使用核心鞘 3D 生物打印支架优化细胞外囊泡递送用于慢性伤口管理
February 28th, 2025
本研究提出了一种制造用于慢性伤口愈合的核心护套 3D 生物打印支架的方案。从间充质干细胞中分离出细胞外囊泡，并用由羧甲基纤维素和海藻酸盐裂解酶制成的鞘装入核心（海藻酸盐）。这种设计允许受控的支架降解和高效的 EV 释放。
研究范围是开发一种先进的生物活性伤口敷料设计，以实现有效的慢性伤口管理。支架将确保细胞外囊泡的控制、降解和有效的局部递送。
目前的方案旨在克服传统伤口敷料在治疗慢性炎症方面的局限性。特别是缺乏控制、降解和及时释放细胞外囊泡。
该协议提供了可调的方法，可及时为各种应用提供包括基因在内的治疗剂。
所有结果都为为各种伤口类型定制支架以及通过用特定的生物活性分子加载细胞外囊泡来增强再生疗法提供了新的见解。
我们的实验室将建立一个转化研究平台来解决糖尿病伤口愈合问题。
[旁白]首先，在 37 摄氏度的水浴中快速解冻一瓶间充质干细胞。当残留小冰块时取出小瓶。将间充质干细胞小瓶的全部内容物转移到装有完整培养基的 15 毫升锥形管中。在室温下以200G离心细胞五分钟。吸出上清液并将细胞沉淀重悬于一毫升预热完全培养基中。然后将细胞转移到含有四毫升完全培养基的T25烧瓶中。轻轻倾斜 T25 烧瓶以确保细胞均匀分布。将烧瓶与 5% 的二氧化碳在 37 摄氏度下孵育。当细胞达到70%至80%汇合时，从T25烧瓶中吸出用过的培养基。向烧瓶中加入三毫升新鲜PBS以去除任何残留细胞。接下来，向烧瓶中加入一毫升 0.25% 胰蛋白酶溶液并孵育。在显微镜下以 4 倍放大倍率监测细胞脱离。现在将四毫升预热的完全培养基加入烧瓶中，并在表面上上下移液以分离。然后将细胞悬液转移到15毫升离心机中。离心后，将细胞沉淀重悬于新鲜的完全培养基中，并计数细胞。然后将细胞转移到接种密度为每平方厘米 5,000 个细胞的 T75 烧瓶中。将 T75 烧瓶与 37% 二氧化碳一起在 37 摄氏度下孵育。72小时后，从细胞中收集条件培养基进行细胞外囊泡分离。为了分离细胞外囊泡或EV，将收集的13毫升条件培养基以800G离心15分钟以去除细胞碎片。使用 0.22 微米注射器过滤器过滤上清液并去除大颗粒。现在向过滤后的调节培养基中加入五毫升沉淀缓冲液。彻底涡旋混合物以确保其均匀。将混合物在四摄氏度下孵育过夜，以使细胞外囊泡沉淀。然后将混合物在 3,220 G 下在 20 摄氏度下离心 30 分钟。确保管子平衡。小心地弃去上清液，不要干扰沉淀，然后再次离心五秒钟。现在将EV沉淀轻轻地重新悬浮在200微升PBS中，以避免损坏囊泡。进行蛋白质印迹以检测细胞外囊泡特异性标志物，包括 CD63、CD81 和 CD9。在无菌超纯水中制备新鲜的 4.5% 海藻酸钠溶液。在 60 摄氏度下搅拌溶液过夜，以确保完全溶解。接下来，将羧甲基纤维素溶解在无菌超纯水中，得到3.8%的溶液。将制备好的生物油墨在 25 摄氏度下以 3,220 G 离心 10 分钟，以去除可能干扰打印过程的气泡。现在使用注射器混合器，将三毫升制备的海藻酸钠溶液与标记的EV或Dialymmi对照混合。轻轻混合，确保悬悬均匀。使用另一台注射器混合器将一毫升羧甲基纤维素与新鲜制备的海藻酸盐裂解酶溶液在无菌超纯水中混合，以达到每毫升 0.5 毫单位的最终浓度。同时将海藻酸钠 EV 生物墨水加载到核心部分，将羧甲基纤维素海藻酸盐裂酶生物墨水加载到注射器装置的护套部分。启动 3D 生物打印机软件。选择具有对角线填充图案的圆柱形形状以创建脚手架结构。将圆柱体直径设置为 20 毫米，高度设置为 1.1 毫米。将孔径配置为一毫米。将芯和护套喷嘴的抽气速度设置为每秒 1 毫米，每层厚度为 0.25 毫米。将移动速度配置为每秒 6 毫米，并在室温下打印四层。在挤出过程中使用含有气溶胶氯化钙的加湿器交联支架。 开始在聚酯薄膜上打印脚手架。将加湿器喷嘴放置在距离挤出头约 20 厘米的位置，以确保有效交联。将支架浸入2.2%氯化钙溶液中10分钟，完成交联。用无菌超纯水冲洗支架三次，以去除多余的氯化钙和未结合的生物墨水。用电动理发器剃掉麻醉的OCTA糖尿病小鼠的背侧皮肤，避免皮肤刺激或受伤。现在在每只小鼠的背表面创建一个六毫米圆形全层皮肤伤口。将含有PKH标记的细胞外囊泡的3D生物打印支架轻轻地放在伤口床上。确保支架完全覆盖伤口表面，并用无菌镊子轻轻按压，以尽量减少气穴。在植入后2小时，4小时，8小时和24小时将麻醉小鼠转移到IVIS成像系统。在成像向导中，选择荧光成像选项并激活 PKH 染料的激发和发射滤光片。调整相机设置，包括视野和拍摄对象高度以优化信号检测。开始采集图像，保存生成数据。然后从标记的EV释放荧光信号。与仅羧甲基纤维素中的海藻酸盐EV相比，羧甲基纤维素海藻酸盐裂解支架中的海藻酸盐EV表现出更快的释放曲线，特别是在2小时和4小时的时间点。
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
概述
本研究提出了一种开发高级生物活性伤口敷料设计的协议，旨在有效管理慢性伤口。该支架确保了受控降解和局部高效递送细胞外囊泡，解决了传统伤口敷料的局限性。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物材料
- 伤口愈合
背景
- 慢性伤口是一个重大的临床挑战。
- 传统伤口敷料通常缺乏对降解的控制。
- 治疗剂的有效释放对于愈合至关重要。
- 细胞外囊泡（EVs）在促进组织修复方面具有潜力。
研究目的
- 制造核-鞘3D生物打印支架。
- 通过受控的EV释放来增强慢性伤口愈合。
- 改进现有的伤口敷料技术。
使用的方法
- 从间充质干细胞中分离细胞外囊泡。
- 使用海藻酸盐和羧甲基纤维素进行核-鞘支架设计。
- 用于支架制造的3D生物打印技术。
- 评估支架降解和EV释放效率。
主要结果
- 支架展示了受控降解特性。
- 实现了所装载细胞外囊泡的高效释放。
- 观察到慢性炎症的改善管理。
- 该协议为慢性伤口护理提供了一个有前景的方法。
结论
- 开发的支架可以显著增强伤口愈合。
- EV的受控释放可能导致更好的治疗效果。
- 这种方法解决了传统伤口敷料的关键局限性。
常见问题
Executive Industry Relevance
Chronic wound management remains a significant translational challenge due to the need for controlled, localized delivery of regenerative agents. The core-sheath 3D-bioprinted scaffold enables tunable extracellular vesicle (EV) release, supporting predictive confidence in tissue repair strategies. This platform approach offers scalable, reproducible integration of bioactive delivery systems into early-stage regenerative medicine pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of EV-mediated regenerative pathways in disease-relevant wound models.
- Supports biological de-risking by isolating the impact of controlled EV release on tissue repair.
- Facilitates functional validation of EVs as therapeutic agents in chronic inflammation contexts.
Screening & Assay Development
- Provides a reproducible scaffold platform for quantitative assessment of EV release kinetics.
- Standardizes bio-ink formulation and 3D printing parameters for assay consistency.
- Enables reliable comparison of scaffold compositions and EV loading strategies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns scaffold degradation and EV release profiles with disease-relevant wound healing timelines.
- Supports continuity from in vitro optimization to in vivo preclinical wound models.
- De-risks advancement decisions by enabling quantitative imaging of EV biodistribution.
Pipeline & Workflow Integration
This scaffold fabrication and EV delivery protocol bridges early discovery, screening, and preclinical validation in regenerative medicine workflows.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of EV-driven tissue regeneration in controlled wound environments.
- Screening: Delivers quantitative release profiles and reproducible scaffold architectures for downstream evaluation.
- Analytics: Provides fluorescence imaging outputs for comparative analysis of EV distribution and release kinetics.
- Translational Research: Supports alignment of scaffold performance with preclinical disease models, such as diabetic wounds.
- Enterprise Reuse: Offers a modular, adaptable platform for future therapeutic and biomaterial development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in EV-based regenerative strategies and target validation.
- Operational Value: Standardizes scaffold fabrication and EV incorporation for reproducible results.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing quantitative, scalable delivery data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of advanced wound care and regenerative medicine assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in 3D bioprinting, bio-ink formulation, and EV isolation.
- Demands access to imaging systems for quantitative EV release and biodistribution analysis.
- Necessitates cross-team standardization of scaffold design and printing parameters.
- Adaptable to various wound models and EV sources with protocol optimization.
- Dependent on consistent EV characterization and scaffold reproducibility for translational success.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:13
Mesenchymal Stem Cell (MSC) Culture and Isolation of Extracellular Vesicles (EVs) for Wound Management
4:56
3D Bioprinting of Alginate-Carboxymethyl Cellulose Alginate Lyase Scaffold Structure
7:37
Tracking Extracellular Vesicle (EV) Release in Wound Healing
8:56
Results
