Name: 从原子力显微镜衍生的力图中提取天然小鼠肺基底膜的杨氏模量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-31T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: 了解原子力显微镜测量小鼠肺基底膜杨氏模量的方法。该技术通过冷冻切片保留样本天然力学特性，助力研究基底膜刚度与癌细胞侵袭的关系，为癌症诊断和治疗提供新思路。

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B.H. 和 H.C.-S. 感谢巴伐利亚州科学与艺术部通过巴伐利亚研究重点“三维组织的制备与生物物理表征”（CANTER）项目以及巴伐利亚学术论坛（BayWISS）-健康研究博士联盟提供的资助。数据分析软件 CANTER Processing Toolbox 的开发由德国研究基金会资助，属于研究联盟“探索骨关节炎中关节软骨与软骨下骨的退变与再生——ExCarBon”（FOR2407-1/2）的子项目1（CL 409/4-1/2）。B.H. 和 H.C.-S. 还感谢德国研究基金会通过大型仪器设备计划 GGA-HAW（INST 99/38-1）提供的资助。本工作还得到了丹麦癌症协会（R204-A12454（R.R.））和德国研究基金会（项目编号 539446614 至 R.R.）的支持。

作者声明无竞争利益。

由于基底膜（BMs）的力学特性会影响多种细胞功能，如肿瘤出芽、细胞分化、细胞运动以及染色质的可及性53,63,64,65,66,67,68，因此其力学特性已受到广泛关注。然而，在以一致且可量化的方式评估基底膜力学性能方面，仍存在尚未满足的技术需求。本实验方案旨在帮助原子力显微镜（AFM）使用者测定来自野生型或基因修饰小鼠的健康或病变肺组织样本中肺部基底膜的杨氏模量。基于MATLAB开发的用户友好型图形界面应用程序CANTER Processing Toolbox56可协助完成AFM数据的后续分析。本方案预期将有助于其他研究人员开展相关研究，推动肺部疾病在临床诊断、疾病管理或新治疗策略方面的进展。
该实验方案的关键步骤包括：在肺组织标本进行冷冻切片时，必须确保组织切片在任何阶段均不发生融化，以防止因冻融循环导致其力学性质发生改变。因此，必须仅使用预冷的显微镜载玻片来收集切片，并且所有操作均需在冷冻切片机的冷冻室内完成。在肺泡壁上记录力图谱过程中最关键的步骤是利用所生成的斜率图像，该图像可提供探查区域刚度分布的定性概览，从而帮助识别基底膜（BM）的合适测量位置。对所获得的杨氏模量值进行空间滤波是本方案中的关键步骤，也是CANTER处理工具箱的核心功能之一。该滤波步骤使研究人员能够通过基底膜相较于两侧较软细胞层所表现出的独特较高刚度特征，识别出基底膜，并提取其对应的杨氏模量值用于后续分析。
这种高级分析工作流程显示，与野生型同窝小鼠相比，netrin-4 基因敲除小鼠肺基底膜的杨氏模量显著升高（约两倍）53。因此，本方案有助于对不同条件或组别进行比较分析。
除了原子力显微镜（AFM）之外，还存在多种用于检测生物材料力学性能的方法，包括在分子水平上的光镊或磁镊69,70,71，在中等尺度上的微压痕技术72,73，以及在宏观尺度上的受限或非受限压缩测试74,75。具体而言，压力血管造影法、拉伸测试76,77和流变学78已被用于评估血管样本及重建的基底膜（BM）基质的刚度。然而，像压力血管造影法和拉伸测试这类技术仅能评估完整组织或整体组织结构（如整个血管）的力学特性，而这些结构包含多种细胞层和结构组分。因此，在使用这些方法评估基底膜生物力学时，非基底膜组分（如细胞成分）的力学性能总会叠加在基底膜的结果之上，难以单独分离出基底膜自身的特异性力学性质。
在本方案中，通过力图结果的空间滤波提取目标特征（基底膜，BM）。该方法的一个局限性在于，要求目标特征在获得的杨氏模量图或其他可用图通道中能够被清晰分辨并识别为独立的模式。例如，肺泡组织中的基底膜之所以可被识别，仅因其相互连接的结构表现出显著高于周围细胞的杨氏模量。因此，基底膜在获得的杨氏模量图中呈现为连续的亮条带。然而，其他生物结构的力学性质与其周围组织差异不足，无法通过图谱结果进行空间滤波分离。尽管本方案可与其他方法结合用于在记录的力图中识别结构（如免疫荧光染色），但此类方法可能产生难以解释的结果。这一问题可能源于染色过程会改变组织的力学性质。因此，在原子力显微镜（AFM）测量前，仅在没有其他替代方法可识别目标特征时，才应对组织进行任何处理或染色。此外，必须开展适当的对照实验，比较染色与未染色样品的生物力学特性。
该方案介绍了一种基于杨氏模量差异来识别目标结构的方法。因此，该方法可应用于具有与肺部类似的解剖学基底膜（BM）的组织，包括甲状腺、结肠和前列腺（参见Hartmann等人59的扩展数据图）。尽管该方案最初是为分析基底膜力学特性而开发，但本方案及CANTER处理工具箱56具有足够的通用性，可用于检测原子力显微镜（AFM）力图中任意力学性质不同且连续的区域（详见&#160;www.github.com/CANTERhm/CANTER_Processing_Tool/wiki 的操作说明）。这种广泛的适用性使该工具在整个AFM领域具有重要价值，并支持了科学界日益关注的力学生物学研究。&#160;

原子力显微镜（AFM）力图谱已成为一种广泛应用的技术，可用于测定多种生物样品的纳米力学特性，其空间分辨率达纳米级，力灵敏度达皮牛顿级1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12。P. Hansma 及其同事率先开展了在生理条件下将 AFM 测量应用于生物样品的研究13,14,15,16,17,18,19,20。随后，AFM 力测量被用于评估单个分子21、活细胞及其细胞骨架9,10,22,23,24,25,26、组织及组织切片6,8,11,27,28,29,30,31，以及生物水凝胶3,4,32的力学性质。在我们的研究中，我们使用 AFM 检测了生物和化学键的力学特性18,33,34,35,36,37，以及单个细胞的纳米力学特征38,39,40。此外，对生长板软骨的测量8表明，细胞外基质（ECM）的胶原结构和杨氏模量可引导软骨细胞分裂，从而决定小鼠胚胎发育过程中生长板的生长方向。进一步地，我们研究了关节软骨中与软骨退变和骨关节炎相关的变化2,41,42,43,44,45,46,47。
近年来，大量原子力显微镜（AFM）研究已对健康与病变肺组织的力学特性进行了考察48,49,50,51,52。然而，这些研究主要关注整体组织的力学性能，而非特定组织成分（如基底膜（BM））。BM 是一种特化的细胞外基质（ECM）结构，构成一层薄层（在人类中为 100 nm - 400 nm），覆盖大多数哺乳动物器官和组织结构，例如神经元、肌肉、脂肪组织和血管。我们发现，小鼠肺部 BM 的力学特性在转移灶形成过程中起着关键作用，其中较柔软的 BM 与乳腺癌和肾癌患者的较高生存概率相关53。此外，该研究揭示，分泌型细胞外基质蛋白 netrin-4 通过与层粘连蛋白 γ1（laminin γ1）发生化学计量比为 1:1 的相互作用，降低 BM 的杨氏模量；而 laminin γ1 是几乎所有 BM 内层粘连蛋白网络中的关键组分40。
在此，我们展示了所开发的用于测定杨氏模量（Young's modulus）的实验方案的可视化流程E骨髓) 小鼠肺部基底膜（BM）的厚度为100–200 nm。BM的杨氏模量是衡量其刚度的指标，定义为线性弹性变形过程中应力（单位面积上的力）与相应轴向应变（位移）的比值。54，此处指AFM探针压入导致的基质微小压缩。在AFM实验中，可通过AFM悬臂的偏转量和悬臂位置获得作用力与位移（压入深度），并利用合适的弹性模型（本例中为修正的赫兹模型）对所得的力-压入深度曲线进行分析，从而提取杨氏模量（应力-应变关系）。55）。主要步骤如图所示 图1首先，本方案详细阐述了小鼠肺组织样本的制备及在OCT包埋剂中的包埋方法（见步骤1），以利于后续进行冷冻切片（步骤2），从而通过原子力显微镜（AFM）力图谱测定基底膜（BM）的刚度。本文所介绍的冷冻切片技术采用单面胶带和双面胶带，可在无需固定且切片不融化的情况下完成肺组织切片。第三部分详细说明了用于采集评估BM刚度所需数据的AFM操作流程。在方案的下一部分中，我们解释了如何利用自主开发的基于MATLAB的软件——CANTER Processing Toolbox，对获得的力体积数据进行自动分析（步骤4.1）。56在此步骤中，通过拟合修正的赫兹模型，从每条记录的力-压痕曲线中提取杨氏模量，该模型已针对压头几何形状（本例中为四棱锥）进行了校正。55最后，我们在步骤4.2和4.3中描述如何应用空间滤波工具和R2 开发的工具箱中的过滤工具，用于从力图中获取的包含肺泡壁所有组织区室的全面杨氏模量值集合中，提取出特异性对应于基底膜（BM）的杨氏模量值。

<table><tbody><tr><td>1 mL 注射器</td><td>B Braun</td><td>9166017V</td><td>Injekt-F</td></tr><tr><td>10 mL 注射器</td><td>B Braun</td><td>4606108V</td><td>Injekt Luer Solo</td></tr><tr><td>15 mL Falcon 管</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.002</td><td>带螺帽的离心管</td></tr><tr><td>悬臂梁 - MLCT</td><td>Bruker AFM Probes</td><td>3444</td><td>具有锥形尖端结构的原子力显微镜悬臂梁</td></tr><tr><td>冷冻切片机刀片</td><td>Leica Biosystems</td><td>14035843496</td><td>低剖面一次性刀片 DB80LX</td></tr><tr><td>冷冻切片机样品夹持器</td><td>Leica Biosystems</td><td>14047740044</td><td>标本盘 30</td></tr><tr><td>冷冻切片机</td><td>Leica Biosystems</td><td>CM1950</td><td>Leica 冷冻切片机</td></tr><tr><td>直接叠加扩展模块</td><td>Bruker</td><td></td><td>用于 JPK SPM 软件的软件扩展模块，可将倒置显微镜的光学图像导入 SPM 软件的数据查看器中。</td></tr><tr><td>一次性底模</td><td>Science Services</td><td>SA62534-15</td><td>Tissue-Tek 冷冻模具 15×15×5 mm</td></tr><tr><td>双面胶带</td><td>tesa Film</td><td>56661-00002</td><td>相纸胶带</td></tr><tr><td>固定弹簧悬臂梁夹持器</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>倒置显微镜 - Leica DMi8</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JPK 电动载物台</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JPK NanoWizard 4XP BioScience</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JPK SPM 软件</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>K5 CMOS 显微镜相机</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td></td><td>版本 R2024a 或更高</td></tr><tr><td>MATLAB - 曲线拟合工具箱&amp;nbsp;</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB - 图像处理工具箱</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB - 信号处理工具箱&amp;nbsp;</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB - 统计与机器学习工具箱</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>Carl Roth</td><td>H869.1</td><td>用于悬臂梁校准的普通显微镜载玻片</td></tr><tr><td>显微镜载玻片 - 带磨砂边缘</td><td>Carl Roth</td><td>H870.1</td><td>用于冷冻切片的带磨砂边缘显微镜载玻片</td></tr><tr><td>针头 &amp;oslash;0.9 mm &amp;times; 25 mm</td><td>B Braun</td><td>4657500</td><td>用于向肺组织样本中注射 OCT 包埋剂&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>针头 &amp;oslash;0.9 mm &amp;times; 70 mm</td><td>B Braun</td><td>4665791</td><td>长针头，用于在原子力显微镜下施加 PBS</td></tr><tr><td>OCT 包埋剂</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td>Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Bio&amp;Sell</td><td>BS.L1825</td><td>不含 Ca²⁺、Mg²⁺ 的 PBS 溶液，500 mL</td></tr><tr><td>QI 高级成像扩展模块</td><td>Bruker</td><td></td><td>用于 JPK SPM 软件的软件扩展模块，可为每个记录的图像像素提供其对应的完整力曲线。</td></tr><tr><td>手术刀</td><td>B Braun</td><td>5518083</td><td>一次性外科手术刀</td></tr><tr><td>剪刀</td><td>Kaut-Bullinger</td><td>M681700</td><td>精密剪刀 13 cm&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>单面胶带</td><td>tesa Film</td><td>57330-00000</td><td>透明胶带，33 m × 19 mm</td></tr><tr><td>载玻片盒</td><td>GWL Storing Systems</td><td>K50W</td><td>可存放 50 片载玻片的载玻片盒</td></tr><tr><td>体视显微镜 - Stemi DR1663</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>镊子 - Vomm SS-SA-ESD</td><td>Eleshop</td><td>ELE002121</td><td></td></tr></tbody></table>

从原子力显微镜力图中提取天然小鼠肺基底膜的杨氏模量

Extracting the Young's Modulus of Native Murine Pulmonary Basement Membranes from Atomic Force Microscopy Derived Force Maps

原子力显微镜（AFM）能够以数十纳米的空间分辨率对样品的力学特性进行表征。由于哺乳动物细胞能够感知并响应其直接微环境的力学特性，因此以高空间分辨率表征组织的生物力学特性对于理解多种发育、稳态及病理过程至关重要。基底膜（BM）是一种厚度约为100–400 nm的细胞外基质（ECM）亚结构，在肿瘤进展和转移形成中发挥重要作用。尽管测定如此薄的ECM亚结构的杨氏模量具有挑战性，但BM的生物力学数据为理解BM如何影响细胞行为提供了全新的基础性见解，同时也具有重要的诊断潜力。本文展示了一种用于评估小鼠肺组织中基底膜力学性能的可视化实验方案，肺是易发生转移的主要器官之一。我们描述了一种高效的工作流程，用于测定位于肺组织内皮细胞层与上皮细胞层之间的基底膜的杨氏模量。该逐步操作流程包括小鼠肺组织的冷冻、冷冻切片以及在组织切片上进行AFM力图采集。此外，我们提供了一种使用CANTER处理工具箱的半自动数据分析方法，该工具箱是我们实验室自主开发的用户友好型AFM数据分析软件。该工具可实现记录的力图的自动加载、将力-压电伸长曲线转换为力-压痕曲线、计算杨氏模量，并生成杨氏模量分布图。最后，本文展示了如何通过空间滤波工具确定并提取源自肺部基底膜的杨氏模量数值。

在识别并测量完整的肺泡壁后，本实验方案的主要结果是肺泡基底膜（BM）的过滤后杨氏模量值。需要注意的是，并非每一张组织切片都能找到适合进行原子力显微镜（AFM）测量的肺泡壁。根据我们的实验观察，约75%的小鼠肺组织冷冻切片中可观察到可定量分析的肺泡壁。为了准确测定肺部基底膜杨氏模量的空间分布，建议采用覆盖3 µm × 3 µm或4 µm × 4 µm区域的力图谱。该方法可为小鼠肺部基底膜（通常厚度为100 nm – 200 nm）提供足够的分辨率。因此，实验过程中需在每个力图谱上采集50 × 50个力-距离曲线，共计2,500条力曲线。在力图谱中，这些力曲线呈均匀分布。这意味着即使在较小的力图谱范围内，除基底膜本身的杨氏模量外，其周围组织结构也会被探测到。因此，为了准确且特异性地仅测定肺部基底膜的杨氏模量，本方案中采用了两步过滤流程。
操作者依赖的空间滤波初始筛选步骤用于选择源自小鼠肺部基底膜（BM）的力曲线拟合结果，这些结果约占所分析力图中总结果值的10%至25%。完成该初步空间滤波后，通常保留约250至625个拟合结果用于后续分析。下一步滤波步骤确保仅纳入那些由经修正赫兹（Hertz）模型充分描述的力曲线所得出的与基底膜相关的结果。因此，采用修正赫兹模型拟合的决定系数（R2）作为滤波标准。根据我们的实践经验，对于遵循本实验方案所获得的拟合结果，保留R2值高于0.96的结果是合适的。需要注意的是，R2值显著受力曲线基线的质量（平滑度）和长度、接触点的确定以及拟合模型收敛性的影响。在完成上述两项滤波程序后，通常每条肺泡壁的基底膜可保留约100至500个杨氏模量值。
可通过直方图可视化基底膜（BM）中剩余的这些杨氏模量值的分布情况（图4A）。需要注意的是，肺部基底膜所得杨氏模量值呈对数正态分布，这种分布通常出现在只能取正值的随机变量中61。这一点可通过图4B中的QQ图加以验证。因此，可对经对数变换后的杨氏模量（E）值分布拟合正态（高斯）分布。本研究中采用自然对数（ln）对E值进行变换。通过该拟合提取分布的峰值位置（µ）和标准差（σ），并进一步反向变换，利用以下公式获得代表性的杨氏模量，记为EBM：
<img alt="数学建模中使用的指数函数公式 \( E_{BM}(\mu) = e^{\mu} \)。" src="/files/ftp_upload/67784/67784eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 1">
需要注意的是，在重新变换后，标准差区间不再以峰值为中心对称。标准差区间的负向（σ-）和正向（σ+）边界可通过以下公式计算：
<img alt="静态平衡，公式 σ = e^(μ-σ) - e^μ，方程，物理计算。" src="/files/ftp_upload/67784/67784eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="方程 2">
<img alt="对数正态分布方程，σ₊=e^(μ+σ)−e^μ，用于统计分析的公式。" src="/files/ftp_upload/67784/67784eq03.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="方程 3">
这些方程源于指数函数是自然对数函数的反函数这一事实62。
根据图4A中直方图确定的峰值μ = 9.31和标准差σ = 0.18进行反变换后，代表性杨氏模量值为EBM = 11.05 kPa，其标准差区间为[-1.82 kPa, +2.18 kPa]。或者，可将对数正态分布拟合到未变换的杨氏模量（E）值的直方图上，以确定该分布的特征参数。
建议每只小鼠至少分析四个血管壁，以获得可靠的代表性结果，这一点我们在 Hartmann 等人59的研究中已详细说明。为了确定小鼠的代表性杨氏模量 EBM，将四个血管壁的对数转换值绘制在一个合并的直方图中，并通过拟合正态分布确定 µ 和 σ。随后，如前所述将 µ 和 σ 进行逆变换，以获得该小鼠的 EBM 及其标准差区间。
<img alt="样品制备至原子力显微镜力体积分析；包括冷冻切片、数据拟合与分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67784/67784fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：测定小鼠肺基底膜杨氏模量的主要实验流程概览。 首先获取并制备小鼠肺组织，随后进行包埋。具体操作为向肺组织内注射OCT包埋剂与PBS的混合液，再将肺组织完全浸入OCT包埋剂中。之后，使用冷冻切片机进行冷冻切片，获得厚度为15 µm的肺组织切片。本实验方案中，详细描述了使用单面与双面胶带固定样品以确保切片过程中样品位置稳定的方法。随后，对组织切片进行原子力显微镜（AFM）力图测量，以测定基底膜（BM）的杨氏模量值。在完成力曲线分析后，通过空间滤波与R²滤波，分离出目标结构（即基底膜）的杨氏模量结果（在力图中以绿色显示，并在对数转换后的杨氏模量分布图中进行量化）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67784/67784fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞结构的显微镜图像；放大视图；扫描数据；细胞成像分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67784/67784fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
图2：在小鼠肺组织切片上进行的典型原子力显微镜力图实验。（A）小鼠肺组织切片的明场显微镜概览图像，可用于识别位于两个肺泡之间的完整肺泡壁。在图像右侧，可见原子力显微镜（AFM）的三角形微悬臂探针F。（B）组织切片中选定肺泡壁的放大视图。（C）和（D）为包含50 × 50个力曲线的15 × 15 µm概览图的斜率通道和高度通道图像。在斜率通道中，基底膜（BM）表现为一条亮线（白色箭头），提示该结构在肺泡壁中具有较高的刚度。高度通道图像证实了肺泡壁的完整性，未见破裂迹象。在15 × 15 µm概览图中识别出基底膜位置后，进一步采集了一个较小的4 × 4 µm力图（E：斜率通道，F：高度通道），同样包含50 × 50个力曲线。比例尺：（A）200 µm，（B–D）25 µm。所示原子力显微镜图像的彩色标尺范围分别为：（C）2.36 – 9.29 nN/µm，（D）0 – 3.38 µm，（E）2.36 – 9.29 nN/µm（概览图）和2.42 – 8.37 nN/µm（小图），（F）0 – 3.38 µm（概览图）和0 – 1.99 µm（小图），颜色由暗至亮表示数值递增。所有原子力显微镜图像均采用线性彩色标尺。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67784/67784fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="杨氏模量图、直方图；弹性分布、微观力学、kPa 图表、示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67784/67784fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 3"> 
图 3：空间滤波过程的可视化。（A）由力曲线分析得到的杨氏模量图，如结果过滤工具中所示，用于对结果进行空间滤波。基底膜（BM）可识别为一条明亮（高杨氏模量值）条带，周围为较软的组织区域。（B）对应于未滤波图（A）的杨氏模量值直方图。在应用（C）空间滤波掩模（绿色区域）后，（D）直方图仅包含来自绿色高亮区域的杨氏模量值，该区域被识别为基底膜。请注意，直方图左侧可见的残余低值可归因于拟合收敛性较差的情况，这些将在后续的 R² 滤波步骤中被剔除。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67784/67784fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="BM杨氏模量（对数尺度）的直方图与Q-Q图、数据分布及正态性评估。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67784/67784fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4：按照本实验方案获得的小鼠肺部基底膜（BM）杨氏模量分布。（A）所得BM杨氏模量值的对数正态化直方图（N = 325）。通过拟合正态分布（黑色实线），确定均值 µ = 9.31，标准差 σ = 0.18。经逆变换后，对应BM的杨氏模量为 EBM = 11.05 kPa，其非对称标准差区间为 [-1.82 kPa, +2.18 kPa]。（B）对数化后的BM杨氏模量值分位数与标准正态分布分位数的Q-Q图。该图表明，除分布左右尾部的少数数值外，所得杨氏模量值主要呈对数正态分布。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67784/67784fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>

本实验方案演示了如何制备小鼠肺组织的冷冻切片，进行原子力显微镜力图实验，并分析数据以测定天然小鼠肺基底膜的杨氏模量。

原子力显微镜（AFM）能够以数十纳米的空间分辨率对样品的机械性能进行表征。

在我们的研究中，我们探讨细胞外基质的力学特性对细胞行为和组织完整性的影响力。我们希望理解细胞与其微环境之间的相互作用如何影响转移形成等病理过程。通过对肺基底膜力学特性的数据挖掘，我们发现较软的基底膜对癌细胞侵袭具有更强的抵抗力。本方案中介绍的方法能够实现对未固定的生物样本进行冷冻切片和力学性能检测，从而保持其机械特性。此外，该方法还展示了如何通过原子力显微镜测量以及本方案中描述的滤波处理程序，单独测定肺泡壁内基底膜的杨氏模量。下一步是进一步了解基底膜刚度的动态变化及其在发育和病理过程中的作用，以期改善诊断方法并指导治疗策略。首先，从零下80摄氏度冰箱中取出含有冷冻最佳切割温度（OCT）包埋剂的小鼠肺组织模具。将双面胶带贴在磨砂边缘载玻片的中央位置。用一个15毫升离心管在胶带上滚动，以确保胶带牢固粘附且无气泡。确保胶带的长度与含有样本的OCT包埋块的宽度一致。用铅笔在载玻片上标记样本信息和切片编号。将准备好的显微镜载玻片插入载玻片盒中。将载玻片盒放入冷冻切片机腔室内，使载玻片冷却。接着，用OCT包埋剂填充样品夹的内侧两圈。将样品置于样品夹中的OCT包埋剂内。将样本架放入冷冻切片机腔室中约10分钟，直至OCT包埋剂完全凝固，样本被牢固固定。然后，将样本架安装到冷冻切片机的切削台上。用冷却的拇指用力按压，将一片单面粘性胶带贴附在样本上。使用冷冻切片机制备15微米厚的组织切片。在切割过程中，使用刷子引导切片，并防止双面胶带脱落。采用带有双面胶带的预冷载玻片，将其牢固地压在切片上以拾取组织。将载有切片的载玻片放回载玻片盒中。使用热噪声法校准悬臂时，将一块显微镜载玻片放置在原子力显微镜（AFM）的样品台上，并将AFM探头放置在样品台上。然后使用步进电机降低原子力显微镜（AFM）探头，直到悬臂架与显微镜载玻片之间的间隙约为一到两毫米。使用带长针头的1毫升注射器将磷酸盐缓冲液（PBS）加到悬臂架的一侧，使其流下并在间隙中形成液体弯月面。在AFM控制软件中进行基于接触的校准，请进入“采集数据”页面并选择“高级视图”选项。单击右上角的菜单按钮进入校准管理器。然后在方法中选择基于接触的方式，并从名称下拉菜单中选择 MLCT-F 悬臂梁作为悬臂梁名称。在设定点字段中输入 1 伏，在扫描次数字段中输入 10。在“采集数据”页面左侧控制面板中，为自动逼近程序输入一个 1 伏的设定点。单击界面左上角蓝色向下的箭头按钮，以启动自动逼近。当逼近完成且悬臂与显微镜载玻片接触后，单击校准管理器窗口中的“校准”按钮以开始校准。校准完成后，关闭校准管理器窗口，并确保在预选目录中生成包含已确定校准结果的校准文件。首先，从冷冻箱中取出含有切片小鼠肺组织的标本玻片。将显微镜玻片放置在原子力显微镜（AFM）的样品台上。单击用户界面右上角带有扳手图标的按钮，进入设置管理器。在“接近设置”部分，将目标高度设为四微米。然后在“高级反馈设置”下的“电流模式设置”部分，将乘数设为1。在当前模式设置的力设置子部分中，从“结束时的模式”下拉菜单中选择“收回压电陶瓷”。在左侧控制面板中设置力压痕曲线的参数。对于NanoWizard 4 XP和MLCT悬臂梁，将设定点力（Setpoint）设为5纳牛，Z长度（Z Length）设为8微米，Z速度（Z Velocity）设为每秒300微米。接下来，定义初始概览力图的位置和大小，使其涵盖整个肺泡壁，从一侧气道延伸至另一侧。将像素数量设置为 50 × 50。记录概览图后，在基底膜上采集更聚焦的力图，尺寸为 3 × 3 微米或 4 × 4 微米，像素数量保持为 50 × 50 曲线。为分析力-压痕曲线，请在 MATLAB 中启动 CANTER 处理工具箱并打开力曲线分析应用程序。然后，为加载肺组织切片的高分辨率力图，单击“选择文件”，导航至保存位置，双击文件，然后选择“加载数据”。当弹出窗口提示输入悬臂梁的校准值时，在相应的编辑字段中输入校准值。点击提交按钮以继续。当第二个弹出窗口出现时，通过点击提交按钮继续定量成像（QI）图的加载过程。加载过程完成后，力图的初始力曲线将显示在屏幕上。在相应的编辑框中将拟合深度设置为 1.5 微米，并为接触点检测算法选择赫兹（Hertz）拟合方式。要将修正后的赫兹模型拟合应用于 QI 图谱的所有力-压痕曲线，请点击“保持并应用于全部”按钮。完成最后一条力曲线分析后，将弹出窗口提示保存文件。单击“是”，然后为结果文件输入名称。在 CANTER 处理工具箱的应用选择窗口中，对 QI 图进行空间滤波时，选择“结果滤波工具”，然后单击“启动应用程序”按钮。要加载拟合结果，请在“结果滤波工具”用户界面顶部菜单栏中单击“打开”。在随后弹出的窗口中，找到 JPK Maps 选项卡下的第一个“Set”按钮，选择包含力曲线分析结果的 tsv 文件。然后点击第二个“Set”按钮，找到与所选 tsv 文件对应的 QI 图谱文件。随后，点击“Submit”以加载图谱数据和力曲线分析结果。在顶部的“显示通道”下拉菜单中选择 EModul 选项，以将杨氏模量结果显示为映射图像。然后，在直方图下方的“数据通道”下拉菜单中选择 EModul 选项，以可视化 QI 图中加载的杨氏模量值的分布情况。接下来，单击用户界面中央的“操作流程”箭头按钮，确保其指向右侧。在直方图坐标轴上方的滤镜面板中，将图像滤镜切换按钮设为“开启”状态。从滤镜几何形状的下拉菜单中选择“手绘”选项，然后点击“添加”按钮。在顶部通道图像上，按住鼠标左键围绕基底膜绘制滤镜蒙版。完成后释放鼠标按钮，然后双击掩膜以将其应用到图上。要保存包含掩膜后杨氏模量值的新 tsv 结果文件，请点击顶部菜单栏中的“保存”、“保存直方图”和“保存数据”。在弹出的窗口中，点击“全选”以选择要写入 tsv 文件的结果。然后单击“确定”按钮以确认选择。在“保存”对话框中为 tsv 文件输入名称，选择所需的保存位置，然后单击“确定”以保存筛选后的结果。肺基底膜的杨氏模量值呈对数正态分布，峰值为 9.31，标准差为 0.18，得到代表性的杨氏模量为 11.05 千帕。这些结果进一步通过分位数-分位数图得到验证。

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