观察铜绿假单胞菌运动表型的高通量方法
June 20th, 2025
该方案提供了一种快速有效的方法，用于鉴定参与铜绿假单胞菌中各种类型运动的遗传因子。
我们的研究重点是利用系统生物学和基因组学，了解细菌如何起作用并引发感染。我们旨在识别影响细菌生理且条件模拟感染环境的基因，以寻找开发更好抗生素和替代治疗的新靶点。我们开发了高通量方案，识别影响铜绿假单胞菌运动的遗传因素，实现全基因组分群和抽搐行为分析。该研究项目揭示了驱动运动的分子机制，这些机制也参与生物膜的形成、定植和逃避宿主防御。
它能够适应不同的检测方法和细菌种类。首先，取铜绿假单胞菌转座子突变体库的源板，将其平放在室温表面约一小时冷却。对于所需检测，选择M9葡萄糖0.5%琼脂平板进行分蜂，选择LB琼脂1%琼脂平板进行抽搐。
要配置复制器以实现准确的殖民地转移，请打开复制器。在“选择和作模式”部分，选择选择并运行存储程序。在选择来源板块部分，选择加板384琼。
然后，在选择靶板部分，选择加384号琼脂板。在选择焊盘部分，选择短引脚384。在Singer程序中，选择复制多个，然后进入复制程序选项，选择通用、回收和无。
在剖面源中选择偏移，然后选择随机和默认半径。在截面目标中，选择钉住并将压力调整为2%，其他设置保持为默认。然后，将短销RePad 384插入相应的隔间。
将源板和靶板放置在复制器的指定平台上。将384密度源板和空的运动板放到平台上。使用选中的参数按运行开始传输过程。
微生物阵列钉扎机器人将菌落从384密度源板转移到运动板上。之后，将接种的运动板放入塑料袋中。小心将装有平板的袋子放入培养箱，温度设定在37摄氏度，18小时。
潜伏期结束后，使用任何高质量成像软件拍摄高分辨率的运动板图像。完成运动测定并成像运动板后，在ImageJ中运行宏观分析。打开包含图片的文件夹，加载批次进行分析。
提示时，使用预览选项调整角度，直到板子变直，以调整板块的旋转。满意后，点击确定按钮。然后，将矩形工具在殖民地周围移动，裁剪包含殖民地的部分。
准备好后，点击确定完成裁剪。定义用于绘制每个菌落周围兴趣区域（ROI）的网格，并测量运动面积。选择合适的菌落密度，并根据需要调整参数，确保每个圆圈围绕菌落排列。
准备好后，激活确认框并点击确定按钮。每个菌落的运动区域将被测量，并将包含数据的CSV文件保存在指定文件夹中。对于运动性测定，使用含有M9、葡萄糖、氨基酸和硫酸镁的琼脂溶液高压灭菌。
将25毫升冷却混合琼脂倒入每个培养皿中。然后，在每个培养板上接种2.5微升过夜细菌培养液，并在37摄氏度下盖子朝上孵育18小时，观察运动表现型。在高压灭菌处理1%琼脂溶液后，将25毫升冷却后的LB 1%琼脂倒入培养皿中。
将含有1%琼脂的细菌刺入抽搐板底部。在37摄氏度下孵育48小时，然后在室温下再孵48小时。孵育后，小心地将琼脂从培养皿中取出。
用1%的晶状紫溶液染色培养皿，来可视化抽搐区。抽搐运动测定显示，患有T4P机制基因缺失的铜绿假单胞菌突变体相比野生型，其晕区显著较小，显示抽搐运动量减少。分群运动分析显示，PA14文库中的缺失突变体具有显著减少且无突起的晕区，证实了分群能力缺陷。
细菌运动性研究通常受限于其通量。我们的高通量运动性方案将帮助研究人员全面研究细菌的运动性。例如，通过使用全基因组突变体集合，可以识别所有与运动相关的基因，揭示细菌如何引起感染。
我们的发现提出了关于铜绿假单胞菌运动性遗传调控、其在生物膜形成中的作用及其与致病机制联系的新问题。他们还帮助探索环境条件如何塑造运动行为，以及针对运动基因是否可能促成创新抗菌治疗。
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概述
本协议提出了一种快速且高效的方法，用于识别铜绿假单胞菌中各种类型运动性的相关遗传因素。该研究专注于理解细菌行为及其对感染的影响，利用高通量技术分析运动性。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物学
- 基因组学
- 传染病学
背景
- 铜绿假单胞菌是一种以其运动性著称的重要病原体。
- 理解运动性对开发新型抗生素至关重要。
- 高通量方法可以增强对细菌行为的研究。
- 运动性影响生物膜的形成和宿主相互作用。
研究目的
- 识别影响铜绿假单胞菌运动性的遗传因素。
- 开发一种用于细菌运动性全基因组分析的协议。
- 探索运动性与致病性之间的联系。
使用的方法
- 使用转座子突变体库进行高通量运动性测定。
- 在受控条件下孵育运动性平板。
- 使用软件进行图像分析以定量运动性。
- 使用染色技术来可视化抖动运动区域。
主要结果
- 识别了影响成群运动和抖动行为的遗传因素。
- 与野生型相比，突变体表现出运动性降低。
- 研究结果表明运动性与生物膜形成之间存在联系。
- 对细菌运动性的遗传控制提供了新的见解。
结论
- 开发的协议增强了对细菌运动性的研究。
- 理解运动性可以带来创新的抗菌策略。
- 需要进一步研究以探索环境对运动性的影响。
常见问题
Executive Industry Relevance
High-throughput motility phenotyping in Pseudomonas aeruginosa enables systematic identification of genetic determinants underlying key pathogenic behaviors such as swarming and twitching. This capability supports early-stage target validation and mechanistic de-risking for anti-infective discovery portfolios. Integrating genome-wide motility data accelerates the triage of candidate targets linked to biofilm formation, colonization, and host defense evasion.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables genome-scale interrogation of motility-related genes for functional target validation.
- Supports mechanistic de-risking by linking genetic perturbations to motility phenotypes.
- Facilitates prioritization of targets implicated in infection-relevant behaviors.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, high-throughput motility assays for robust phenotype quantification.
- Provides reproducible, quantitative outputs suitable for downstream screening workflows.
- Enables scalable evaluation of mutant libraries and compound effects on motility.
Translational & Preclinical Research
- Aligns motility phenotypes with biofilm formation and colonization, supporting translational biomarker exploration.
- Links genetic findings to infection-relevant models for preclinical validation.
- De-risks advancement decisions by clarifying the role of motility in pathogenesis.
Pipeline & Workflow Integration
This high-throughput protocol fits at the intersection of early discovery and lead identification, bridging genetic screening with phenotypic validation in infectious disease pipelines.
- Discovery Biology: Systematically tests genetic hypotheses about motility and its contribution to virulence.
- Screening: Provides reproducible, quantitative motility measurements for comparative analysis.
- Analytics: Generates CSV outputs for high-content data integration and statistical analysis.
- Translational Research: Connects motility phenotypes to infection models and potential biomarkers.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other bacterial species and motility assays, supporting platform scalability.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target selection and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardizes motility phenotyping for reproducibility and scalability across projects.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by linking genotype to infection-relevant phenotypes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of anti-infective targets and pathways.
Implementation Considerations
- Requires expertise in bacterial genetics, phenotypic assays, and image analysis.
- Needs access to automated colony transfer systems and high-resolution imaging infrastructure.
- Demands cross-team standardization of assay conditions and data analysis pipelines.
- Adaptable to various motility assays and bacterial species with protocol modifications.
- Throughput and data management must be matched to library size and analytical capacity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:52
High-Throughput Motility Experiment to Study the Motility Behaviors of Pseudomonas aeruginosa
3:20
Quantitative Assessment of Bacterial Motility Using ImageJ
4:36
Traditional Motility Assays for Validation of Hits
5:51
Results
6:26
Conclusion
