使用纳米纤维膜建立上皮细胞的三维共培养模块

我们的研究小组使用聚乙烯醇、PVA 和聚 ε-己内酯、PCL 纳米纤维膜来开发 3D 共培养系统。它旨在回答膜如何支持上皮细胞和成纤维细胞、模拟组织环境并促进模式信号和细胞相互作用的研究。我们将展示多孔电纺纳米纤维膜允许上皮细胞形成上皮组织，允许多层和成纤维细胞在每个额外的基质中生长。

这些方法强调了与传统 2D 培养相比，扩展的 3D 系统如何为生长的组织提供更好的环境。我们提供采用分化上皮细胞的共培养系统。使用干细胞进行组织需要复杂的分化程序，但我们的模型在开发 3D 共培养系统方面具有简单性和节省时间的优势。

我们专注于通过在共培养中将纳米纤维膜与超层水凝胶相结合来克服纳米纤维支架的局限性。首先，将 0.02 克聚丙烯酸和 1 克 PVA 加入装有磁棒的干净玻璃瓶中。向瓶子中加入 7.8 毫升蒸馏水，然后将瓶子放在板式搅拌器上。

瓶子冷却至室温后，加入 0.2 毫升戊二醛，然后在室温下以 500 RPM 的转速放回板搅拌器上 30 分钟。使用 5 毫升注射器进行静电纺丝。将柱塞与针筒分开，并清理针筒内和柱塞尖端的小塑料碎屑。

接下来，使用针头阻止液体流动并将 PVA 溶液倒入每个注射器桶中。将柱塞组装到针筒中并取出针头。组装新的 27 号金属针后，将其放入静电纺丝机中。

用铝箔将收集器紧紧包裹起来。一旦注射器面板回到原来的位置，将静电纺丝机的注射量设置为 2 毫升，注射速度为每分钟 6 微升，滚筒速度为 100 RPM，尖端到收集器的距离为 14 厘米。检查每个泵的液体流量，然后以大约 12 kV 的电位运行静电纺丝机。

静电纺丝过程完成后，从收集器上拆下含有纤维毡的箔片。将纳米纤维垫存放在真空下的干燥剂中。将 1.5 克 PCL 和 8.5 毫升氯仿加入一个干净的玻璃瓶中。

将瓶子放在平板搅拌器上，在室温下将 PCL 溶解在氯仿中 12 小时。切下一小块纳米纤维膜，使用自动溅射工艺在薄膜上涂上一层薄薄的金层，持续 5 分钟。首先，将制造的 PVA 纳米纤维垫切成所需尺寸的碎片，用于 transwell 插入物。

准备一个装有 1.5 毫升纯盐酸的小培养皿。将装有盐酸的培养皿和纳米纤维片放入真空室中，然后盖上盖子。然后打开连接到真空泵的阀门，等待 10 秒钟，直到盐酸烟雾上升。

关闭阀门并用盐酸烟雾处理膜 2 分钟。盐酸处理后，向膜中加入蒸馏水滴。将膜放在载玻片上，然后将其从箔片上取下。

使用自动溅射镀膜机在碳带上涂上一层薄薄的金。然后用 PBS 洗涤与盐酸交联的 PVA 纳米膜 3 次，并将其浸泡在培养基中。浸泡后，检查 pH 值以确认没有残留的盐酸。

首先，将纳米纤维垫切成直径为 10 毫米的圆块（用于 PVA 纳米膜）和 13 毫米（用于 PCL 纳米膜）。在塑料杯中以 10:1 的质量比混合 SYLGARD 184 碱和固化剂。使用干净的载玻片将聚二甲基硅氧烷或 PDMS 溶液剧烈混合 2 到 3 分钟，直到形成气泡。

将 PDMS 均匀地铺在载玻片上。将插件的底部边缘略微浸入 PDMS 中。然后将插件倒置在载玻片加热器上 10 到 15 分钟，直到 PDMS 变硬。

用 200 μL 移液器吸头检查 PDMS，确保其不再粘稠。现在，轻轻地将插入孔压在 PVA 纳米膜片上，使插入孔的底部面向膜的纳米纤维侧。在孔中心加入一滴蒸馏水，用镊子小心地去除箔纸。

然后将插入孔放入新的 24 孔板中，让膜干燥。连接纳米膜片时，将 200 微升移液器吸头浸入 PDMS 混合物中，并将其精确点在孔的四个角和中心。将板放在载玻片加热器上，让 PDMS 硬化 5 到 7 分钟。

接下来，将 PCL 纳米膜片放入 PDMS 包含孔中，纳米纤维侧连接到 PDMS。使用干净的小刷子轻轻按压膜的铝箔侧以完全连接。然后向孔中加入 0.2 毫升 70% 乙醇，以便于去除箔片。

在紫外线下对 transwell 设置中的插入物和底孔消毒过夜。第二天，向小室中加入 200 μL PBS，向底井中加入 500 μL PBS，洗涤小室和底部井，进行三个循环，每个循环 10 分钟。一旦细胞达到 70% 至 80% 的汇合度，用 10 毫升 PBS 洗涤它们，并加入 2 毫升 0.05% 胰蛋白酶 EDTA 以胰蛋白酶消化它们。

轻轻敲击培养皿，使细胞从底部脱落。加入 8 毫升完全培养基以中和胰蛋白酶，然后将细胞悬液转移到 50 毫升离心管中。将试管以 400G 离心 5 分钟。

丢弃 supra natant 后，将细胞沉淀重悬于 5 毫升含 F12 培养基的完整 DMEM 中。然后用 500 微升完整的 DMEM F12 培养基填充底部孔。将 PVA 纳米纤维膜附着的插入物转移到 transwell 上，并加入 50 微升 MLE-12 细胞悬液。

接下来，用 500 微升 NIH3T3 细胞悬液填充 PCL 纳米纤维膜附着的底井。将细胞孵育 2 小时后，在 transwell 设置中组装含有插入片段的 MLE-12 细胞和含有底阱的 NIH3T3 细胞，NIH3T3 细胞和 MLE-12 细胞在共培养系统中的空间分布清晰可区分，绿色 NIH3T3 细胞分散在不同深度，红色 MLE-12 细胞形成层。NIH3T3 细胞浸润 PCL 纳米纤维膜并沿纳米纤维轴延伸，而 MLE-12 细胞粘附在 PDA 纳米纤维膜表面并表现出聚集。