Name: 新型透明质酸水凝胶在三维卵泡培养中的应用及小鼠卵巢卵泡冷冻保存方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-09T13:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: 学习使用酪胺交联透明质酸水凝胶进行小鼠卵巢卵泡的三维培养与玻璃化冷冻保存技术。该方法有助于在体外培养过程中保持卵泡的天然三维结构，促进卵母细胞成熟，为生殖生物学和生育力保存研究提供新途径。

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我们希望感谢克利夫兰诊所的整个胚胎学团队提供的帮助，以及生殖内分泌与不孕症科（REI）的支持，特别感谢Falcone博士。本项目由克利夫兰诊所的研究基金资助。

所有动物实验均在克利夫兰诊所的机构动物使用与护理方案下进行，并遵循美国国立卫生研究院关于实验动物护理与使用的指南和规定。
1. 培养基制备
注意：以下所述培养基将用于本实验流程的各个步骤：卵巢组织（OT）处理、OT 胶原酶消化、卵泡培养（FCM）和玻璃化冷冻。所有培养基均须在组织培养超净台中采用无菌技术配制。
<ol>
	<li>卵巢组织处理培养基
	<ol>
		<li>在50 mL组织培养瓶（T-50）中，向20 mL Leibovitz培养基（L-15）中添加0.1%胎牛血清（FBS）。</li>
		<li>盖紧瓶盖，置于培养箱中过夜，使其温度升至37 °C后使用。该培养基用于在培养箱外操作卵巢组织和卵泡，无需CO2即可维持pH值在7.2至7.4之间。 
		警告：切勿将培养皿暴露于CO2&#160;气体中，否则培养基将变为酸性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>胶原酶消化培养基
	<ol>
		<li>在卵泡收获当天早晨，将1 mg I型胶原酶（295 U/mg）加入含有2.2 mL预热的卵巢组织处理培养基的离心管中。胶原酶的最终浓度为134 U/mL，使用0.22 µm注射器滤器过滤除菌。盖紧管盖后置于加热块中保温。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>卵泡培养基与矿物油
	<ol>
		<li>在T-50培养瓶中配制30 mL α-最小必需培养基（Minimum Essential Medium alpha），添加5%胎牛血清，并补充100 mIU/mL促卵泡激素（FSH）、10 mIU/mL黄体生成素（LH）、10 µg/mL胰岛素、5 µg/mL转铁蛋白和5 ng/mL硒。</li>
		<li>使用前，将卵泡培养基（FCM）在培养箱中以37 °C、6% CO2及空气条件下预平衡过夜。</li>
		<li>将50 mL矿物油倒入培养瓶中，松盖后于培养箱中过夜平衡。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>卵泡及卵泡样细胞团（FL和FL-Clusters）玻璃化冷冻培养基
	<ol>
		<li>所有溶液的基础培养基为含20%合成蛋白替代物的Global-Hepes培养基。在基础培养基中配制20 mL VS1溶液，含7.5%乙二醇（EG）和7.5%二甲基亚砜（DMSO）。</li>
		<li>在基础培养基中配制20 mL VS2溶液，含15%乙二醇（EG）、15%二甲基亚砜（DMSO）和0.5 M蔗糖。所有溶液均使用0.22 µm注射器滤器除菌，并于4 °C保存至使用。溶液可在4周内使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>玻璃化冷冻后卵泡及卵泡样细胞团（FL和FL-Clusters）的复温培养基
	<ol>
		<li>所有溶液的基础培养基为含20%合成蛋白替代物的Global-Hepes培养基。在基础培养基中配制20 mL含0.25 M蔗糖的溶液，标记为WS1。</li>
		<li>在基础培养基中配制20 mL含0.125 M蔗糖的溶液，标记为WS2。使用0.22 µm注射器滤器过滤除菌。溶液于4 °C保存，可使用长达4周。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 卵巢采集
<ol>
	<li>通过颈椎脱位法处死10至14日龄的B6D2F1仔鼠（无需麻醉）。使用3至4只仔鼠以获取250至300个完整的前窦状卵泡用于实验。</li>
	<li>将动物仰卧放置，用70%异丙醇擦拭腹部。使用洁净的剪刀在腹中线处做一小的横向切口。用精细镊子夹住切口上下方的皮肤，向头侧和尾侧两个方向拉开，以暴露腹腔。</li>
	<li>使用另一套洁净的剪刀和精细镊子剪开腹壁。将肠管移开。找到子宫角、输卵管和卵巢。切除卵巢并置于中心凹培养皿中，内含1 mL已预热至37 °C的OT操作液。</li>
	<li>在解剖显微镜下，剔除所有脂肪组织和输卵管组织。将卵巢沿中线切为两半。</li>
</ol>
3. 卵泡和滤泡样细胞簇（FL-C）的分离
<ol>
	<li>使用带有37 °C加热表面的层流净化台进行卵泡的分离和操作。在净化台内无菌操作。操作FCM培养皿时需小心。使用气泡发生器使培养皿持续通入5% CO2 在超净工作台内操作时。 
	注意：所有溶液必须预热至 37 °C。FCM 培养基以及矿物油必须在含 6% CO₂ 的培养箱中于 37 °C 预平衡过夜。2 使用前需注意，培养基在孵育箱外放置超过10分钟时，其pH值会发生变化。</li>
	<li>将6 mL预平衡的FCM移液至两个60 mm培养皿中，加入矿物油覆盖，放回培养箱中。</li>
	<li>将1 mL胶原酶加入中心孔培养皿中，将3 mL OT培养基加入外周孔中。使用玻璃微量移液管（1000 µm）将卵巢转移至胶原酶溶液中。将培养皿孵育30–40分钟。&#160;在层流罩加热表面上静置最少时间。</li>
	<li>胶原酶孵育结束时，将6 mL OT培养基移液至两个分别标记为1和2的60 mm组织培养皿中，置于生物安全柜的预热表面上。</li>
	<li>使用微量移液器将经胶原酶处理的卵巢转移至外层孔中，以洗去胶原酶。更换微量移液器后，将卵巢转移至OT培养皿1中。</li>
	<li>使用P200移液器从每侧卵巢中收集卵泡。通过将经酶处理的卵巢反复吸入和推出至不同尺寸剪切的移液枪头，释放卵泡。在移液前，使用两根27G针头机械分离组织成碎片，也有助于释放单个卵泡。每只新生小鼠应可获得60–75个形态完整的所需大小的卵泡。</li>
	<li>如有必要，将未完全解离的卵巢组织重新放入胶原酶中消化5-10分钟，冲洗并重复吹打以释放更多卵泡。 
	注意：胶原酶过度暴露会导致卵母细胞周围颗粒细胞层的破坏。不要试图完全分散整个卵巢。一旦收集到250–300个卵泡，即停止操作。</li>
	<li>在体视显微镜下以40倍放大倍数观察释放的卵泡。辨认次级前腔卵泡（直径约120–140 µm），其特征为卵母细胞位于中央，且被完整的基底膜（基膜）包绕。此类大小的卵泡通常在卵子周围含有2–4层颗粒细胞（参见 图1). 
	注意：将卵泡与175 µm 微量移液器吸头开口进行比较，以估算卵泡大小。卵泡直径应约为移液器开口直径的3/4。这是筛选所需大小卵泡的最快方法。</li>
	<li>使用175 µm的微量移液器将选定的卵泡转移至OT2培养皿中。收集完成后，用FCM1培养皿中的溶液冲洗所有卵泡，以去除OT培养基的残留痕迹，随后转移至FCM2培养皿中。</li>
	<li>将培养皿放入培养箱中孵育60分钟，然后再开始包埋过程。</li>
	<li>用于卵泡簇的分离，执行步骤 3.1 至 3.5。使用两支结核菌素注射器（27 G）将卵巢撕解成碎片，再进一步分离为含 6–10 个卵泡的小簇。 
	注意：卵泡簇（FL-C）培养是个体卵泡培养的一种替代方法。该方法可保留卵泡的天然结构以及间质成分。FL-C中的卵泡大小不均一。卵泡保持其原有的 体内 存在原始卵泡、初级卵泡和次级卵泡的结构。</li>
	<li>用200 µm 微量移液器将这些卵泡簇（FL-C）收集至OT2培养皿中。收集完成后，冲洗所有FL-C，并转移至FCM2中，等待包埋。</li>
</ol>
4. 卵泡及卵泡簇的包埋
<ol>
	<li>制备10 mg/mL的活化酪胺交联透明质酸水凝胶（HA）储备液。用25 mL含辣根过氧化物酶（HRP；10 IU/mL）的磷酸盐缓冲液溶解250 mg酪胺修饰的透明质酸钠粉末。完全溶解后，将该活化的HA储备液分装为每份500 µL，于-4 °C保存，用于后续实验。</li>
	<li>进行卵泡实验时，将HA储备液解冻，并用预热至37 °C的全培养基稀释至3 mg/mL。所有包埋操作均需在37 °C加热台面上的超净工作台内进行。使用直径60 mm、含有八个100 µL孔的培养皿进行包埋及后续卵泡培养。</li>
	<li>将待包埋的卵泡或FL-簇从FCM培养皿转移至一滴HA凝胶中，以洗去残留的培养基。追踪培养基会干扰凝胶形成。将FCM培养皿放回气泡发生装置下进行气体平衡。 
	注意：可根据实验设计单独或成组包埋分离的卵泡。我们通常倾向于每颗凝胶珠中接种2–4个卵泡。</li>
	<li>在培养皿中加入1 µL 0.03%的过氧化氢（H2O2）。再加入25 µL 3 mg/mL的HA凝胶至过氧化氢液滴中，通过移液混匀以启动交联反应（见图2）。</li>
	<li>使用P20移液器吸取HA-H2O2混合液，将一滴（约8–10 µL）分别加入8孔培养皿中的两个独立孔中。避免产生气泡。</li>
	<li>使用200 µm微移液管迅速将卵泡或一个FL-C转移至每滴混合液的中央（图3）。操作需迅速，因为HA一旦接触催化剂（过氧化氢）将在1–2分钟内开始凝胶化。接种过程中注意避免引入气泡。 
	注意：如需追踪单个卵泡的生长情况，应使各卵泡之间保持一定距离。不要将卵泡放置过近于凝胶底部，否则在体外培养过程中可能下沉并附着。</li>
	<li>静置约3分钟完成凝胶过程，然后向每个孔中加入100 µL预平衡的FCM培养基。重复此步骤，将卵泡接种至全部八个孔中。加入温热的预平衡矿物油覆盖，并将培养皿放入培养箱中。</li>
</ol>
5. 卵泡和FL细胞簇的玻璃化冷冻
注意：玻璃化冷冻可使用开放式载体（Cryoloop；CL），使样本直接接触液氮，或使用封闭式载体（Rapid I；RI），其中样本被密封于外层麦管内，因此不会与液氮接触。图4展示了两种玻璃化冷冻系统的装置及其差异。研究表明，这两种装置均可有效用于胚胎冷冻保存35。
<ol>
	<li>封闭式载体RI玻璃化冷冻
	<ol>
		<li>将2 mL的VS溶液分装至离心管中，并在加热金属块中预热至37 °C。所有玻璃化冷冻操作均需在超净工作台的加热表面上进行，并使用解剖显微镜观察卵泡和载体。</li>
		<li>将绝缘冷冻盒中装满液氮（LN2）。将装置的外层 straw 置于盒内的固定槽中，使其部分浸入液氮中。将带有微小孔洞的内层塑料棒横放在培养皿盖上，以备加载使用。</li>
		<li>在培养皿顶部附近并列放置两滴VS1溶液。使用200 µm的移液器将两个卵泡放入第一滴中，冲洗后迅速转移至第二滴VS1中，孵育5分钟。若进行FL细胞簇的玻璃化冷冻，每次仅处理一个细胞簇。</li>
		<li>当第一次孵育即将结束时，在同一培养皿上并列放置三滴VS2溶液。随后在60秒内迅速将卵泡依次通过三个VS2液滴，并立即加载到载体上。操作时应尽量减少携带液体量，避免将前一液滴的溶液带入下一液滴中。</li>
		<li>加载载体时，用移液器取两个卵泡，并以最少的液体量将其置入塑料棒的微孔中。最终孔内液体体积极小&#60; 0.5 µL。注意避免过度填充，否则会导致液体溢出微孔并流到塑料棒表面。</li>
		<li>将塑料棒投入已预冷的外层straw中。使用超声波封口机封闭并密封straw。将straw插入连接于冷冻杆上的冻存杯中。每个冻存杯最多可放置4根straw。</li>
		<li>用塑料保护套覆盖冷冻杆，然后将整根冷冻杆迅速浸入液氮储存罐（LN2）中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>开放式载体CL玻璃化冷冻
	<ol>
		<li>将VS溶液预热至37 °C。所有玻璃化冷冻步骤均在超净工作台的加热表面上进行。提前准备好所需数量的CL开放式载体。将金属CL杆插入磁性冻存管盖中，确保其牢固固定（必要时可使用少量粘合剂）。</li>
		<li>在绝缘冷冻盒中装满液氮（LN2），并将支架放入盒内，用于固定冻存管，使液氮液面低于冻存管顶部。</li>
		<li>将特制的带磁性且带通气孔的冻存管装满液氮，放置于支架上。按照步骤6.1.3至6.1.5所述进行玻璃化冷冻操作。唯一区别是通常每次处理五个卵泡。同样需注意尽量减少液滴之间的溶液交叉污染。</li>
		<li>加载卵泡时，使用金属棒夹住CL开放式载体的磁性帽，将其浸入单独的一滴VS2溶液中，形成一层冷冻保护剂薄膜。</li>
		<li>使用移液器吸取所有卵泡或FL细胞簇，并以最少的液体量将其放置在该薄膜上。操作需迅速，因为必须在薄膜开始干燥前完成加载。</li>
		<li>立即将CL载体浸入装满液氮的冻存管中，以实现样本的玻璃化冷冻。盖上管盖并将&#160;冻存管置于冷冻杆上，套上塑料保护套，随后将整根冷冻杆浸入液氮储存罐中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 玻璃化卵泡和FL-簇的复温
<ol>
	<li>RI封闭式载体复温
	<ol>
		<li>准备一个中心小室培养皿，在外周小室中加入3 mL预平衡的FCM，中心小室中加入1 mL FCM。表面覆盖油并放入培养箱中。</li>
		<li>将0.5 mL预温的WS1和WS2分别加入两个已标记的中心小室培养皿中。将装有样品的提杆从储存罐中取出，转移到装有液氮（LN2）的冻存盒中。</li>
		<li>取下塑料提杆盖。从杯状物中取出麦管，保持其浸没状态，并将其滑入冻存盒的固定槽中。</li>
		<li>使用精细剪刀，在黑色标记点上方剪断外层麦管，该黑点指示内层含卵泡的RI载体顶端位置。</li>
		<li>使用精细镊子将内层塑料棒稍许从外层麦管中提起。抓住装置后迅速将塑料棒浸入WS1中，轻轻旋转以释放卵泡。操作速度至关重要，必须在10秒内将卵泡完全释放至WS1中。</li>
		<li>使用解剖显微镜观察卵泡，确认所有卵泡均已从载体上释放。在WS1中放置2分钟后，使用微量移液器将所有卵泡（或FL-簇）转移至WS2中，注意避免带入前一步的培养基。</li>
		<li>3分钟后，将卵泡在FCM培养皿的外周小室中清洗，然后转移至中心小室。放入培养箱中孵育1–2小时，之后进行包埋。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>CL开放式载体复温
	<ol>
		<li>按上述方法准备FCM和WS培养皿。将装有卵泡的提杆从储存罐中取出，转移至装有液氮（LN2）的冻存盒中。取下塑料提杆盖。</li>
		<li>使用磁力棒将冻存管盖提起，直至CL的金属杆部分可见。</li>
		<li>使用镊子夹住金属杆，将CL从冻存管中取出，并迅速浸入WS1中，轻轻旋转以释放卵泡。必须在10秒内完成向WS1的释放。使用解剖显微镜确认所有卵泡均已释放。</li>
		<li>后续所有复温步骤均与RI封闭式载体复温步骤中第7.1.6步起的操作相同。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 卵泡和FL细胞簇成像及培养基更换
<ol>
	<li>在10-12天的培养期间，使用配备高分辨率相机并带有霍夫曼对比调制光学系统的倒置显微镜，监测各孔中的卵泡和FL-簇（FL-clusters）。根据卵泡大小，使用成像软件在40倍和100倍或200倍总放大倍数下采集图像。</li>
	<li>卵泡的成像与评估
	<ol>
		<li>在培养第1天包埋后，使用倒置显微镜以40倍和200倍放大倍数对所有培养孔进行成像，以建立形态学和大小的基线数据。随后将培养皿放回培养箱中。</li>
		<li>查看图像，并记录每个凝胶微珠中完全包埋的卵泡数量。对于FL-C，在培养开始时估算卵泡数量。</li>
		<li>使用成像软件，从基底膜边缘开始，沿垂直和水平方向测量卵泡直径；同样从透明带外缘测量卵母细胞大小。记录平均值。对簇状结构的直径也进行垂直和水平方向的测量。</li>
		<li>每隔2-3天继续对培养物进行成像。仅测量彼此无接触的卵泡直径。对于FL-C，在体外培养过程中簇会聚集成球状，因此可对整个簇在垂直和水平方向上进行测量。 
		注意：对于紧密聚集的卵泡，自培养第4天起可能无法分辨单个卵泡边界，因此不再进行测量。</li>
		<li>将出现变暗或凋亡的卵泡，以及卵母细胞不再被颗粒细胞包围或已被挤出的卵泡归类为非存活卵泡。记录任何附着于培养皿表面的卵泡或FL-C（见图5）。</li>
		<li>自第8天起，仔细观察卵泡是否形成腔隙（antrum）。具有腔隙的卵泡在内部会呈现清晰或较亮的区域（图6）。</li>
		<li>每2天进行一次半量换液。使用P200移液器，设定体积为50 µL。将吸头插入油层下的孔中，远离凝胶微珠。缓慢吸取50 µL培养基。随后缓慢加入50 µL新鲜FCM培养基至油层下，避免产生气泡。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. 包封卵泡中卵母细胞的成熟
注意：通常当接种的（且具有活力的）卵泡中卵泡腔形成比例超过40%时，启动最终成熟步骤。然而，如果卵泡腔形成率较低或不可见，建议在培养第12天时启动成熟。我们观察到继续延长培养时间并无益处。对于FL-C培养，通常在40%的孔中观察到卵泡腔时即启动成熟，最晚不超过培养第12天。
<ol>
	<li>准备 体外 成熟培养基（IVM）通过在FCM中添加1.5 IU/mL人绒毛膜促性腺激素（hCG）和5 ng/mL表皮生长因子（EGF）配制而成。</li>
	<li>通过在约下午5点用100 µL IVM培养基替换每孔中的FCM来诱导成熟。在诱导后过夜培养（诱导后16–18 h），使用解剖显微镜在40倍放大下检查每个培养孔，观察是否有卵丘-卵母细胞复合体（COCs）从HA凝胶微珠中排出。COCs通常位于凝胶微珠正上方或附近区域。</li>
	<li>将排出的卵母细胞复合体收集到中心小室培养皿中，培养皿内含1 mL预先平衡的FCM，并覆盖石蜡油，然后将培养皿放回培养箱。</li>
	<li>使用P200移液器轻轻吹打仍嵌在卵泡中的透明质酸微珠（HA-bead），释放未排卵的卵丘-卵母细胞复合体（COCs），并将其收集至另一培养皿中的FCM培养基中。</li>
	<li>在中心小室培养皿的外圈加入1 mL透明质酸酶（10 IU/mL）和3 mL FCM培养基。</li>
	<li>将排出的卵母细胞- cumulus 复合体（COCs）转移至透明质酸酶溶液中，短暂暴露于酶液（30–45 秒），以去除卵母细胞周围的颗粒细胞，便于观察卵母细胞的核相状态。在置于油下含新鲜培养基的 5 µL 液滴中进行详细评估前，用培养基充分清洗卵母细胞以去除残留酶液。将培养皿放入培养箱中。对未排出的 COCs 重复上述操作。</li>
	<li>记录回收的排卵和未排卵卵母细胞的总数。对每个回收的卵母细胞进行拍照，并评估其核相状态（GV期、中期I或中期II），测量并记录卵母细胞直径。</li>
	<li>根据存活卵泡总数（即达到hCG触发日的卵泡）和回收的总卵子数计算IVC存活率。计算排卵后COC中处于中期II（MII）的卵母细胞所占百分比。对从未排卵COC中回收的卵母细胞同样进行上述百分比计算。</li>
	<li>以相同方法测定FL-C的成熟至减数第二次分裂中期的速率。</li>
</ol>

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</ol>

无利益冲突或披露事项。

调控酪胺交联透明质酸（HA）水凝胶的机械性能和生物降解性的能力，为组织工程应用提供了诸多优势。本实验室是首个将这种特定HA凝胶用于卵巢卵泡生长的研究团队。这种已获专利的酪胺取代的透明质酸钠凝胶（TS-NAHY）是由克利夫兰医学中心开发的一种新型基于透明质酸的水凝胶系统。凝胶的交联过程由凝胶混合物中过氧化物酶在氧化剂作用下的活化所驱动，该过程既可在体外也可在体内完成。形成的TS-NAHY水凝胶表现出广泛的性能，从弱凝胶、膏状物到脆性固体不等，具体形态取决于凝胶的浓度40。
卵巢卵泡培养进展不理想，凸显出设计新型培养模型的必要性。完全基于天然细胞外基质成分构建培养体系可能是更有优势的策略。文中所述透明质酸（HA）培养模型使用简便，生理相容性良好，无需额外添加其他细胞外基质成分。该凝胶具有透明特性，便于对卵泡进行细致观察。HA凝胶的黏弹性特性有利于调节硬度并具备良好的可塑性，从而提升了该生物基质的多功能性。生物基质的硬度可影响颗粒细胞增殖及卵泡腔的形成30,41,42已有报道称，在支持卵泡腔形成的培养环境中衍生的卵泡，其基因表达谱与非支持性培养系统中的卵泡存在差异。43灵长类卵泡似乎需要更 rigid 的基质44. 针对不同动物物种（包括人类）的需求定制生物基质，可能对成功至关重要 体外 成熟
对于小鼠前腔卵泡的生长，我们测试了2-5 mg/mL范围内的凝胶浓度36。卵母细胞成熟率在44%至58%之间。较高的透明质酸（HA）凝胶浓度可提供更好的可塑性和三维结构保持能力，但会影响卵泡的扩张。较低的HA浓度允许卵泡更显著地径向扩张，但增加了卵泡在体外培养（IVC）结束前自发挤出的风险。3-3.5 mg/mL的HA浓度对小鼠前腔卵泡最为适宜。保持凝胶液滴较小对于形成具有足够深度的HA凝胶微珠至关重要，以确保在整个体外培养过程中维持卵泡的三维构型。较大的液滴会变扁平，导致卵泡穿过凝胶下沉并附着于培养板表面。该生物材料用于包埋的一个局限性在于其极快的凝胶化时间，这使得同时接种两个以上的HA凝胶微珠变得困难。提高卵泡在HA凝胶中的接种效率是当前我们正努力改进的方向之一。
利用透明质酸在三维环境中培养卵泡簇具有巨大潜力。该方法可保持正常的卵巢结构，使不同大小的卵泡相互接触，并与支持性间质组织相连。黄体生成素（LH）可能通过诱导早期分化中的膜细胞发生改变，促进FL-C中较小的前腔隙卵泡生长，因此被添加至FCM培养基中45继续培养FL-C超过12天，以观察在hCG触发后仍嵌留在组织中的较小卵泡是否能够启动新一轮生长，这需要进一步研究。进一步优化培养微环境可能是实现组织碎片中不同大小卵泡培养的先决条件。该基于FL-C的三维透明质酸（HA）培养模型的一个优势在于，其能够高度模拟 体内 卵泡的排列方式及相互作用。另一个重要特性是，与海藻酸钙及其他聚合物系统不同，无需将卵泡从组织或凝胶基质中物理移除，即可诱导排卵和成熟。
所需时间 体外 卵泡培养并获取成熟卵母细胞以进行冷冻保存的过程较长，尤其是在大型哺乳动物中。将采集的卵泡或卵泡簇进行冷冻保存，可使该步骤延迟至将来更适宜的时机再进行。若未来该技术可用于人类卵巢采集过程中的卵泡保存，则可能具有重要价值。目前，整块卵巢冷冻保存是生育力保存的唯一选择，但其是否为最佳方法仍有待确定。本文介绍一种用于前窦卵泡冷冻保存的玻璃化冷冻方法，在三维培养后可获得良好的复温后存活率和成熟率。

关键词：卵泡培养，成熟卵母细胞，冷冻保存，卵泡冷冻，卵巢冷冻保存，生育力保存，前窦卵泡，玻璃化冷冻，三维培养
综上所述，我们描述了一种使用透明质酸（hyaluronan，天然细胞外基质的组分）构建的新型三维培养模型。HA包封技术可使营养因子保留在发育中卵泡的邻近区域。该生物基质中的包封方法操作简便，既可适用于分离的卵泡，也可用于卵泡簇。后者可能为研究开辟新途径，并有助于深入理解卵泡发生及其调控的基本生物学机制。来自HA包封卵泡的卵母细胞已被证实具有功能活性37。这些卵母细胞可被受精，在体外形成囊胚，并在移植至假孕小鼠后成功着床。这些数据验证了酪胺交联透明质酸作为三维卵泡培养及体外卵母细胞成熟生物基质的可行性。该方案有望应用于包括人类在内的其他动物模型的卵巢卵泡培养。这种三维HA凝胶系统的其他潜在应用还包括类胚体和类器官的培养。

人类 体外 卵泡发生仍然是一个挑战，即使在首例通过该技术出生的婴儿诞生四十年后 体外 受精。迄今为止，尚缺乏能够支持人类卵巢卵泡培养并产生可存活胚胎、最终诞下健康婴儿的技术方法。1. 人类所需的最适物理特性 体外 卵泡生长的调控机制仍有待阐明。完整的卵巢中含有数千个处于不同发育阶段的卵泡，其生长调控是一个复杂的过程。图1)2来自人类原始卵泡的生发泡期（GV期）卵母细胞在体外培养中需要长达30天才能完成减数分裂成熟，达到第二次减数分裂中期（MII期）3卵母细胞与其周围的颗粒细胞之间通过间隙连接进行的双向通讯，对细胞质和细胞核的成熟至关重要4,5,6.
传统的二维（2-D）培养系统并不适合卵泡培养，尤其是在需要较长体外培养时间的大型哺乳动物模型中。卵泡会贴附于培养皿表面，随着颗粒细胞向外迁移，颗粒细胞与卵母细胞之间的连接变得愈发脆弱。因此，三维（3-D）卵泡培养系统应运而生，旨在更真实地模拟体内微环境 体内 生理学7,8.
将卵泡包封于基质中以促进其三维生长，是保存卵泡结构的一种方法 体外 体外培养（IVC）。已测试的生物材料基质包括天然聚合物（如胶原蛋白、琼脂糖、纤维蛋白、海藻酸盐和透明质酸），以及合成聚合物（如聚乙二醇、聚乙烯醇和聚乙醇酸）7,9,10,11,12,13生物基质的力学特性已被证明会影响营养物质扩散、膜细胞分化、卵泡腔形成以及激素分泌。14胶原蛋白作为细胞天然细胞外基质（ECM）的组成部分，是最早被测试的基质之一，初期应用前景良好15,16,17然而，胶原蛋白制备的标准化流程存在物流困难，且其机械性能较差、稳定性不足，这些因素限制了其应用18琼脂糖已在从窦状卵泡和原始卵泡中释放的卵丘-卵母细胞复合体（COCs）上进行了测试19,20最近，一种打印的三维琼脂糖模具在无支架卵泡培养中显示出良好的应用前景21海藻酸钙包封技术自2003年首次报道以来，迄今为止仍是体外培养（IVC）领域研究最为广泛的体系22已在小鼠、牛和猴中进行过测试&#160;以及人类卵泡23,24,25,26,27使用海藻酸钙时，将卵泡单个加载到聚合物的微滴中，并暴露于氯化钙以形成凝胶微珠。从微珠中提取卵泡需要使用螯合剂处理。然而，这种基质存在一些缺点。海藻酸盐是一种从藻类中分离的多糖，尽管其能提供支撑作用，但它并非卵泡天然细胞外基质的组成部分。已有数据显示，在海藻酸盐中进行体外培养（IVC）后，纺锤体异常的发生率较高28后续通过将海藻酸盐与纤维蛋白或其他细胞外基质成分（ECM）结合对系统进行改进，有助于提高海藻酸钙系统的有效性29,30.
越来越多的证据表明，细胞外基质是细胞生长的关键调节因子10,31,32。它不仅提供结构支持，还在细胞黏附、功能、生长和通讯中发挥关键作用。细胞外基质的主要成分之一是透明质酸，一种天然存在的糖胺聚糖。在卵巢卵泡中，透明质酸由颗粒细胞产生，有助于维持发育中卵泡的结构完整性和功能33,34。因此，将透明质酸整合到卵泡培养模型中，可能有助于构建更接近生理状态的环境，并提高功能成熟卵母细胞的产量。
本研究描述了一种新型的酪胺交联透明质酸作为生物基质，用于新鲜及冷冻卵巢卵泡培养的应用。 体外 卵母细胞成熟（IVM）。我们还详细介绍了使用两种不同装置进行卵泡玻璃化冷冻保存的技术。一种方法是直接将装置浸入液氮中，另一种方法是在将卵泡装入麦管后进行液氮浸入。主要目的是表明，尽管存在差异，但两种方法和装置均可可靠地用于卵泡冷冻保存。

<table><tbody><tr><td>抗α-微管蛋白-FITC标记</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2168</td><td></td></tr><tr><td>抗β-微管蛋白-FITC标记</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2043</td><td></td></tr><tr><td>BZ-X700</td><td>Keyence</td><td></td><td></td></tr><tr><td>中心孔培养皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-12</td><td></td></tr><tr><td>I型胶原酶</td><td>沃辛顿生化公司</td><td>LS004196</td><td></td></tr><tr><td>带通气孔的冷冻管</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-904</td><td></td></tr><tr><td>冷冻环</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-974</td><td></td></tr><tr><td>晶体帽</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-733</td><td></td></tr><tr><td>60 mm 培养皿</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>08-772B</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>表皮生长因子（EGF）</td><td>R &amp;amp;D Systems</td><td>236-EG</td><td></td></tr><tr><td>乙二醇（EG）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>293237</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清-热灭活</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>促卵泡激素（FSH）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4021</td><td></td></tr><tr><td>Global-Hepes&amp;nbsp; 培养基</td><td>库博医疗</td><td>LGGH-100</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>人绒毛膜促性腺激素（hCG）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CG10</td><td></td></tr><tr><td>人血清白蛋白</td><td>库博医疗</td><td>GHSA-125</td><td></td></tr><tr><td>透明质酸酶</td><td>库博医疗</td><td>ART-4007-A</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢</td><td>CVS 药房公司</td><td>372441</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>41400-045</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz培养基（L-15）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11415-064</td><td></td></tr><tr><td>黄体生成素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9773</td><td></td></tr><tr><td>磁力棒</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-729</td><td></td></tr><tr><td>微量移液器（1000 &amp;micro;m)</td><td>Minitube</td><td>19025/0050</td><td></td></tr><tr><td>微量移液器（175、200 和 275）&amp;micro;m)</td><td>库博 Surgical</td><td>MXL3-175, MXL3-200, MXL3-275</td><td></td></tr><tr><td>Millex GV 滤器 0.22 &amp;micro;m</td><td>Millipore</td><td>SLGU033RS</td><td></td></tr><tr><td>矿物油</td><td>库博医疗</td><td>LGOL-500</td><td></td></tr><tr><td>最小必需培养基α（MEM）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>32561-037</td><td></td></tr><tr><td>卵母细胞成像系统-Spindleview</td><td>Hamilton Thorne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>碘化丙啶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>快速 i</td><td>VitroLife</td><td>14406</td><td></td></tr><tr><td>SmartBox</td><td>VitroLife</td><td>14423</td><td></td></tr><tr><td>合成蛋白质替代物（SPS）</td><td>库博医疗</td><td>ART-3011</td><td></td></tr><tr><td>酪胺交联透明质酸生物水凝胶试剂盒&amp;nbsp;</td><td>LifeCore</td><td>ENG-00151</td><td></td></tr><tr><td>超声波密封器</td><td>VitroLife</td><td>14415</td><td></td></tr><tr><td>通用GPS培养皿 8x 100 &amp;micro;l 孔</td><td>库博医疗</td><td>UGPS-010</td><td></td></tr></tbody></table>

一种新型透明质酸水凝胶在卵泡三维培养中的应用及小鼠卵巢卵泡冷冻保存方法

Application of a Novel Hyaluronan Hydrogel for Three-Dimensional Follicle Culture and Methodology for Mouse Ovarian Follicle Cryopreservation

传统的二维（2-D）培养系统难以维持卵泡的三维结构以及体细胞成分与卵母细胞之间复杂的相互作用，而这些相互作用对于细胞质和细胞核的成熟至关重要。本文介绍了一种新型的三维培养模型，该模型采用酪胺交联的透明质酸水凝胶对小鼠卵巢卵泡进行包封和培养。透明质酸包封技术可支持卵泡的三维生长，并使营养因子保留在发育中的卵泡附近。该水凝胶具有高度可调性，既可用于分离的卵泡，也可用于卵巢组织碎片。透明质酸凝胶的黏弹性特性使其刚度和可塑性可根据凝胶浓度进行调节。在此培养模型中发育的原始卵泡可在培养10–12天内完成减数分裂成熟，并在hCG诱导下排出发育至第二次减数分裂中期（MII）的卵母细胞。本文还详细描述了两种通过玻璃化法进行卵巢卵泡冷冻保存的技术方法。

本文详细介绍了使用一种新型酪胺交联透明质酸凝胶的方法学 体外 小鼠前腔卵泡培养36,37. 图6 展示了卵泡在传统二维培养系统中与单个卵泡包埋于透明质酸（HA）凝胶进行三维培养时，窦前卵泡生长的差异。在为期12天的培养过程中，卵泡的天然结构得以维持，至培养末期可清晰观察到卵泡腔的形成。
HA 凝胶具有很高的通用性，既可支持卵泡单个或成组地独立生长，也可将卵巢组织机械性地破碎为小的卵泡簇。该凝胶透明，便于观察不同深度的卵泡。包埋的卵泡和卵泡样结构（FL-C）因颗粒细胞持续增殖而呈现径向扩张（图7）。初始卵泡直径平均为 139.8 ± 28 µm，生发泡期（GV）卵母细胞直径为 63.5 ± 4.6 µm。在单个培养的卵泡中，最终直径约为 385.6 ± 36.7 µm，体积增长约3倍。经hCG诱导排卵后获得的中期II（MII）卵母细胞直径约为 84.8 ± 3.8 µm。在培养的卵泡样簇（FL-簇）中，卵泡大小差异较大（图5、图7）。hCG诱导排卵后，排出的卵母细胞通常位于卵泡附近（图8）。大多数中期II卵母细胞可从排卵后的冠卵复合体（COCs）中回收。排卵诱导后仍包埋在凝胶中的卵泡通常含有生发泡期（GV）和中期I（MI）的卵母细胞。
表1比较了来自新鲜或冷冻卵巢的孤立卵泡与卵泡群（FL-簇）的成熟率。来自冷冻保存卵巢的FL-簇成熟率显著较低。显微观察显示，这些卵泡群常出现基底膜破裂，因而极易发生卵母细胞过早排出。卵泡群的脆弱性在一定程度上可通过包封加以缓解。冷冻卵巢未采用胶原酶处理，因其破坏性特别强，导致完整卵泡的存活率和收获率均较低。
分离卵泡的冷冻保存比整个卵巢保存更为有效。两种所考察的玻璃化冷冻方法均可实现较高的成熟率（表2）。尽管冷却速率存在显著差异，但体外培养后卵母细胞的成熟率并无差别。CL开放式载体可提高操作效率，因为单个CL开放式载体最多可装载十个卵泡，这也缩短了复苏多个冷冻保存卵泡所需的总时间。然而，对于人类卵泡玻璃化冷冻 eventual 临床应用而言，封闭式密封系统可能更为理想。
GV卵母细胞核仁周围的染色质排列方式可用于鉴定那些在排卵后最有可能受精并发育至囊胚阶段的卵母细胞38。图9展示了对卵母细胞进行活体染色以观察染色质分布模式的结果。
<img alt="卵泡发生阶段示意图；从初级到成熟卵泡，显微镜下的细胞结构细节。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67786/67786fig01.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图1"> 
图1：卵泡生长示意图。 本图展示了卵泡从初级卵泡发育至次级前窦卵泡阶段，最终形成可排卵的成熟三级卵泡的不同阶段。图中还显示了一个典型前窦卵泡的显微图像及其不同的形态学特征。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67786/67786fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="透明质酸水凝胶制备示意图；细胞包封的混合过程及实验装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67786/67786fig02.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图 2"> 
图 2：透明质酸（HA）包封方法示意图。 本图展示了透明质酸凝胶的结构以及卵泡包埋的不同步骤。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67786/67786fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="花粉粒大小的显微图像；图A-E显示了测量结果和细胞结构。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67786/67786fig03.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图3"> 
图3：卵泡分离与包封。（A, B）用于包埋的原始卵泡，放大倍数分别为40倍和200倍。（C）显示凋亡卵泡与健康原始卵泡，其中卵母细胞位置略偏离中央。（D）含有卵泡的透明质酸（HA）凝胶微球图像，以及（E）含有两个FL-C的凝胶微球图像。图像使用体视显微镜拍摄，以展示完整的凝胶微球。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67786/67786fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="冷冻保存系统：开放式液氮装置、封闭式塑料细管组件；所示为操作设备。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67786/67786fig04.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图4"> 
图4：用于分离卵泡冷冻保存的玻璃化冷冻装置。 使用CL开放式载体装置时，卵泡通过直接浸入液氮中进行玻璃化冷冻，因此冷却速率极高，超过-20,000 °C/min。相比之下，使用RI封闭式载体时，卵泡被装载在内部塑料棒上，然后置入浸没于液氮中的外层细管中。这种封闭式玻璃化冷冻方法避免了与液氮的直接接触，但冷却速率显著降低，为-1220 °C/min。从任一载体上装载和回收卵泡均较为简便。CL开放式载体每装置最多可装载十个卵泡，而RI封闭式载体仅能装载两个。本图改编自35。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67786/67786fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="细胞聚集过程，不同阶段的细胞簇显微镜图像，50-200μm 尺度。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67786/67786fig05.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图 5"> 
图 5：遇到的问题的代表性图像。（A）卵泡簇中卵母细胞被挤出。（B）孤立的卵泡，基底膜破裂，其中一个卵泡的卵母细胞被挤出。（C）凝胶中气泡下方包埋的卵泡。（D）保留在凝胶中的卵泡簇（左侧），与嵌入过深最终附着于培养皿的簇进行比较。FL-C 中卵泡大小的广泛差异清晰可见。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67786/67786fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="卵泡发育过程示意图；二维与三维培养、颗粒细胞生长、卵母细胞成熟。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67786/67786fig06.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图6"> 
图6：在透明质酸（HA）中二维与三维培养条件下卵泡生长的比较。 在二维培养中，到第4天观察到卵泡变扁平，颗粒细胞附着于组织培养皿上，导致卵母细胞易受颗粒细胞迁移、缝隙连接破坏以及过早排出的影响。而在HA包封的三维培养中，卵泡在整个培养期间均保持未附着状态。颗粒细胞向各个方向扩展，包裹卵母细胞并维持其三维结构。本图经修改自36。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67786/67786fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="卵泡发育阶段；类器官生长的显微镜图像；比例尺；窦腔形成重点。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67786/67786fig07.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图 7"> 
图 7：包埋于酪胺交联透明质酸凝胶中的卵泡代表性图像。（A）第 1 天新鲜卵巢经胶原酶消化后收集的前窦卵泡。（B）第 1 天接种四个前窦卵泡的凝胶滴图像，以及培养第 4 天（C）的图像。新鲜卵巢来源的卵泡簇在培养第 2 天（D）、第 6 天（E）和第 9 天（F）的图像。（G）来自玻璃化全卵巢经机械分离的卵泡簇，显示培养第 2 天和（H）第 6 天的图像。（I）培养第 9 天可见明显窦腔形成的卵泡。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67786/67786fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="卵裂期胚胎细胞、显微镜图像序列、发育生物学、细胞分裂过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67786/67786fig08.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图8"> 
图8：卵母细胞排卵。（A, B）排出的卵丘-卵母细胞复合体（COC）与HA凝胶珠相邻。（C）使用透明质酸酶对COC进行酶处理以去除周围卵丘细胞后拍摄的卵母细胞图像。可见大量处于第二次减数分裂中期（metaphase II）的卵母细胞。（D）具有明显第一极体的第二次减数分裂中期卵母细胞。放大倍数400倍。（E）利用偏振光成像系统对第二次减数分裂中期卵母细胞进行活体成像，以观察减数分裂纺锤体结构及其排列情况，操作方法如文献37所述。放大倍数400倍。可见正常的双折射纺锤体。（F）第二次减数分裂中期卵母细胞经固定后，使用抗α/β-微管蛋白抗体和碘化丙啶染色，以观察减数分裂纺锤体的组织结构。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67786/67786fig08large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="荧光显微镜，细胞分裂示意图，有丝分裂观察，实验结果，生物成像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67786/67786fig09.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="Figure 9"> 
图9：GV期卵母细胞中的染色质重排。 通过Hoechst 33342（50 ng/mL）染色DNA，观察卵泡形成后GV期卵母细胞中的染色质排列情况。使用轻柔吹打法从HA微珠中收集代表性卵泡。利用透明质酸酶去除颗粒细胞。随后将GV期卵母细胞染色15分钟（参见Monti等人的实验方案38）。图像以40倍放大倍数拍摄。（A）培养开始第1天的GV期卵母细胞，显示非包围型染色质（NSN）染色模式。（B）hCG触发当日来自生长中并已形成腔隙的卵泡的GV期卵母细胞，染色质发生凝聚，并在核仁周围形成环状结构。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67786/67786fig09large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>参数</td>
			<td colspan="2">新鲜卵巢</td>
			<td>冷冻卵巢</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>FL-分离</td>
			<td>FL-簇状</td>
			<td>FL-簇状</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>体外培养期间观察到的卵泡数</td>
			<td>130</td>
			<td>154</td>
			<td>69</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">HCG后排卵率 (%)</td>
			<td>71%</td>
			<td>66%</td>
			<td>93%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> (92/130)</td>
			<td> (101/154)</td>
			<td>(64/69)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2"> GVBD (%)</td>
			<td>30%</td>
			<td>28%</td>
			<td>52%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> (28/92)</td>
			<td> (28/101)</td>
			<td>(33/64)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MII卵母细胞形成率 (%)</td>
			<td>59%</td>
			<td>55%</td>
			<td>*34%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>(54/92)</td>
			<td>(56/101)</td>
			<td>(22/64)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：来自新鲜和玻璃化冷冻卵巢的透明质酸包埋卵泡的结果。 新鲜卵巢中的卵泡和FL-C进行成熟培养 体外 在透明质酸凝胶包封后。还使用乙二醇/二甲基亚砜（EG/DMSO）玻璃化冷冻方案处理的卵巢卵泡，测试了透明质酸凝胶的效果。39使用新鲜卵巢时，经胶原酶消化后可收集到单个卵泡（FL）和卵泡簇（FL-C）。而对于玻璃化冷冻卵巢，胶原酶处理实际上会对卵泡造成损伤。因此，处理冷冻保存卵巢的最佳方法是分离卵泡簇而非单个卵泡，并仅使用针头进行机械解剖。下表对比了将卵泡以4–6个为一组接种于HA微珠上，与将含6–10个卵泡的单个FL-C接种于HA微珠上的结果差异。*来自冷冻保存卵巢的FL-C其成熟率显著较低（p = 0.008；采用卡方检验分析显著性）。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">载体</td>
			<td>RI</td>
			<td>CL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>（闭合）</td>
			<td>（开放）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>存活率 (%)</td>
			<td>100% (24/24)</td>
			<td>100% (41/41)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>卵泡腔形成率* (%)</td>
			<td>25.0% (6/24)</td>
			<td>75.6% (31/41)*</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>排卵率 (%)</td>
			<td>66.7% (16/24)</td>
			<td>87.8% (36/41)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>成熟率 (% MIIs)</td>
			<td>81.3% (13/16)</td>
			<td>69.4% (25/36)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：使用两种不同玻璃化冷冻装置对分离卵泡进行冷冻保存后的结果。 使用开放式的CL装置和冷却速率较低的封闭式RI载体均获得了较高的成熟率。仅窦腔形成这一结果指标显示差异具有统计学意义，但并未影响总体成熟率（p &lt; 0.05；采用卡方检验分析显著性）。

本方案描述了一种利用酪胺交联透明质酸水凝胶包封并培养小鼠卵巢前腔卵泡的新型三维（3-D）培养模型。我们还详细介绍了通过玻璃化冷冻法进行卵巢卵泡冷冻保存的两种方法。

卵巢卵泡的三维结构以及体细胞组分与卵母细胞之间为实现……所必需的复杂相互作用

本研究致力于开发一种用于体外卵泡生长和卵母细胞成熟的三维培养系统。利用细胞天然细胞外基质的组分构建此类系统，将促进卵泡发育。最大的挑战是将动物模型中获得的知识应用于人类卵泡培养。获取人卵巢组织的途径有限，且人类卵泡在体外培养中需要更长时间才能实现卵母细胞成熟。本研究建立的三维培养模型可能特别适用于人卵巢卵泡的培养，可在卵母细胞成熟所需的较长培养周期中维持其三维结构。首先，取10至14日龄的B6D2F1小鼠幼崽的卵巢用于该实验。将6毫升预平衡的卵泡培养基（FCM）移入两个60毫米的培养皿中，表面覆盖矿物油，并进行孵育。将1毫升胶原酶加入培养皿的中心孔，将3毫升卵巢组织（OT）培养基加入外周孔中。将卵巢转移至胶原酶溶液中。胶原酶孵育结束后，将经胶原酶处理的卵巢移至外层孔中进行洗涤。更换微量移液器，将卵巢转移至盛有OT培养基的新培养皿中。为收获卵泡，使用剪成不同尺寸的移液器吸头反复吸取和排出经酶处理的卵巢组织。利用27号针头机械分离组织，以释放卵泡。在40倍解剖显微镜下观察，挑选具有位于中央的卵母细胞、且基底膜完整的次级前窦状卵泡转移至新的OT培养皿中。在开始包埋过程前，将 FCM2 培养皿放入培养箱中孵育 60 分钟。在盖子上制备两滴不含过氧化氢的透明质酸（HA）凝胶，每滴 25 微升，用于洗涤。将待包埋的卵泡或卵泡簇从 FCM 培养皿转移至一滴透明质酸（HA）凝胶中，以洗去培养基。将FCM培养皿放回鼓泡器下进行气体饱和。对于卵泡包埋，取1微升0.03%过氧化氢滴加到60毫米培养皿的盖上。然后加入25微升3毫克/毫升的HA凝胶并混匀。用移液器将约8到10微升的HA过氧化氢混合液分别加入八孔培养皿的两个独立孔中。迅速将卵泡、卵泡簇或卵巢组织碎片转移至每滴液体的中央，确保液滴内无气泡。三分钟后，向每孔中加入 100 µL 预先平衡的卵泡培养液。加入预热并预先平衡的矿物油覆盖，然后将培养皿放入培养箱中孵育。同时准备玻璃化冷冻过程所需的设备和溶液。将RI载体放入装有液氮的冷冻盒的插槽中。在直径60毫米培养皿盖子顶部附近，并排滴加两滴预热的玻璃化冷冻溶液1（VS1）。然后，将两个卵泡放入第一滴溶液中，清洗后迅速转移至第二滴VS1溶液中，孵育5分钟。在卵泡孵育的同时，在VS1液滴正下方制备三个VS2液滴。随后在60秒内将卵泡依次快速通过三个VS2液滴。进行玻璃化冷冻时，从VS2中拾取卵泡。在解剖显微镜下观察 RI 载体，并调节焦距以观察塑料棒上的微小孔洞。将带有极少量液体的卵泡植入孔中。将塑料棒放入预冷的外层麦管中，使用超声波封口机封闭麦管。将麦管置于固定在冻存提篮上的杯状容器中。用塑料保护套覆盖细管，并将其浸入液氮中。对于开放式载体玻璃化法，通过将金属CL杆插入磁化的小瓶盖中来准备载体，确保牢固固定。将一个架子放入冷冻盒中以放置冷冻小瓶，确保液氮液面低于小瓶顶部。用液氮填充经过磁化的新型冷冻管，并将其放入架子中。使用磁力棒通过附着在CL开放式载体上的磁性帽夹取该载体。将CL载体浸入另一滴VS2溶液中，以形成一层冷冻保护剂薄膜。拾取所有卵泡或卵泡簇，并将其置于滤膜上，尽量减少携带的液体。立即将黄体（CL）浸入装有液氮的冷冻管中，以实现样本的玻璃化冷冻。将冷冻管放置在冷冻提篮上，然后套上塑料保护套。将麦管浸入液氮储存罐中。准备一个中心小室培养皿，在外周小室中加入3毫升预平衡的FCM，在中心小室中加入1毫升。在培养基上覆盖油层后，将培养皿置于鼓泡器下进行气体平衡。将预热至 37 摄氏度的 0.5 毫升 WS1 和 WS2 温育液分别加入两个已标记的中心小室培养皿中。将装有样品的冻存管从液氮储存罐转移至装有液氮的冻存盒中。首先，取下塑料冻存管盖。然后保持吸管浸没，将其从烧杯中取出，并滑入冷冻盒的固定槽中。在黑色圆点上方剪断外层吸管。将内层塑料棒从外层吸管中取出，并迅速将塑料棒浸入WS1中，轻轻旋转，于10秒内释放出卵泡。在 WS1 中孵育两分钟后，使用微量移液器将卵泡或卵泡簇转移至 WS2，孵育三分钟。随后将其转移至 FCM 培养皿中，并在包埋前于中央孔中孵育 1 至 2 小时。对于开放式载体 CL 复温，重复 FCM 和 WS 培养皿的准备工作。将冷冻杆转入冷冻盒中，并移除塑料杆盖。使用磁力棒将冻存管盖抬起，直至可见玻璃化载杆（CL）的金属柄。用磁力棒夹住附有CL载体的管盖，迅速将CL浸入WS1溶液中，并在10秒内轻轻搅动以释放卵泡。在三维透明质酸凝胶培养体系中，原始卵泡的生长得以维持，并保留了卵泡的天然结构，到第12天时可见卵泡腔的形成。包裹在透明质酸凝胶中的卵泡由于颗粒细胞增殖而呈现放射状扩张，培养期间卵泡直径从约139.8微米增加至385.6微米。在人绒毛膜促性腺激素诱导排卵后，可在卵泡附近观察到排出的中期Ⅱ卵母细胞。卵母细胞的直径约为 84.8 微米。使用新鲜卵巢时，单个卵泡和卵泡簇均表现出良好的成熟率。来自冷冻保存卵巢的卵泡簇成熟率较低，导致卵母细胞过早排出。分离卵泡冷冻保存的效果优于整个卵巢的保存。无论降温速率如何差异，使用两种载体进行卵泡玻璃化冷冻均获得了较高的成熟率。CL开放式载体系统可高效冷冻保存多个卵泡，缩短了操作时间。

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卵巢组织培养可作为卵泡发育、排卵和卵泡闭锁的模型，并揭示动态卵巢过程的调控机制。...

小鼠卵巢组织培养以观察卵巢中的现象

本文展示了两种在三维培养条件下包封猪卵母细胞的实验方案。第一种方法是将卵丘-卵母细胞复合体（COCs）包封于纤维蛋白-海藻酸盐微珠中；第二种方法是将其与氟化乙烯丙烯粉末颗粒（微型生物反应器）共同封装。这两种系统均可提供最佳条件，以维持卵母细胞的三维结构。...

蛋白酶可降解的海藻酸盐水凝胶与疏水性微型生物反应器用于猪卵母细胞包封

本文介绍了一种从冻融后的卵巢皮质组织中分离人卵巢卵泡以进行基因表达分析的实验方案。...

人类卵泡中的基因表达分析

我们描述了一种在新型无支架琼脂糖模具中培养卵巢卵泡的方法，该方法可作为补充 体外 配子发生...

可定制琼脂糖模具的制备及其在无支架小鼠卵巢卵泡培养中的应用

我们介绍一种基于芯片的平台，用于在微型生物反应器中进行细胞的三维培养。一块芯片可容纳多达1000万个细胞，并可在无菌、封闭的循环系统中，对流体流动、氧张力等条件进行精确控制，从而实现细胞培养。...

基于芯片的灌注式微型生物反应器中的三维细胞培养

我们介绍了两种用于三维细胞培养的多孔聚合物芯片微加工工艺。第一种是热压印与溶剂蒸气焊接工艺相结合的方法。第二种则采用 recently developed...

芯片级三维细胞培养支架的微加工

学习使用酪胺交联透明质酸水凝胶进行小鼠卵巢卵泡的三维培养与玻璃化冷冻保存技术。该方法有助于在体外培养过程中保持卵泡的天然三维结构，促进卵母细胞成熟，为生殖生物学和生育力保存研究提供新途径。

一种新型透明质酸水凝胶在卵泡三维培养中的应用及小鼠卵巢卵泡冷冻保存方法

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