Name: 早期斑马鱼幼虫的小分子筛选和毒性试验 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-07T14:10:00.000+00:00
Duration: 2 min 52 s
Description: 学习在斑马鱼幼虫中进行小分子药物筛选与毒性评估的实验方法。本研究利用3-7天受精后Danio rerio幼虫，通过形态学评分系统分析化学处理诱导的表型变化，为发育生物学和药理学研究提供可靠的毒性筛选框架。

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作者得到ZeEBRA（R&amp;#38;I-2019-018)，一个&#160;技术开发计划（TDP）基金，STRONG（R&amp;#38;I-2024-007L)，一个&#160;TDPLite 基金，NASDAC（SINO-MALTA-2022-08），一项科学技术合作资助项目，以及 DEMONSTRATE（R&amp;#38;I-2018-007A），以及由XjenzaMalta代表科学与技术基金会资助的Go2Market项目。 图1 使用 BioRender 制作。

斑马鱼的处理遵循欧盟指令 2010/63/EU。所有实验均经马耳他大学学院研究伦理委员会（FREC）以及联合 FREC 动物研究部门小组委员会（JFARSS）批准。本方案的流程图见图 1。
1. 卵的产生、收集与维持
<ol>
	<li>在交配前一天将鱼放入繁殖缸中，至少在最后一次喂食后一小时开始，并用隔板将雄鱼和雌鱼分隔开。为获得更好的产卵效果，建议使用较高比例的雌鱼与雄鱼。将鱼放置在具备14小时光照与10小时黑暗循环、环境温度为27–28 °C的房间内。 
	注意：1 L的繁殖缸可容纳三条成年鱼，而1.7 L的繁殖缸可容纳五条成年鱼。</li>
	<li>次日早晨，在光照开始后，更换繁殖缸中的水并移除隔板。若繁殖缸本身不具备倾斜结构，应将其置于倾斜位置，以确保提供浅水区域促进交配。若产卵和交配活动较慢，每45分钟更换一次繁殖缸中的水。让鱼交配最多3小时，或根据需要调整时间。</li>
	<li>交配完成后，轻轻挤压未产卵的雌鱼，以防止长期滞卵。随后将鱼放回各自原来的饲养缸中。</li>
	<li>使用滤网收集繁殖缸中的卵，用胚胎培养水（E3）冲洗后，转移至含E3的培养皿中。配制E3的方法：将&#160;16.67 mL的60×E3溶液（300 mM NaCl；10 mM KCl；20 mM CaCl2·2H2O；20 mM MgSO4·7H2O）与&#160;1 mL的0.01%亚甲蓝溶液混合，再加入982 mL去离子水。清除未受精的卵或杂质。确保培养皿不拥挤，每只100 mm × 15 mm培养皿中放置50枚卵，每只150 mm × 15 mm培养皿中放置120枚卵。</li>
	<li>将卵置于设定为28.5 °C并配备14小时光照与10小时黑暗循环的培养箱中孵育。在受精后第1天（1 dpf），更换新鲜E3溶液，并清除不可存活的卵，以抑制真菌生长。</li>
</ol>
2. 测试板制备
<ol>
	<li>在受精后3天（3 dpf），使用设定为100 µL体积的1,000 µL微量移液器，将一个外观健康的已孵化胚胎转移至96孔板的每个孔中。 
	注意：不应使用未孵化的胚胎，因为这可能导致化合物吸收量不一致。选择外观健康的胚胎也有助于在测试过程中减少偏差。移液器吸头的尺寸可便于轻松收集斑马鱼胚胎，同时不会造成物理损伤。此外，与移液管相比，微量移液器能够更精确地控制加入孔中的液体体积。</li>
	<li>在12孔板中，将每种待测化学物质的不同目标浓度分别加入不同的孔中（例如，博舒替尼的浓度范围为100 µM至6.25 µM）。使用微量移液器向各孔中加入所需体积的待测化学物质，并用E3培养基补足至2.4 mL。 
	注意：应通过文献检索确定待测化学物质的合适浓度范围。若无相关资料，可尝试多个浓度，直至确定适宜的浓度范围。至少应使用五个浓度，其中最高浓度应导致100%死亡率，最低浓度则不应引起任何可观察到的效应7。</li>
	<li>根据用于溶解原液待测化学物质的溶剂，设置相应的溶剂对照组。 
	注意：许多待测化合物不溶于水，因此需要溶解于特定溶剂（&#34;载体&#34;），如乙醇或二甲基亚砜（DMSO），以形成水溶液。当使用DMSO作为溶剂对照时，其浓度最好不超过1%，该浓度已被证实对斑马鱼是安全的14。</li>
	<li>使用200 µL微量移液器吸除96孔板中现有的E3溶液，并替换为100 µL相应的待测培养基。确保每个浓度下测试总共24条幼鱼。可使用单通道或8通道200 µL微量移液器将待测化学物质转移至对应的测试板孔中。需包括对照组（如E3培养基、化学溶剂对照、阳性对照等）。 
	注意：该板设计最多可容纳四种不同的待测化学物质，或同一种化学物质的四种不同浓度。图1展示了针对同一种化学物质（例如博舒替尼）的五个浓度进行测试并包含对照组的示例布局。</li>
	<li>暴露后24小时，进行形态学评分（如第3节所述），并进行半量换液，移除50 µL培养基，补充等体积新配制的培养基。在此过程中移除并记录所有死亡幼鱼。将幼鱼置于设定为28.5 °C、具有14小时光照/10小时黑暗循环的培养箱中继续培养。重复上述操作直至7 dpf。</li>
</ol>
3. 形态学评估
<ol>
	<li>使用体视显微镜，在适当的放大倍数下观察各个测试幼鱼。 
	注：可评估的形态学缺陷示例见表1。</li>
	<li>由两位独立评分者对形态学表型进行评估；若两人意见不一致，则由第三位评分者裁定。</li>
	<li>采用二元评分法（即“存在/不存在”）进行形态学评分，其中“不存在”表示形态正常（记为“0”），“存在”表示出现形态异常（记为“1”）。图2展示了药物暴露2天后5日龄斑马鱼的表型示例，包括未受影响的斑马鱼（图2A）、轻度心包水肿的斑马鱼（图2B）、伴有卵黄囊出血和卵黄延伸的重度心包水肿（图2C）、发育迟缓且色素减少、 swim bladder 缺失及总长度缩短（图2D）、卵黄囊肿胀并尾鳍弯曲（图2E）、尾鳍缺失（图2F）、脊索弯曲（图2G）、身体截短（图2H）以及因坏死而死亡的个体（图2I）。所有异常表型均记为“1”，未受影响的斑马鱼记为“0”。</li>
</ol>
4. 半数致死浓度（LC50）测定
<ol>
	<li>完成形态学评估后，绘制7 dpf时累积死亡率百分比随浓度变化的曲线图，示例见图3。利用该浓度曲线估算引起50%死亡率的浓度。</li>
	<li>在估算出LC50浓度后，通过将24个重复的幼虫置于96孔板中并暴露于该估算的单一LC50浓度下，重复上述实验。</li>
</ol>
5. 技术重复
<ol>
	<li>在另外两个不同的时间点，至少重复两次使用相同化学物质的选定五种浓度进行整个实验过程，以确保结果具有可重复性。</li>
</ol>

<ol><li>Teame, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29+as+biomedical+models%5BTitle%5D)+AND+%22Anim+Front%22%5BJournal%5D)">The use of zebrafish (Danio rerio) as biomedical models.</a> Anim Front. 9 (3), 68-77 (2019).</li>
<li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li>
<li>Patton, E. E., Zon, L. I., Langenau, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+disease+models+in+drug+discovery%3A+From+preclinical+modelling+to+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Zebrafish disease models in drug discovery: From preclinical modelling to clinical trials.</a> Nat Rev Drug Discov. 20 (8), 611-628 (2021).</li>
<li>Clift, D., Richendrfer, H., Thorn, R. J., Colwill, R. M., Creton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+analysis+of+behavior+in+zebrafish+larvae%3A+Effects+of+feeding%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">High-throughput analysis of behavior in zebrafish larvae: Effects of feeding.</a> Zebrafish. 11 (5), 455-461 (2014).</li>
<li>Keenan, S. R., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+developmental+phases+of+zebrafish+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The developmental phases of zebrafish myogenesis.</a> J Dev Biol. 7 (2), 12(2019).</li>
<li>Tonelli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+A+resourceful+vertebrate+model+to+investigate+skeletal+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Endocrinol+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: A resourceful vertebrate model to investigate skeletal disorders.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 11, 489(2020).</li>
<li>OECD. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Test+no.+236%3A+Fish+embryo+acute+toxicity+%28FET%29%22">Test no. 236: Fish embryo acute toxicity (FET)</a>. , (2013).</li>
<li>Chen, J. R., Lai, Y. H., Tsai, J. J., Hsiao, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+fluorescent+staining+platform+for+drug-screening+and+mechanism-analysis+in+zebrafish+for+bone+mineralization%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Live fluorescent staining platform for drug-screening and mechanism-analysis in zebrafish for bone mineralization.</a> Molecules. 22 (12), 2068(2017).</li>
<li>He, H., Wang, C., Tang, Q., Yang, F., Xu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Possible+mechanisms+of+prednisolone-induced+osteoporosis+in+zebrafish+larva%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Possible mechanisms of prednisolone-induced osteoporosis in zebrafish larva.</a> Biomed Pharmacother. 101, 981-987 (2018).</li>
<li>Huang, H. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+bone+transgenic+zebrafish+in+anti-osteoporosis+chemical+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Model+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Application of bone transgenic zebrafish in anti-osteoporosis chemical screening.</a> Animal Model Exp Med. 1 (1), 53-61 (2018).</li>
<li>Haney, M. G., Moore, L. H., Blackburn, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+screening+of+primary+patient+derived+tumor+xenografts+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Drug screening of primary patient derived tumor xenografts in zebrafish.</a> J Vis Exp. (158), e60996(2020).</li>
<li>Nishimura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+zebrafish+in+systems+toxicology+for+developmental+toxicity+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Congenit+Anom+%28Kyoto%29%22%5BJournal%5D)">Using zebrafish in systems toxicology for developmental toxicity testing.</a> Congenit Anom (Kyoto). 56 (1), 18-27 (2016).</li>
<li>Hayot, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+toxicity+of+chemicals+using+a+zebrafish+vibration+startle+response+screening+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Evaluating toxicity of chemicals using a zebrafish vibration startle response screening system.</a> J Vis Exp. (203), e66153(2024).</li>
<li>Hoyberghs, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DMSO+concentrations+up+to+1%25+are+safe+to+be+used+in+the+zebrafish+embryo+developmental+toxicity+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Toxicol%22%5BJournal%5D)">DMSO concentrations up to 1% are safe to be used in the zebrafish embryo developmental toxicity assay.</a> Front Toxicol. 3, 804033(2021).</li>
<li>Lipton, J. H., Brümmendorf, T. H., Sweet, K., Apperley, J. F., Cortes, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+considerations+in+the+management+of+patients+treated+with+bosutinib+for+chronic+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Hematol%22%5BJournal%5D)">Practical considerations in the management of patients treated with bosutinib for chronic myeloid leukemia.</a> Ann Hematol. 103 (9), 3429-3442 (2024).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

斑马鱼已成为药物筛选的重要模型。在尝试确定毒性测试的方法学时，我们发现不同实验室报道了多种相互矛盾的方法8,9,10,11,12,13。这些方法所描述的实验使用了不同日龄的幼鱼、不同的实验时间线、不同的换液频率以及不同的形态学评分系统。通过反复试验，我们建立了本研究所述的方法，该方法已提供可靠且可重复的实验结果。
选择培养板规格 
最初在24孔板中进行实验，以确保幼虫有足够的空间活动和生长。每孔放置10只幼虫，每个浓度设两个孔，每孔加入1 mL药物溶液。该设置未能获得可重复的结果，推测原因是幼虫从孔中吸收的药物量不均一。随后改用96孔板和48孔板进行试验，每孔放置1只幼虫，结果发现幼虫在96孔板中生长无异常。因此，后续实验采用96孔板，以节省空间和药物用量。
每日更换培养基 
由于斑马鱼通过培养基吸收药物，我们确定需要一定程度的培养基更换，以维持培养基中药物浓度的稳定。此外，更换培养基可去除孔中积累的潜在代谢废物，避免产生毒性环境并导致结果偏差。我们以博舒替尼（Bosutinib）进行了试验，设置三块相同药物浓度的培养板：一块不进行每日换液，一块进行每日半量换液，另一块进行每日全量换液。结果显示，未更换培养基的培养板在7天后出现较高的死亡率，而半量换液和全量换液的培养板在7 dpf时结果一致。因此，选择每日半量更换培养基。该方案可减少昂贵且有限的测试材料的消耗，为后续下游实验保留足够的样品。
暴露时间 
本实验方案中所选用的测试幼鱼年龄及药物暴露持续时间，取决于我们关注的表型为骨骼矿化。由于骨骼形成始于约4天后受精（dpf），我们选择从3 dpf的斑马鱼开始实验，以确定受试化学品是否影响骨骼发育的起始。随后，我们将药物暴露实验终止于7 dpf，因为在8 dpf及之后观察到较高程度的死亡率，这可能由于未进行喂养而对结果产生偏倚。然而，具体时间范围可根据研究性质和关注的表型进行调整。
局限性 
该方法存在一些局限性。将3天大的斑马鱼幼鱼转移至多孔检测板耗时较长。在不吸走幼鱼的情况下从孔中移除培养基同样费力。必须使用单通道移液器缓慢地从每个孔中移除培养基，以确保在此过程中不会损伤幼鱼。此外，尽管每天更换一半培养基可以补充待测化合物，并确保清除孔中的代谢废物，但这并不能保证在5天暴露期间孔内药物浓度的稳定。虽然高效液相色谱分析可进一步揭示每条幼鱼实际吸收的药物量，但该&#160;检测将不再符合高通量筛选方法的标准。
综上所述，该方法旨在填补斑马鱼在4 dpf之后毒性测试方面的空白，推动建立一种适用于野生型、突变型和转基因斑马鱼品系的标准化方案，使其在胚胎阶段可与鱼类急性毒性试验（FET）相媲美。这为在更早阶段无法开展的其他下游表型分析实验提供了可能。

斑马鱼 (Danio rerio) 近年来已成为一种强大的脊椎动物模式生物，在推动生物医学研究的各类研究中日益&#160;受到青睐1。约70%的人类蛋白质编码基因在斑马鱼中至少有一个直系同源基因，约82%的人类致病基因在斑马鱼中至少存在一个同源基因2。这种基因保守性，加上与人类相似的基本器官发育模式和形态结构，使斑马鱼成为人类疾病研究中颇具价值的模型，能够实现分子水平上的跨物种比较1,2,3，这对于药物开发至关重要。
斑马鱼发育迅速，受精后10小时（hpf）形成尾芽，16 hpf时出现第一个体节。胚胎在受精后约2-3天（dpf）从绒毛膜中孵出。到4 dpf时，其消化道已完全发育，到5 dpf时， swim bladder（鳔）已充气，使其能够自由游动并捕食食物。尽管斑马鱼在5 dpf时已具备摄食能力，但未喂食的幼鱼仍可仅依靠卵黄提供的营养存活至至少7 dpf，从而避免了外源性喂养可能引起的污染，并干扰药物筛选、毒理学和行为学检测4。到7 dpf时，幼鱼已形成完整体轴结构，并具备多种初具功能的器官系统，包括心脏与血管系统、肌肉和骨骼5,6。斑马鱼胚胎为体外受精（ex vivo），体外发育，且在早期生命阶段具有光学透明性，因此非常适合进行基因编辑和小分子化合物筛选3。此外，其个体小、繁殖力高，有利于增加实验重复数，提高统计效能，同时也适用于多孔板操作，减少药物用量并提高实验通量。
在动物模型中筛选新型小分子对于确定药物产生有益或不良效应的能力至关重要，从而识别出哪些化合物适用于进一步测试，哪些可能需要进行结构修饰以改变其活性。作为药物筛选过程的一部分，需要确定目标化合物的半数致死浓度（LC50），该浓度是指在初步毒性测试中可导致50%实验动物死亡的工作浓度。
目前存在一种针对受精后96小时（hpf）内斑马鱼胚胎的标准化毒性测试方案，即鱼类胚胎急性毒性（FET）试验（TG236）7。在FET试验中，新受精的卵子暴露于五种浓度的化学物质中，最长持续96小时，并观察其致死性表现，主要包括：(i) 卵子凝固、(ii) 体节未形成、(iii) 尾芽未从卵黄囊脱离、以及 (iv) 无心跳。该试验可用于测定急性毒性和LC50值。此外，该方案还对筛选实验所用测试容器的尺寸（如24孔板）、测试容器中卵子的分布方式以及饲养条件等作出建议，以确保结果的有效性和可重复性7。
尽管FET试验适用于胚胎阶段的毒性测试，但其检测时间不超过受精后4天（4 dpf）。对于在此时间点左右开始发育的表型（例如脊索的矿化6），药物筛选必须持续超过4 dpf，以便对相关组织进行形态学评估。此外，我们建议药物暴露应至少在目标表型出现前1天开始。据我们所知，目前尚无类似于FET的标准化方案用于早期斑马鱼幼鱼（特别是3至7 dpf阶段的斑马鱼）的药物筛选。尽管已有若干研究报道了4 dpf之后斑马鱼幼鱼的药物测试，但所采用的方法学在实验条件上缺乏一致性，包括测试孔的尺寸、生物学重复和技术重复的数量、培养基更换频率、暴露持续时间以及所评估的形态学缺陷等方面均存在差异8,9,10,11,12,13。基于此，我们建立了一种经过验证的标准化毒性测试方案，可用于3–7 dpf斑马鱼幼鱼的形态学变化的可视化观察。该方案后续还可用于其他下游表型分析实验，如行为学分析、基因表达谱分析和组织形态计量学分析。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>Starlab</td><td>E1415-1510</td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;micro;L 微量移液器（P10）</td><td>Gilson</td><td>F144802&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>10/20 &amp;micro;L 移液器吸头</td><td>Starlab</td><td>S1110-3810</td><td></td></tr><tr><td>1000 &amp;micro;L 微量移液器（P1000）</td><td>Gilson</td><td>F123602&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>1000 &amp;micro;L 移液器吸头</td><td>Starlab</td><td>S1111-6001</td><td></td></tr><tr><td>12 孔板</td><td>Starlab</td><td>CC7672-7512</td><td>无菌，单个包装，未经处理，带盖</td></tr><tr><td>20 &amp;micro;L 微量移液器（P20）</td><td>Gilson</td><td>F123600&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;micro;L 微量移液器（P200）</td><td>Gilson</td><td>F123601&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;micro;L 多通道移液器&amp;nbsp;</td><td>Gilson</td><td>F81024</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;micro;L 移液器吸头</td><td>Starlab</td><td>S1113-1006</td><td></td></tr><tr><td>96 孔板</td><td>Starlab</td><td>CC7672-7596</td><td>无菌，单个包装，平底，未经处理，带盖</td></tr><tr><td>带内格斜底的繁殖缸、缸体分隔器及盖子</td><td>Tecniplast</td><td>ZB17BTISLOP, ZB17BTE,&amp;nbsp; ZB17BTL, ZB17BTD</td><td>内缸斜底设计</td></tr><tr><td>网筛</td><td>/</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>腈类手套</td><td>Mercator</td><td>/</td><td>/</td></tr><tr><td>培养皿&amp;nbsp;</td><td>Starlab</td><td>CC7672-3394/CC7672-3359</td><td>100 × 20 mm 或 60 × 15 mm</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica M205 FCA 荧光体视显微镜</td><td>Leica</td><td>10450826</td><td></td></tr><tr><td>帕尔贴冷却培养箱，含两个带冷白光模块的搁架</td><td>Memmert</td><td>IPP110ecoplus, T8</td><td>配备昼夜循环系统</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Biochem Chemopharma</td><td>504341000</td><td>用于配制 E3 中的 1% 溶液</td></tr><tr><td>氯化钙二水合物</td><td>Biochem Chemopharma</td><td>303080500</td><td>用于配制 E3</td></tr><tr><td>七水合硫酸镁</td><td>Biochem Chemopharma</td><td>313060500</td><td>用于配制 E3</td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Biochem Chemopharma</td><td>316030500</td><td>用于配制 E3</td></tr><tr><td>SCREEN-WELL&amp;nbsp;Wnt 信号通路文库（博舒替尼）</td><td>Enzo</td><td>BML-2838-0500</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>S/3161/53</td><td>用于配制 E3</td></tr></tbody></table>

早期斑马鱼幼鱼中的小分子筛选与毒性检测

Small Molecule Screening and Toxicity Testing in Early-stage Zebrafish Larvae

斑马鱼已成为人类转化医学研究、小分子和环境污染物的毒性测试、治疗性药物发现以及其他生物医学研究应用中的重要模式生物。本方案旨在为早期斑马鱼幼鱼（受精后3-7天，dpf）的药物筛选和毒性测试提供清晰的操作指南。尽管已有多种描述斑马鱼幼鱼毒性测试的方法发表，但在暴露时间、换液频率、形态学评分标准等方面仍缺乏统一的标准化操作流程。我们通过实验确定了进行此类实验的最佳幼鱼年龄、适用于各年龄段的培养板规格、既能保证结果可靠性又能减少试剂浪费的培养基更换频率&#160;测试化合物，以及一种在统计学上易于量化的形态学评分系统。该文稿详细描述了一种针对年龄在&#160;3至7天斑马鱼幼鱼，旨在填补药物毒性测试领域的空白，并迈出建立类似于鱼类胚胎急性毒性试验的标准化方法的第一步。

可分别或在整个实验时间进程（至7 dpf）内累积观察各项异常表型。每种异常的最大形态学评分可用于计算形态学异常占所用幼体数量的百分比。例如，在第7天，若评分者1和评分者2的心包水肿形态学评分分别为19和20（满分24分），表示24条幼体中有19或20条出现心包水肿，则百分比评分可按以下方式计算：
<img alt="幼虫存活率分析的百分比评分计算公式；分子为 (19+20)/2，分母为 24−死亡幼虫数。" src="/files/ftp_upload/67759/67759eq1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 1">
补充表 S1 显示了在 Bosutinib（一种用于治疗慢性髓性白血病的酪氨酸激酶抑制剂15）的毒性测试后，于 4 dpf 时对暴露斑马鱼进行形态学评分的结果（两位评分者的结果）。相同的形态学评分在 5 dpf 至 7 dpf 的暴露鱼中重复进行。该化合物的测试浓度范围为 100 µM 至 6.25 µM。在不同时间点进行了三次技术重复，以 7 dpf 时的平均累积死亡率确定 LC50（即 50% 的幼鱼存活的浓度）。LC50 可在任意暴露时间点确定，但我们建议在 7 dpf 时进行计算。
以7 dpf时的累积平均死亡率绘制LC50曲线，如图3所示。 Bosutinib的LC50浓度估计为37.95 µM。
注意：该估算的 LC50 浓度仅适用于本模型系统，随后可用于进一步的下游表型分析实验。
<img alt="斑马鱼实验装置、浓度梯度及用于形态学分析的孔板检测。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67759/67759fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：在受精后3-7天幼鱼中进行药物筛选的示意图。 采用96孔测试板设置，用于研究化合物博舒替尼（Bosutinib）在100 µM至6.25 µM范围内的五个浓度。缩写：dpf = 受精后天数。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67759/67759fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="斑马鱼胚胎发育阶段的显微镜图像，突出显示生长和解剖特征。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67759/67759fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：暴露于不同化学物质浓度下5日龄斑马鱼幼鱼在暴露后2天观察到的代表性形态学缺陷。（A）对照组（未受影响）斑马鱼，（B）显示轻度心包水肿的斑马鱼幼体，（C）具有严重心包水肿和卵黄囊出血的斑马鱼，（D）发育迟缓、色素减少、 swim bladder 变小的斑马鱼，（E）卵黄囊肿胀且尾鳍弯曲的斑马鱼，（F）尾鳍缺失的斑马鱼，（G）脊索弯曲的斑马鱼，（H）尾部截短的斑马鱼，以及（I）出现坏死的死亡斑马鱼。缺陷部位以红色箭头标示。比例尺 = 1 mm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67759/67759fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="LC50测定，死亡率与浓度关系图，Bosutinib，剂量-反应分析，毒理学研究" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67759/67759fig3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3: LC50 显示浓度与死亡率百分比关系的曲线。 测试的五个浓度为 100 µM, 50 µM, 25 µM, 12.5 µM，以及 6.25 µM，其死亡率分别为100%、100%、29.2%、12.5%和12.5%。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67759/67759fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>形态学缺陷</td>
			<td>描述</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>心包水肿</td>
			<td>心脏周围液体积聚，伴有心脏拉伸及血液循环功能障碍</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>心率（每分钟）</td>
			<td>每分钟心跳次数减少</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>卵黄</td>
			<td>存在或不存在卵黄水肿或出血，可能与心脏缺陷同时发生</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>卵黄延伸</td>
			<td>卵黄肿胀、变薄或缺失</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>弯曲的脊索</td>
			<td>存在扭曲或波浪状的脊索和/或尾部弯曲</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>鳔</td>
			<td>鳔的存在、缺失或部分发育</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>色素沉着</td>
			<td>与同龄未经处理的鱼相比，黑色素细胞减少或缺失</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>坏死</td>
			<td>身体任何部位存在（轻度或重度）或不存在坏死</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>发育延迟</td>
			<td>与同龄野生型对照相比，发育延迟或停滞</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>对触碰的反应</td>
			<td>受到惊吓刺激（例如使用移液器尖端）后反应延迟或无反应</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>尾部截短</td>
			<td>斑马鱼后部身体缺失（即尾部未形成）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>鳍</td>
			<td>尾鳍存在或缺失，可能伴随卵黄延伸变薄</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>体轴缩短</td>
			<td>外观正常的鱼，但测量时体长较短</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：药物暴露研究后可观察到的视觉形态学缺陷列表。
补充表 S1：Bosutinib 在 4 dpf（暴露后第 1 天）的代表性形态学结果。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67759/SupplementalTable_1.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>

本方案描述了一种在受精后3至7天的斑马鱼幼鱼中进行药物筛选并随后进行形态学评估的实验流程。

斑马鱼已成为人类转化医学研究、小分子和环境污染物毒性测试的重要模式生物，……

首先，在受精后三天于培养皿中收集早期斑马鱼胚胎。使用1000微升移液器并设定体积为100微升，将每个外观健康的孵化后胚胎转移至96孔板的各个孔中。接着，向12孔板的每个孔中加入所需量的待测化学物质。然后，用 E3 培养基将总体积调至 2.4 毫升。根据溶解储备测试化学品所用的溶剂，配制溶剂对照组。使用 200 微升移液器，从 96 孔板的每个孔中吸出已有的 E3 溶液。使用八通道微量移液器为每个浓度加入100 µL已配制的测试培养基。确保每个浓度测试的幼虫总数为24条。24小时后，使用体视光学显微镜进行形态学评分。采用二元法对形态学进行评分，其中“无”表示形态正常，“有”表示存在形态学异常。评分完成后，从每个孔中移除50 µL培养基，并加入50 µL freshly-prepared test medium（新配制的测试培养基）进行替换。移除并记录所有死亡的幼鱼，然后将幼鱼置于28.5°C条件下培养，光照周期为14小时光照和10小时黑暗。受精后五天的斑马鱼在药物暴露两天后表现出多种表型。部分斑马鱼未受影响，表现正常，而另一些鱼则出现轻度心包水肿。其他个体中观察到严重的心包水肿，并伴有卵黄出血和卵黄延伸。还观察到发育延迟，表现为色素减少、鳔发育不全以及总长度缩短。其他表型包括卵黄肿胀、尾鳍弯曲、尾鳍缺失以及脊索弯曲的斑马鱼。严重病例表现出截断、坏死及死亡。

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生物学

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