利用纳米纤维膜建立上皮细胞三维共培养模块

我们的研究团队使用聚乙烯醇（PVA）和聚己内酯（PCL）纳米纤维膜，构建一种三维共培养系统。该系统旨在探究这些膜如何支持上皮细胞和成纤维细胞，模拟组织微环境，从而促进对细胞模式信号传导及细胞间相互作用的研究。我们将展示，多孔的静电纺丝纳米纤维膜可使上皮细胞形成多层上皮组织，并允许成纤维细胞在额外的基质中生长。

本方法强调了与传统的二维培养相比，扩展的三维系统可为生长中的组织提供更优越的环境。我们提供了一种采用已分化上皮细胞的共培养系统。利用干细胞进行构建需要复杂的分化步骤，而我们的模型在三维共培养系统的构建中具有操作简便和节省时间的优势。

我们通过将纳米纤维膜与上层水凝胶在共培养体系中结合，以克服纳米纤维支架的局限性。首先，将0.02克聚丙烯酸和1克聚乙烯醇加入含有磁力搅拌子的洁净玻璃瓶中。向瓶中加入7.8毫升蒸馏水，然后将瓶子置于搅拌器上。

待瓶子冷却至室温后，向其中加入0.2毫升戊二醛，并以500转/分钟的速度在磁力搅拌器上继续搅拌30分钟，温度保持在室温。使用5毫升注射器进行静电纺丝。将活塞与针筒分离，并清除针筒内部及活塞尖端的微小塑料碎屑。

接下来，使用针头阻塞液体流动，将PVA溶液倒入每个注射器筒中。将推杆装入筒内，然后取下针头。组装一个新的27号金属针头后，将其放入静电纺丝机中。

用铝箔将收集器紧密包裹。待注射器面板恢复至原始位置后，将静电纺丝机设置为注射体积2毫升、注射速率为每分钟6微升、滚筒转速为100转/分钟、针尖至收集器距离为14厘米。检查每台泵的液体流动情况，然后以约12千伏的电势运行静电纺丝机。

电纺过程完成后，将含有纤维膜的铝箔从收集器上取下。将纳米纤维膜在真空条件下存放在干燥剂中。向一个洁净的玻璃瓶中加入1.5克PCL和8.5毫升氯仿。

将瓶子置于平板搅拌器上，在室温下用氯仿溶解PCL 12小时。剪取一小块纳米纤维膜，通过自动溅射工艺镀上约五分钟的薄金层。首先，将制备好的PVA纳米纤维膜裁剪成适合Transwell插件的所需尺寸的小片。

准备一个含有1.5毫升纯盐酸的小培养皿。将盛有盐酸的培养皿与纳米纤维片段一同放入真空室中，并关闭盖子。然后打开连接真空泵的阀门，等待10秒，直至盐酸蒸气上升。

关闭阀门，用盐酸蒸气处理膜2分钟。盐酸处理后，向膜上滴加数滴蒸馏水。将膜置于玻璃载片上，并从铝箔上取下。

使用自动溅射镀膜仪在碳导电胶带上镀一层薄金膜。然后用 PBS 缓冲液将经盐酸交联的 PVA 纳米膜洗涤三次，并将其浸泡于培养基中。浸泡后，检测 pH 值以确认无残留盐酸。

首先，将纳米纤维膜切割成圆形片状，PVA 纳米膜直径为 10 毫米，PCL 纳米膜直径为 13 毫米。在塑料杯中按 10:1 的质量比混合 SYLGARD 184 基液与固化剂。使用洁净的玻璃载片剧烈搅拌聚二甲基硅氧烷（即 PDMS 溶液）2 至 3 分钟，直至产生气泡。

将PDMS均匀涂布在玻璃载片上。将插入式培养小室的底边轻轻浸入PDMS中。然后将插入式培养小室倒置放在载片加热板上，加热10至15分钟，直至PDMS固化。

使用200微升移液枪头检查PDMS，确保其不再发粘。现在，轻轻将插入式培养小室压在PVA纳米膜片上，使插入式培养小室的底部朝向膜的纳米纤维侧。在小室中央加入一滴蒸馏水，并用镊子小心移除铝箔。

然后将含有插入物的孔放入新的24孔板中，使膜自然干燥。在固定纳米膜片时，将200微升移液器吸头浸入PDMS混合液中，精确地在孔的四个角和中心各点一滴。将板置于载片加热器上，使PDMS固化5至7分钟。

接下来，将PCL纳米膜片放入含PDMS的孔中，使纳米纤维面与PDMS贴合。使用干净的小刷子轻轻按压膜的箔片面，以确保完全贴附。然后向孔中加入0.2毫升70%乙醇，以促进箔片的去除。

在跨孔实验装置中，将插入物和底部孔板置于紫外线下过夜灭菌。次日，用三轮各10分钟的洗涤程序清洗插入物和底部孔板，每轮分别向插入物中加入200微升PBS，向底部孔板中加入500微升PBS。当细胞达到70%至80%融合度时，用10毫升PBS洗涤细胞，然后加入2毫升0.05%胰蛋白酶EDTA进行消化。

轻轻敲击培养皿，使细胞从底部脱落。加入8 mL完全培养基以中和胰蛋白酶活性，然后将细胞悬液转移至50 mL离心管中。在400 ×g下离心5分钟。

弃去上清液后，将细胞沉淀重悬于5 mL含F12的完全DMEM培养基中。然后在底层小室中加入500 µL含F12的完全DMEM培养基。将带有PVA纳米纤维膜的插入物转移至Transwell中，并加入50 µL MLE-12细胞悬液。

接下来，向含有PCL纳米纤维膜的下层小室中加入500微升NIH3T3细胞悬液。将细胞孵育2小时后，在Transwell装置中组装含有MLE-12细胞的插入式培养小室和含有NIH3T3细胞的下层小室。在共培养系统中，NIH3T3细胞与MLE-12细胞的空间分布清晰可辨：绿色的NIH3T3细胞分散于不同深度，而红色的MLE-12细胞则形成层状结构。NIH3T3细胞可浸润PCL纳米纤维膜并沿纳米纤维轴向延伸，而MLE-12细胞则黏附于PDA纳米纤维膜表面并呈现聚集状态。