高通量观察运动表型的方法 铜绿假单胞菌

我们的研究聚焦于利用系统生物学和基因组学来理解细菌的作用机制及其致病过程。旨在鉴定在模拟感染环境条件下影响细菌生理功能的基因，以发现可用于开发更有效抗生素及替代疗法的新靶点。我们建立了一种高通量实验方案，用于鉴定影响铜绿假单胞菌运动性的遗传因子，从而实现对群体迁移和抽搐运动行为的全基因组水平分析。该研究项目揭示了驱动细菌运动性的分子机制，这些机制同时也参与生物膜形成、定植以及逃避免疫防御过程。

该方法可适用于不同的检测方法和细菌种类。首先，取出铜绿假单胞菌转座子突变文库的来源平板，在室温下水平放置约一小时，使其降温。根据所需的实验，选择含0.5%琼脂的M9葡萄糖平板用于群集运动检测，选择含1%琼脂的LB琼脂平板用于抽搐运动检测。

为了配置复制器以实现准确的菌落转移，请打开复制器。在“选择和操作模式”部分，选择“运行已存储的程序”。在“选择源板”部分，选择384孔琼脂加板。

然后，在“选择目标板”部分，选择384孔琼脂板。在“选择针垫”部分，选择384短针。在Singer程序中，选择“复制多个”，然后进入“复制程序选项”，并选择“通用”、“回收”和“无”。

在“源”部分，选择偏移，然后选择随机和默认半径。在“目标”部分，选择固定，并将压力调整为2%。其余所有设置保持默认。然后，将短针RePads 384插入相应的隔间中。

将源板和目标板放置在复制仪的指定平台上。将384密度的源板和空的运动性检测板放入平台中。使用选定的参数按下运行键，开始转移过程。

微生物阵列点样机器人将把菌落从384密度的源板转移到运动性检测平板上。随后，将接种好的运动性检测平板放入塑料袋中。小心地将装有平板的塑料袋放入设定为37°C、培养18小时的培养箱中。

孵育结束后，使用任意高质量成像软件拍摄运动性平板的高分辨率图像。完成运动性实验并获取运动性平板图像后，在 ImageJ 中运行宏。打开包含图像的文件夹以加载批量数据进行分析。

当系统提示时，使用预览选项调整角度，直至平板处于正位，以校正平板的旋转。确认无误后，单击“确定”按钮。然后，移动矩形工具框选菌落区域，裁剪出平板中包含菌落的部分。

准备就绪后，单击“确定”以完成裁剪。定义用于在每个菌落周围绘制感兴趣区域（ROI）的网格，并测量运动区域。选择合适的菌落密度，并根据需要调整参数，以确保每个圆圈均位于一个菌落周围。

准备就绪后，激活确认框并点击确认按钮。系统将测量每个菌落的运动区域，并将包含数据的 CSV 文件保存至指定文件夹。进行运动性检测时，需对含有 M9、葡萄糖、酪蛋白氨基酸和硫酸镁的琼脂溶液进行高压灭菌。

将25毫升冷却并混匀的琼脂倒入每个培养皿中。然后，每个平板接种2.5微升过夜培养的细菌，于37°C孵育18小时，皿盖朝上以观察运动表型。在对含1%琼脂的LB溶液进行高压灭菌后，将25毫升冷却并混匀的LB 1%琼脂倒入培养皿中。

用接种针将细菌穿刺接种至含有1%琼脂的颤动培养基平板底部。将平板在37°C下培养48小时，随后在室温下继续培养48小时。培养结束后，小心地从平板上移除琼脂。

通过使用1%结晶紫溶液对培养皿染色来观察抽搐运动区域。抽搐运动分析显示，IV型菌毛（T4P）系统基因缺失的铜绿假单胞菌突变株相较于野生型菌株形成的晕圈区域显著减小，表明其抽搐运动能力下降。群集运动分析表明，PA14文库中的突变株晕圈区域显著缩小且无突起结构，证实其群集运动能力存在缺陷。

细菌运动性研究常常受限于通量。我们的高通量运动性实验方案将有助于研究人员全面研究细菌的运动性。例如，利用全基因组突变体文库，可以鉴定出所有与运动性相关的基因，并揭示细菌引发感染的机制。

我们的研究结果提出了关于铜绿假单胞菌运动性的遗传调控、其在生物膜形成中的作用以及与致病性关联的新问题。同时，这些发现有助于探索环境条件如何影响其运动行为，以及靶向运动性基因是否可能带来创新的抗菌治疗策略。