靶向癌细胞中非编码 RNA 之间合成致死相互作用的双重 CRISPR 干扰策略
2025年5月30日
本研究提出了一种靶向黑色素瘤细胞中长非编码 RNA 的双 CRISPRi 系统。它支持组合基因敲低和合成致死筛选，为潜在的治疗策略识别癌症特异性 lncRNA 相互作用。
我们的目标是系统地识别和治疗靶向关键网络枢纽，重点是癌症中的非编码 RNA。我们方法目前的实验挑战在于并行生成和筛选大量基因所需的组合能力。我们的目标是为识别新的组合非编码 RNA 靶标或可成药结构铺平道路，以规避耐药性和治疗逃逸。
未来，我们会将这种概念验证工具转化为大规模的组合文库筛选工作，可能在体外和 RNA 结合蛋白相结合。首先在血细胞计数器中使用台盼蓝染料对 Lenti-X 293T HEK 细胞进行计数。以每 10 厘米板 6 个 Lenti-X 293T HEK 细胞的幂 4 乘以 10 次方进行铺板，并在第二天孵育以达到约 80% 的汇合度。
从这一步开始，在 2 类实验室工作。将 500 μL 合适的转染培养基与转移载体、包膜质粒和 pPAX2 载体混合。在室温下孵育混合物 5 分钟。
在单独的试管中，将 500 μL 还原血清培养基与 36 μL PEI 试剂以 1 mg/mL 浓度混合。在室温下孵育混合物 5 分钟。混合两种混合物，在室温下孵育 15 分钟。
现在小心地逐滴将混合物添加到含有 6 毫升的细胞培养基中，并在 37 摄氏度下在 5% 二氧化碳中孵育过夜。12 至 15 小时后，使用血清移液管将培养基丢弃到可高压灭菌的废液瓶中。在将耗材丢弃在高压灭菌器废液中之前，先用消毒剂溶液冲洗耗材，包括血清移液器和移液器吸头。
使用新移液管向转染的细胞中加入 5 毫升新鲜 DMEM。要收获慢病毒，请在转染后 48 小时使用血清移液管将上清液转移到 50 mL 经典管中。然后向细胞中加入 5 mL 新鲜培养基，再孵育 24 小时。
将试管存放在冰箱中。孵育后，重复慢病毒的收集并将其与之前收集的样品混合。第三次收获后，储存将所有三次收获的上清液在 4 摄氏度下混合，直至过滤和离心。
将复合上清液在 500 G 和 4 摄氏度下离心到经批准用于风险组 2 生物体的气密容器和转头中 5 分钟，然后通过 0.2 微米无菌细胞培养级针头过滤器过滤上清液。使用截留分子量为 100 千道尔顿的离心过滤装置将过滤后的上清液浓缩在 1000 G 和 4 摄氏度下，至约 500 微升。将 50 至 100 微升的病毒等分试样储存在零下 80 摄氏度，以备进一步使用。
在转导前一天，将 501-mel 细胞以 2 倍 10 的倍数接种在六孔板中，达到每孔 5 个细胞的幂，最终培养体积为 2 毫升。用 2 毫升预热的 DMEM 替换培养基，并补充有 6 μg/mL 终浓度的聚凝胺。从这一步开始，在 2 类实验室工作。
同时向细胞中滴加 50 微升制备的 SPD 和 SAD 慢病毒。轻轻摇晃板，并在 37 摄氏度的 5% 二氧化碳气氛中孵育。转导后 16 小时，使用血清移液管将培养基丢弃到可高压灭菌的瓶子中。
加入 2 毫升新鲜培养基，每毫升含有 10 μg 杀稻瘟菌素和 2 μg/mL 嘌呤霉素。两天后重复培养基更换步骤，并在转导后 7 天后在 S1 条件下处理转导的细胞。转导后 7 天，将含有稳定转染的 SadCas9 KRAB 和 Sp-dCas9-KRAB 的 5 个细胞的 0.1 倍 10 次，接种在含有 100 微升预热 DMEM 的 96 孔板中。
在转导当天，用 100 μL 预热的 DMEM 替换培养基，并补充有 6 μg/mL 的聚凝胺。向细胞中加入适当体积的慢病毒并孵育板。16 小时后，用含有 Zeoin、杀稻瘟菌素和嘌呤霉素的新鲜培养基更换培养基。
根据制造商的说明，在转导后 5 天使用细胞活力测定法进行发光检测。Western 血液分析证实 SpdCas9 和 SadCas9 融合蛋白在转轴 501-mel 细胞中成功表达。定量聚合酶链反应分析显示，使用特异性向导 RNA 有效敲低单个长链非编码 RNA RP11 和 XLOC，但只有 XLOC-sa 和 RP11-sp 对成功同时抑制了两个靶标。
与对照相比，使用 XLOC-sa 和 RP11-sp GRNA 对 RP11 和 XLOC 的双重抑制显着将 501-mel 细胞活力降低至 59%。
概览
本研究提出了一种针对黑色素瘤细胞中长链非编码RNA的双重CRISPRi系统。它能够实现组合基因敲低和合成致死筛选，识别癌症特异性长链非编码RNA相互作用，用于潜在的治疗策略。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 肿瘤学
- 遗传学
背景
- 长链非编码RNA（lncRNA）在癌症生物学中扮演着关键角色。
- 靶向lncRNA可能为黑色素瘤提供新的治疗策略。
- 当前的方法在组合基因靶向方面面临挑战。
- CRISPRi技术为基因敲低提供了一种有前景的方法。
研究目的
- 识别并针对黑色素瘤中关键的lncRNA网络中心进行治疗靶向。
- 开发双重CRISPRi系统以实现组合基因敲低。
- 探索克服癌症治疗耐药性的潜在治疗策略。
使用的方法
- 用CRISPRi组件转染Lenti-X 293T HEK细胞。
- 收集并浓缩慢病毒用于转导。
- 用双重导向RNA转导黑色素瘤细胞。
- 评估细胞活力和基因敲低效率。
主要结果
- 在黑色素瘤细胞中成功表达SpdCas9和SadCas9融合蛋白。
- 使用特定的导向RNA有效敲低lncRNA RP11和XLOC。
- RP11和XLOC的组合性抑制显著降低了细胞活力。
- 识别了潜在的lncRNA相互作用以用于治疗靶向。
结论
- 双重CRISPRi系统在靶向黑色素瘤中的lncRNA方面是有效的。
- 组合方法可能增强针对癌症的治疗策略。
- 需要进一步研究以探索这些发现的临床意义。
常见问题
Executive Industry Relevance
Combinatorial targeting of long non-coding RNAs (lncRNAs) using dual CRISPR interference (CRISPRi) enables systematic interrogation of synthetic lethal interactions in cancer cells. This approach addresses the challenge of identifying critical non-coding RNA network hubs that drive cancer cell survival and therapeutic resistance. The dual CRISPRi system enhances predictive confidence in target validation and supports risk-adjusted portfolio decisions in oncology discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional interrogation of lncRNA pairs to clarify their roles in cancer cell viability.
- Supports biological de-risking by identifying synthetic lethal interactions among non-coding RNAs.
- Facilitates prioritization of lncRNA targets for further mechanistic and therapeutic exploration.
Screening & Assay Development
- Prepares validated melanoma cell systems for combinatorial gene knockdown screens.
- Delivers reproducible and quantitative viability readouts for robust assay development.
- Enables scalable screening of lncRNA interactions using orthogonal CRISPRi technologies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models by targeting cancer-specific lncRNA interactions.
- Provides continuity from discovery-stage synthetic lethality screens to preclinical validation of candidate targets.
- Supports translational biomarker identification by linking lncRNA function to cell survival phenotypes.
Pipeline & Workflow Integration
This dual CRISPRi strategy integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling high-confidence target validation and combinatorial screening in cancer models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of lncRNA function and network dependencies in cancer cells.
- Screening: Provides assay-ready systems for combinatorial synthetic lethal screens with quantitative viability outputs.
- Analytics: Generates statistical measurements of cell viability and gene knockdown efficiency for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical studies by identifying lncRNA interactions relevant to cancer progression.
- Enterprise Reuse: Establishes a modular platform for iterative combinatorial screening across diverse lncRNA targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in lncRNA target validation and synthetic lethality mapping.
- Operational Value: Standardizes combinatorial gene knockdown workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by de-risking target selection and prioritizing actionable lncRNA interactions.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement of novel non-coding RNA targets in oncology pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in CRISPRi design, lentiviral production, and cell-based screening.
- Demands access to molecular biology infrastructure and quantitative viability assays.
- Necessitates cross-team standardization of guide RNA design and assay protocols.
- May require adaptation for different cancer cell models or lncRNA targets.
- Dependent on robust statistical analysis to interpret synthetic lethal interactions.
