利用同轴3D生物打印支架优化细胞外囊泡递送以管理慢性伤口

研究范围是开发一种先进的生物活性伤口敷料设计，以有效管理慢性伤口。该支架将确保对细胞外囊泡的控制、降解和高效局部递送。

本方案旨在克服传统伤口敷料在管理慢性炎症方面的局限性，特别是缺乏对降解过程以及细胞外囊泡适时释放的控制。

本方案提供了一种可调节的方法，能够及时递送包括基因在内的多种治疗剂，适用于各类应用。

所有结果为进一步针对不同类型的伤口定制支架，以及通过负载特定生物活性分子的细胞外囊泡来增强再生治疗提供了新的见解。

我们的实验室将建立一个转化研究平台，以解决糖尿病伤口愈合问题。

[旁白] 首先，将一管间充质干细胞在37摄氏度水浴中快速解冻。当管内尚存少量冰晶时即取出。将间充质干细胞管中的全部内容物转移至含有完全培养基的15毫升锥形离心管中。在室温下以200 × g离心5分钟。吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于1毫升预温的完全培养基中。随后将细胞转移至含有4毫升完全培养基的T25培养瓶中。轻轻倾斜T25培养瓶，确保细胞均匀分布。将培养瓶置于37摄氏度、5%二氧化碳环境中孵育。当细胞融合度达到70%至80%时，吸除T25培养瓶中的废弃培养基。向培养瓶中加入3毫升新鲜PBS，以去除残留细胞。接着向培养瓶中加入1毫升0.25%胰蛋白酶溶液，并进行孵育。在显微镜下以4倍物镜观察细胞脱落情况。然后向培养瓶中加入4毫升预温的完全培养基，反复吹打瓶壁以促进细胞完全脱落。将细胞悬液转移至15毫升离心管中。离心后，将细胞沉淀重悬于新鲜完全培养基中，并进行细胞计数。随后以每平方厘米5,000个细胞的接种密度将细胞转移至T75培养瓶中。将T75培养瓶置于37摄氏度、5%二氧化碳环境中孵育。72小时后，收集细胞的条件培养基用于细胞外囊泡（EVs）的分离。为分离细胞外囊泡（EVs），将收集的13毫升条件培养基在800 × g下离心15分钟，以去除细胞碎片。使用0.22微米注射器滤器过滤上清液，以去除大颗粒杂质。向过滤后的条件培养基中加入5毫升沉淀缓冲液。充分涡旋混合，确保溶液均匀。将混合物在4摄氏度下孵育过夜，使细胞外囊泡充分沉淀。随后在20摄氏度下以3,220 × g离心30分钟，确保离心管平衡。小心弃去上清液，避免扰动沉淀，再短暂离心5秒。随后轻轻将EV沉淀重悬于200微升PBS中，以避免损伤囊泡结构。进行Western blot检测细胞外囊泡特异性标志物，包括CD63、CD81和CD9。在无菌超纯水中配制新鲜的4.5%海藻酸钠溶液。在60摄氏度下搅拌过夜，确保完全溶解。接着，在无菌超纯水中溶解羧甲基纤维素，配制成3.8%溶液。将制备的生物墨水在25摄氏度下以3,220 × g离心10分钟，以去除可能干扰打印过程的气泡。使用注射器混合器，将3毫升制备好的海藻酸钠溶液与标记的EVs或透析对照混合。轻柔混匀，确保形成均匀悬液。使用另一注射器混合器，将1毫升羧甲基纤维素与新配制的海藻酸酶溶液在无菌超纯水中混合，最终浓度为0.5毫单位/毫升。同时将海藻酸钠-EV生物墨水装入注射装置的芯部，将羧甲基纤维素-海藻酸酶生物墨水装入鞘部。启动3D生物打印机软件。选择具有对角线填充模式的圆柱形结构以构建支架。设定圆柱直径为20毫米，高度为1.1毫米。配置孔径为1毫米。设定芯部和鞘部喷嘴的泵送速度为每秒1毫米，每层厚度为0.25毫米。设定移动速度为每秒6毫米，在室温下打印四层。使用含气溶胶氯化钙的加湿器，在挤出过程中对支架进行交联。开始在聚酯膜上打印支架。将加湿器喷嘴置于距挤出头约20厘米处，以确保有效交联。将支架浸入2.2%氯化钙溶液中10分钟，完成交联过程。用无菌超纯水冲洗支架三次，以去除多余的氯化钙及未结合的生物墨水。使用电动剪刀对麻醉的OCTA糖尿病小鼠背部皮肤进行剃毛，避免皮肤刺激或损伤。随后在每只小鼠背部制造一个直径6毫米的圆形全层皮肤伤口。将含有PKH标记细胞外囊泡的3D生物打印支架轻柔地放置于创面床。确保支架完全覆盖创面，并用无菌镊子轻轻按压，以减少气泡产生。在植入后2小时、4小时、8小时和24小时，将麻醉的小鼠转移至IVIS成像系统。在成像向导中选择荧光成像模式，并激活PKH染料的激发和发射滤光片。调整相机设置，包括视野和样本高度，以优化信号检测。开始采集图像，保存所得数据。随后分析标记EVs释放的荧光信号。与仅含羧甲基纤维素的海藻酸钠EV支架相比，海藻酸钠EV/羧甲基纤维素-海藻酸酶支架在2小时和4小时时间点表现出更快的释放动力学。