRNA（橄榄绿色）。（C）表达dCas9变体的501-mel细胞与其对应的gRNA相互作用，从而沉默靶基因表达，导致癌细胞死亡。图片由BioRender.com生成。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/67752fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>Amicon Ultra 离心滤器，100 kDa 截留分子量</td><td>Millipore</td><td>UFC910024</td><td></td></tr><tr><td>抗 Cas9（S. aureus）(6H4) 小鼠单克隆抗体</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>48989</td><td></td></tr><tr><td>抗 Cas9（S. pyogenes）(7A9-3A3) 单克隆抗体</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>14697</td><td></td></tr><tr><td>抗 GAPDH 小鼠单克隆抗体&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8795</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 IgG（全分子）&amp;ndash;兔来源辣根过氧化物酶标记抗体</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9044</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad ChemiDoc MP 成像系统&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>盐酸杀稻瘟菌素 S</td><td>Sigma Aldrich</td><td>15205-25MG</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo 发光法细胞活力检测试剂盒</td><td>Promega</td><td>G7570</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td></td></tr><tr><td>CFX Connect 实时荧光定量 PCR 检测系统</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clarity 西部印迹 ECL 底物，500 mL</td><td>Bio-Rad</td><td>1705061</td><td></td></tr><tr><td>CO2 培养箱 CB 170 型</td><td>Binder</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cOmplete 蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Roche</td><td>11697498001</td><td></td></tr><tr><td>Esp3I (BsmB1) 限制性内切酶</td><td>Thermo Scientific</td><td>ER0451</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 10 mL 移液管</td><td>Corning</td><td>356551</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 25 mL 移液管</td><td>Corning</td><td>357525</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 5 mL 移液管</td><td>Corning</td><td>356543</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F9665-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Dulbecco&amp;rsquo;s 改良 Eagle&amp;rsquo;s 培养基（DMEM），高糖型，含丙酮酸钠</td><td>Gibco</td><td>41966029</td><td></td></tr><tr><td>人黑色素瘤细胞系 501-mel</td><td>由纽约大学 Aifantis 实验室惠赠</td><td>RRID: CVCL_4633</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon-P PVDF 膜</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Lenti-X 293T HEK 细胞系</td><td>Takara Bio</td><td>632180</td><td></td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot 转印系统&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra 手动灌胶系统</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NEBuilder HiFi DNA 组装反应体系&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>E2621</td><td></td></tr><tr><td>脱脂奶粉&amp;nbsp;</td><td>Biomol</td><td>54650</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE LDS 上样缓冲液 (4x)</td><td>Invitrogen</td><td>NP0008</td><td></td></tr><tr><td>One Shot Stbl 化学感受态 E. coli</td><td>Invitrogen</td><td>C737303</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I 低血清培养基</td><td>Gibco</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>PCR 管 0.5 mL（平盖）</td><td>VWR International</td><td>732-3207</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 (PBS)</td><td>Corning</td><td>45000-446</td><td></td></tr><tr><td>Phusion 高保真 PCR 预混液（含 HF 缓冲液）</td><td>Thermo Scientific</td><td>F531L</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA 蛋白定量检测试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>聚凝胺</td><td>Sigma Aldrich</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>支化聚乙烯亚胺</td><td>Sigma Aldrich</td><td>408727</td><td></td></tr><tr><td>盐酸嘌呤霉素</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-108071A</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR 纯化试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>SafeSeal 微量离心管 1.5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72,706</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠 5 M 水溶液，无 RNase</td><td>Alfa Aesar</td><td>J60434.AE</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠 (SDS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>针头式过滤器 PES 33 mm 0.2 &amp;mu;M</td><td>Fisher Scientific</td><td>15206869</td><td></td></tr><tr><td>TC 培养皿 100，标准型</td><td>Sarstedt</td><td>8,33,902</td><td></td></tr><tr><td>TC 培养板 6 孔，标准型，F</td><td>Sarstedt</td><td>83,39,20,005</td><td></td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>Roche</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416-50ML</td><td></td></tr></tbody></table>

靶向癌细胞中非编码rna之间合成致死相互作用的双重crispr干扰策略

Dual CRISPR-Interference Strategy for Targeting Synthetic Lethal Interactions Between Non-Coding RNAs in Cancer Cells

长链非编码RNA（lncRNA）是一类数量庞大且功能多样的RNA分子，在人类基因组中预测存在超过10万个。尽管lncRNA在不同物种间的保守性低于蛋白质编码基因，但其在基因调控、染色质相互作用以及癌症进展中发挥着关键作用。由于lncRNA参与癌症的发生发展，使其成为极具潜力的治疗靶点。CRISPR干扰技术（CRISPRi）利用与转录抑制结构域（如KRAB-MeCP2）融合的无催化活性Cas9蛋白，可实现对细胞核内lncRNA的精确靶向并评估其功能。本研究介绍了一种基于dCas9-KRAB-MeCP2的双系统CRISPRi技术，该系统整合了来自金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes）的正交CRISPRi体系，并针对人黑色素瘤细胞中lncRNA的联合靶向进行了优化。该实验方案支持lncRNA成对基因的组合性敲低或合成致死筛选，为癌症研究提供了新的工具。通过探索lncRNA之间的合成致死关系，该方法有助于识别对癌细胞存活至关重要的lncRNA相互作用，从而提出新的治疗策略。本文验证了该双系统的技术可行性，突显其在发现癌症特异性关键lncRNA相互作用方面的应用潜力。

使用等量的慢病毒转导，将SadCas9-KRAB-MeCP2和SpdCas9-KRAB-MeCP2的表达盒同时整合到501-mel细胞中。由于该CRISPRi方案依赖于dCas9-KRAB-MeCP2变体的表达，因此蛋白质印迹分析是确认其在蛋白水平表达的理想方法。在富集成功转染的细胞后，收集样品进行蛋白质印迹分析，以确认dCas9-KRAB-MeCP2同源蛋白的存在。转导成功后，应出现对应于SpdCas9-KRAB-MeCP2融合蛋白（202 kDa）和SadCas9-KRAB-MeCP2融合蛋白（170 kDa）的单一条带，并已通过针对相应Cas9同源蛋白的特异性抗体得到验证，如图2A所示。然而，若无法进行蛋白质印迹分析，也可采用qPCR在mRNA水平上验证融合蛋白的存在。
在构建了稳定表达功能性抑制因子的501-mel细胞后，使用双gRNA载体进行了第二次慢病毒转导。先前研究表明，RP11和XLOC在转移性黑色素瘤的短期培养物中表达上调，单个CRISPRi靶向实验证实了它们对细胞增殖和存活的影响28。因此，我们选择这对长链非编码RNA作为概念验证的合成致死非编码RNA组合进行评估，预期在修饰后的细胞中观察到累积性的、易于检测的生长表型。
为了利用细胞活力检测研究双重CRISPRi在癌细胞中的效应，必须有效抑制两个靶向的长链非编码RNA（lncRNA）。通过检测其转录本水平，qPCR是最适合用于验证该抑制效果的方法。我们通过测定RNA水平并分析靶向可能具有致死效应的RP11和XLOC基因对时的细胞活力，评估了所建立的双重CRISPRi方案的功能性。因此，引入了不同的靶向RP11和XLOC的gRNA以降低靶标RNA的表达水平。使用靶特异性的gRNA分别针对SadCas9-KRAB-MeCP2或SpdCas9-KRAB-MeCP2进行测试，单独使用及联合使用，并设置靶向Rosa26的对照gRNA进行比较（见图2B）。尽管单独靶向XLOC或RP11的gRNA均能有效抑制各自的目标RNA，但只有在使用XLOC-sa/RP11-sp组合时，才能实现对XLOC和RP11的同步敲低。
由于在501-mel细胞系中，选定的XLOC-sa/RP11-sp gRNA组合已成功降低XLOC和RP11 RNA的表达水平，因此进行了双长链非编码RNA抑制的细胞活力检测（见图2C）。在转染5天后，当单独使用靶向gRNA时，细胞活力分别为Rosa26对照组的81%和89%。联合使用RP11-sp与XLOC-sa导致细胞活力进一步显著降低，相较于单独使用RP11-sp，细胞活力降至Rosa26对照组的59%。
<img alt="Western blot 及条形图显示基因编辑分析中的 RNA 表达与发光强度" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67752/67752fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2双长链非编码RNA抑制系统的功能。 (A) 采用抗Cas9抗体通过Western blot分析检测经修饰的501-mel细胞中dCas9-KRAB-MeCP2变体的表达。未进行转导的501-mel野生型（WT）细胞作为对照 （参见补充图3、补充图4、补充图5、补充图6 （用于原始印迹图）。B) 转导双gRNA至经修饰的501-mel细胞后，以Rosa26对照细胞为参照，通过qPCR分析RP11和XLOC的RNA水平。GAPDH作为内参基因。数据表示为均值 ± 标准差。C双长链非编码RNA抑制活力检测在将双gRNA整合到经修饰的501-mel细胞中后进行，共进行了三次独立的转导实验。发光值经Rosa26对照组归一化处理。活力结果以均值（n = 3）± 标准误表示。采用非配对t检验进行统计分析。星号（*）表示p < 0.05时具有显著差异。 &lt; 0.05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/67752fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
补充图1：质粒图谱。 该图谱使用Benchling（https://benchling.com/）绘制。本实验方案中使用的质粒由Addgene #96921和#110824改造而来。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Figure%201.tif" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图2：补充图2：Western blot分析 
dCas9-KRAB 表达. (A) 转染后6天501-mel细胞中SadCas9-KRAB的表达。B在501-mel细胞中依次转导SadCas9-KRAB和SpdCas9-KRAB，导致转染后3周SadCas9-KRAB表达降低。C在501-mel细胞中同时转导SadCas9-KRAB和SpdCas9-KRAB，转染3周后SadCas9-KRAB的表达降低。D) 可观察到在同时转导SadCas9-KRAB和SpdCas9-KRAB慢病毒（LV）后，SpdCas9-KRAB的表达。所用慢病毒的体积为 µL. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Figure%202.tif" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>
补充图3：SaCas9-KRAB 蛋白质印迹原始数据。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Figure%203_SaCas9-KRAB%20raw%20data.tif" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图4：SpCas9-KRAB 西部印迹原始数据。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Figure%204_SpCas9-KRAB%20raw%20data.tif" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图 5：GAPDH_SpCas9-KRAB 原始数据。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Figure%205_GAPDH_SpCas9-KRAB%20raw%20data.tif" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图6：GAPDH_SaCas9-KRAB 原始数据。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Figure%206_GAPDH_SaCas9-KRAB%20raw%20data.tif" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充表1：使用的向导RNA序列。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Table%201_RE.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充表 2：使用的 DNA 序列。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Table%202_RE.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件 1：dual-grna-zeo-gfp 的 FASTA 文件。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Data%201_dual-grna-zeo-gfp.fasta" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件 2：dSpCas9-krab-mecp2 的 FASTA 文件。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Data%202_dSpCas9-krab-mecp2.fasta" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件 3：dSaCas9-krab-mecp2 的 FASTA 文件。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Data%203_dSaCas9-krab-mecp2.fasta" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本研究介绍了一种靶向黑色素瘤细胞中长链非编码RNA的双CRISPRi系统。该系统可实现基因的组合性敲低和合成致死筛选，从而鉴定出癌症特异性的lncRNA相互作用，为潜在的治疗策略提供依据。

靶向癌细胞中非编码RNA之间合成致死相互作用的双重CRISPR干扰策略

长链非编码RNA（lncRNAs）是一类数量庞大且功能多样的RNA分子，人类基因组中预测存在超过100,000种。尽管……

我们的目标是系统性地识别并以治疗方式靶向癌症中关键的网络枢纽，重点关注非编码RNA。当前实验方法面临的挑战在于需要具备组合能力，以并行生成和筛选大量基因。我们致力于探索新途径，以发现新型的组合式非编码RNA靶点或可成药的结构，从而克服耐药性和治疗逃逸问题。未来，我们将把这一概念验证工具应用于大规模组合文库筛选，可能结合体外和体内RNA结合蛋白进行研究。使用台盼蓝染料在血细胞计数板中开始计数Lenti-X 293T HEK细胞。每10厘米培养皿接种4×10⁶个Lenti-X 293T HEK细胞，培养至次日细胞融合度达到约80%。从这一步开始，在二级实验室中操作。将500微升合适的转染培养基与转移载体、包膜质粒和pPAX2载体混合。室温下孵育混合物5分钟。在另一个离心管中，将500微升低血清培养基与36微升浓度为1毫克/毫升的PEI试剂混合。室温孵育5分钟。将两种混合液合并，室温孵育15分钟。现在小心地将混合物逐滴加入含有六毫升的细胞培养基中，并在5%二氧化碳条件下于37摄氏度孵育过夜。12至15小时后，使用血清移液管将培养基弃入可高压灭菌的废液瓶中。在将耗材（包括血清移液管和移液器吸头）丢弃至高压灭菌废液容器前，需先用消毒液冲洗。使用新的移液管向转染后的细胞中加入五毫升新鲜 DMEM。为了收获慢病毒，在转染后 48 小时，用血清移液管将上清液转移至一个 50 毫升的离心管中。然后向细胞中加入 5 毫升新鲜培养基，并继续孵育 24 小时。将试管置于冰箱中保存。孵育后，重复收集慢病毒，并与之前收集的样品混合。第三次收获后，将三次收获的上清液合并，并于4 °C保存，直至进行过滤和离心。将合并的上清液在气溶胶密闭容器和适用于生物安全二级病原体的转子中，于4摄氏度下以500 × g离心5分钟，然后通过0.2微米无菌细胞培养级针筒滤器过滤上清液。使用截留分子量为100千道尔顿的离心过滤装置，在4摄氏度下以1000 × g浓缩过滤后的上清液至约500微升。将50至100微升的病毒分装样品于-80摄氏度保存，直至后续使用。转导前一天，将501-mel细胞以每孔2 × 10⁵个细胞的密度接种于6孔板中，每孔终体积为2毫升。从此步骤开始，在二级生物安全实验室中操作。更换培养基为2毫升预热的DMEM，其中添加polybrene，终浓度为6 µg/mL。将50微升制备好的SPD和SAD慢病毒同时逐滴加入细胞中。轻轻摇动培养板，并在37摄氏度、5%二氧化碳气氛中孵育。转导后16小时，使用血清移液管将培养基弃入可高压灭菌的瓶子中。加入2毫升含有10微克/毫升杀稻瘟菌素（Blasticidin）和2微克/毫升嘌呤霉素（puromycin）的新鲜培养基。转导后两天重复更换培养基步骤，转导七天后在S1条件下处理转导细胞。转导七天后，将0.1 × 10⁵个稳定转染了SadCas9 KRAB和Sp-dCas9-KRAB的细胞接种至96孔板中，每孔加入100微升预热的DMEM培养基。转导当天，将培养基更换为100微升预热的DMEM，其中添加聚凝胺至终浓度为6微克/毫升。向细胞中加入适当体积的慢病毒，然后将培养板放入培养箱孵育。16小时后，更换为含有Zeocin、Blasticidin和嘌呤霉素的新鲜培养基。转导后第五天，按照制造商说明书使用细胞活力检测试剂盒进行发光检测。外周血分析证实，在转导的501-mel细胞中，SpdCas9和SadCas9融合蛋白成功表达。定量聚合酶链式反应分析显示，利用特异性向导RNA可有效敲低长链非编码RNA RP11和XLOC，但仅有XLOC-sa和RP11-sp组合能够同时抑制两个靶点。使用 XLOC-sa 和 RP11-sp gRNA 配对对 RP11 和 XLOC 进行双重抑制后，与对照组相比，501-mel 细胞活力显著降低至 59%。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

靶向癌细胞中非编码 RNA 之间合成致死相互作用的双重 CRISPR 干扰策略

CRISPR/Cas9 是一种强大的系统，可用于破坏基因和遗传元件。本文介绍了一种利用 CRISPR/Cas9...

利用CRISPR/Cas9在哺乳动物细胞系中产生基因组缺失

CRISPR/Cas9 系统有望使靶向基因组编辑技术在科学界变得易于获取且成本低廉。本实验方案旨在演示如何利用 CRISPR/Cas9...

高滴度CRISPR逆转录病毒与慢病毒的设计、包装及通过立体定位注射递送

近年来，在体细胞系中进行基因操作的能力取得了显著进展，为基础研究和应用研究带来了巨大潜力。本文介绍了两种在哺乳动物细胞系中利用CRISPR/Cas9技术生成基因敲除并进行筛选的方法，一种使用可选择标记，另一种则不使用可选择标记。...

基于选择依赖性与非依赖性的CRISPR/Cas9介导的哺乳动物细胞基因敲除生成方法

关键词：CRISPR/Cas9，基因敲除，哺乳动物细胞，选择标记，非选择性筛选，基因编辑

本方案概述了一种基于CRISPR/Cas9的基因编辑系统，用于修复哺乳动物细胞中的点突变。在此，我们采用组合式基因编辑方法，并结合详细的后续实验策略，以检测靶位点处的插入缺失（indel）形成情况——实质上是对靶位点的诱变效应进行分析。...

一种检测人细胞中CRISPR/Cas9与单链寡脱氧核苷酸介导的定点突变修复所致原位诱变性的标准方法

CRISPR-Cas9 技术提供了一种高效的方法，可精确编辑任何细胞类型的哺乳动物基因组，并代表了一种进行全基因组遗传筛选的新手段。本文提供了一个详细方案，阐述了成功实施混合式全基因组 CRISPR-Cas9...

哺乳动物细胞中基于CRISPR的 pooled 遗传筛选

直接递送预先组装的Cas9/向导RNA核糖核蛋白复合物是实现造血细胞基因组编辑的一种快速高效的方法。在此，我们利用该方法删除RUNX1基因内含子中的沉默子，并检测OCI-AML3白血病细胞中的转录应答。...

利用 CRISPR/Cas9 核糖核蛋白在急性髓系白血病细胞中研究 RUNX1 内含子沉默子的转录调控作用

在模式生物中进行的大规模遗传筛选已促成负性遗传相互作用的发现。本文介绍了一种数据整合工作流程，利用模式生物遗传筛选的数据，系统解析靶向癌症中合成致死相互作用的药物组合。...

一种用于识别靶向合成致死相互作用药物组合的数据整合工作流程

本方案描述了一种高通量的成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）基因编辑工作流程，用于微小RNA（miRNA）簇网络分析，可在单次实验中快速构建一系列基因修饰的细胞系，这些细胞系携带不同miRNA簇成员的特异性缺失组合，缺失片段长度可达35...

用于微小RNA簇网络分析的CRISPR基因编辑工具

CRISPR等技术面临的一个重大障碍是脱靶效应，其可能破坏重要基因。“环化用于 体外...

使用CIRCLE-Seq检测基因编辑脱靶效应

THP-1细胞系被广泛用作研究人类单核细胞/巨噬细胞在各个生物学相关研究领域中功能的模型。本文介绍了一种高效的基于CRISPR-Cas9的基因编辑和单细胞克隆分离方案，可实现稳定且可重复的表型数据的获取。...

基于电穿孔的CRISPR-Cas9介导的THP-1细胞基因敲除及单细胞克隆分离

通过应用全基因组CRISPR/Cas9筛选方法，系统而严谨地筛选辐射抗性与敏感性相关基因。该方案还可作为研究临床用药化学药物耐药机制的通用框架，适用于其他相关研究工作。...

全基因组CRISPR筛选揭示放射敏感与放射耐受基因

了解双重CRISPR干扰策略在黑色素瘤细胞中靶向长链非编码RNA的合成致死相互作用。该方法通过组合基因敲低筛选，识别癌症特异性lncRNA互作网络，为克服肿瘤耐药性提供新的治疗靶点。

靶向癌细胞中非编码RNA之间合成致死相互作用的双重CRISPR干扰策略

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