利用新型印章装置从二维细胞培养生成三维球状体/类器官

本研究的目的是建立一种高效且可重复的三维细胞培养生成方案，利用琼脂糖模具中的创新阶梯式微孔系统。我们旨在探索如何构建简化且可控的环境，以促进生成均一、高质量的三维细胞培养物，用于药物测试、基因工程及相关应用。近年来，三维细胞培养系统的进步改善了细胞间的相互作用，并创造了更接近体内环境的培养条件。

该方法可增强类球体类器官的形成，使其成为生物医学研究中一种颇具前景的工具。目前用于三维细胞培养的技术包括悬滴法、旋转细胞培养、低吸附塑料、锥形孔板、微孔支架、磁珠以及无支架水凝胶。这些方法均能实现三维细胞结构的形成，各有其优势与局限性。

本方案旨在解决大规模制备尺寸均一、质量稳定的三维球状体及类器官所面临的挑战。该方法克服了细胞活力与细胞密度问题，以及操作过程中的困难和不稳定性，提供了一种经济高效、可重复的可靠三维细胞培养研究解决方案。我们致力于改进研究工具，制备可分泌胰岛素的β细胞的球状体和类器官，用于体外分析并包封于生物聚合物中，以期逆转Ⅰ型糖尿病；同时，构建三阴性人乳腺癌细胞来源的球状体和类器官，作为患者治疗前的药物筛选平台。

使用指定软件设计印章装置。用软毛海绵和蒸馏水清洗定制的印章，以去除任何残留物。将清洁的印章暴露于紫外光下 5 至 10 分钟，以确保无菌。

制备1%至2%的琼脂糖溶液时，称取所需量的纯琼脂糖粉末，并将其溶解于PBS中。将溶液放入微波炉加热，直至琼脂糖完全溶解。随后，用移液器将约三毫升40摄氏度的琼脂糖溶液加入六孔板的每个孔中。

将印模置于孔中央，静置 5 到 10 分钟使琼脂糖凝固。凝固后，轻轻前后移动以取出印模，释放真空的同时避免损坏微孔。用 PBS 洗涤微孔三次，以去除残留物。

将培养板暴露于紫外光下10分钟，以消除微生物污染。向6孔板的每孔中加入3毫升培养基，并在37摄氏度的二氧化碳培养箱中过夜培养。为获得均匀悬浮的猪胰岛细胞，向二维细胞培养物中加入胰蛋白酶以解离细胞。

然后，对细胞进行计数，并调整浓度，以达到六孔板中每个微孔所需的细胞数量。将3毫升细胞悬液加入琼脂糖微孔中，并轻轻摇动培养板以确保细胞均匀分布。静置10至15分钟，使细胞依靠重力沉降。

然后在显微镜下观察已贴壁的细胞。将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中孵育。每两到三天，用新鲜培养基更换50%的旧培养基或耗尽的培养基。

继续培养，直至致密的三维结构完全形成。收集球状体或类器官时，移除培养基，并使用剪去尖端的移液枪头，通过剧烈吹打收集三维结构。通过时间依赖性的细胞聚集观察发现，在琼脂糖微孔中培养48小时后，已成功形成致密的三维结构。

从琼脂糖微孔中取出后，三维结构仍保持活性，绿色染色显示结构内有活细胞，证实了细胞的存活率和稳定性。