从原子力显微镜力图中提取天然小鼠肺基底膜的杨氏模量

在我们的研究中，我们探讨细胞外基质的力学特性对细胞行为和组织完整性的影响力。我们希望理解细胞与其微环境之间的相互作用如何影响转移形成等病理过程。通过对肺基底膜力学特性的数据挖掘，我们发现较软的基底膜对癌细胞侵袭具有更强的抵抗力。

本方案中介绍的方法能够实现对未固定的生物样本进行冷冻切片和力学性能检测，从而保持其机械特性。此外，该方法还展示了如何通过原子力显微镜测量以及本方案中描述的滤波处理程序，单独测定肺泡壁内基底膜的杨氏模量。下一步是进一步了解基底膜刚度的动态变化及其在发育和病理过程中的作用，以期改善诊断方法并指导治疗策略。

首先，从零下80摄氏度冰箱中取出含有冷冻最佳切割温度（OCT）包埋剂的小鼠肺组织模具。将双面胶带贴在磨砂边缘载玻片的中央位置。用一个15毫升离心管在胶带上滚动，以确保胶带牢固粘附且无气泡。

确保胶带的长度与含有样本的OCT包埋块的宽度一致。用铅笔在载玻片上标记样本信息和切片编号。将准备好的显微镜载玻片插入载玻片盒中。

将载玻片盒放入冷冻切片机腔室内，使载玻片冷却。接着，用OCT包埋剂填充样品夹的内侧两圈。将样品置于样品夹中的OCT包埋剂内。

将样本架放入冷冻切片机腔室中约10分钟，直至OCT包埋剂完全凝固，样本被牢固固定。然后，将样本架安装到冷冻切片机的切削台上。用冷却的拇指用力按压，将一片单面粘性胶带贴附在样本上。

使用冷冻切片机制备15微米厚的组织切片。在切割过程中，使用刷子引导切片，并防止双面胶带脱落。采用带有双面胶带的预冷载玻片，将其牢固地压在切片上以拾取组织。

将载有切片的载玻片放回载玻片盒中。使用热噪声法校准悬臂时，将一块显微镜载玻片放置在原子力显微镜（AFM）的样品台上，并将AFM探头放置在样品台上。

然后使用步进电机降低原子力显微镜（AFM）探头，直到悬臂架与显微镜载玻片之间的间隙约为一到两毫米。使用带长针头的1毫升注射器将磷酸盐缓冲液（PBS）加到悬臂架的一侧，使其流下并在间隙中形成液体弯月面。在AFM控制软件中进行基于接触的校准，请进入“采集数据”页面并选择“高级视图”选项。

单击右上角的菜单按钮进入校准管理器。然后在方法中选择基于接触的方式，并从名称下拉菜单中选择 MLCT-F 悬臂梁作为悬臂梁名称。在设定点字段中输入 1 伏，在扫描次数字段中输入 10。

在“采集数据”页面左侧控制面板中，为自动逼近程序输入一个 1 伏的设定点。单击界面左上角蓝色向下的箭头按钮，以启动自动逼近。当逼近完成且悬臂与显微镜载玻片接触后，单击校准管理器窗口中的“校准”按钮以开始校准。

校准完成后，关闭校准管理器窗口，并确保在预选目录中生成包含已确定校准结果的校准文件。首先，从冷冻箱中取出含有切片小鼠肺组织的标本玻片。将显微镜玻片放置在原子力显微镜（AFM）的样品台上。

单击用户界面右上角带有扳手图标的按钮，进入设置管理器。在“接近设置”部分，将目标高度设为四微米。然后在“高级反馈设置”下的“电流模式设置”部分，将乘数设为1。

在当前模式设置的力设置子部分中，从“结束时的模式”下拉菜单中选择“收回压电陶瓷”。在左侧控制面板中设置力压痕曲线的参数。对于NanoWizard 4 XP和MLCT悬臂梁，将设定点力（Setpoint）设为5纳牛，Z长度（Z Length）设为8微米，Z速度（Z Velocity）设为每秒300微米。

接下来，定义初始概览力图的位置和大小，使其涵盖整个肺泡壁，从一侧气道延伸至另一侧。将像素数量设置为 50 × 50。记录概览图后，在基底膜上采集更聚焦的力图，尺寸为 3 × 3 微米或 4 × 4 微米，像素数量保持为 50 × 50 曲线。

为分析力-压痕曲线，请在 MATLAB 中启动 CANTER 处理工具箱并打开力曲线分析应用程序。然后，为加载肺组织切片的高分辨率力图，单击“选择文件”，导航至保存位置，双击文件，然后选择“加载数据”。当弹出窗口提示输入悬臂梁的校准值时，在相应的编辑字段中输入校准值。

点击提交按钮以继续。当第二个弹出窗口出现时，通过点击提交按钮继续定量成像（QI）图的加载过程。加载过程完成后，力图的初始力曲线将显示在屏幕上。

在相应的编辑框中将拟合深度设置为 1.5 微米，并为接触点检测算法选择赫兹（Hertz）拟合方式。要将修正后的赫兹模型拟合应用于 QI 图谱的所有力-压痕曲线，请点击“保持并应用于全部”按钮。完成最后一条力曲线分析后，将弹出窗口提示保存文件。

单击“是”，然后为结果文件输入名称。在 CANTER 处理工具箱的应用选择窗口中，对 QI 图进行空间滤波时，选择“结果滤波工具”，然后单击“启动应用程序”按钮。要加载拟合结果，请在“结果滤波工具”用户界面顶部菜单栏中单击“打开”。

在随后弹出的窗口中，找到 JPK Maps 选项卡下的第一个“Set”按钮，选择包含力曲线分析结果的 tsv 文件。然后点击第二个“Set”按钮，找到与所选 tsv 文件对应的 QI 图谱文件。随后，点击“Submit”以加载图谱数据和力曲线分析结果。

在顶部的“显示通道”下拉菜单中选择 EModul 选项，以将杨氏模量结果显示为映射图像。然后，在直方图下方的“数据通道”下拉菜单中选择 EModul 选项，以可视化 QI 图中加载的杨氏模量值的分布情况。接下来，单击用户界面中央的“操作流程”箭头按钮，确保其指向右侧。

在直方图坐标轴上方的滤镜面板中，将图像滤镜切换按钮设为“开启”状态。从滤镜几何形状的下拉菜单中选择“手绘”选项，然后点击“添加”按钮。在顶部通道图像上，按住鼠标左键围绕基底膜绘制滤镜蒙版。

完成后释放鼠标按钮，然后双击掩膜以将其应用到图上。要保存包含掩膜后杨氏模量值的新 tsv 结果文件，请点击顶部菜单栏中的“保存”、“保存直方图”和“保存数据”。在弹出的窗口中，点击“全选”以选择要写入 tsv 文件的结果。

然后单击“确定”按钮以确认选择。在“保存”对话框中为 tsv 文件输入名称，选择所需的保存位置，然后单击“确定”以保存筛选后的结果。肺基底膜的杨氏模量值呈对数正态分布，峰值为 9.31，标准差为 0.18，得到代表性的杨氏模量为 11.05 千帕。

这些结果进一步通过分位数-分位数图得到验证。