Name: 用于转化研究的可溶性基底膜提取物生物打印的体积挤出生物打印机的设计和验证 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-28T14:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: 了解用于生物打印可溶性基底膜提取物的体积挤出生物打印机的设计与验证方法。该系统实现了高细胞存活率和良好形状保真度，为癌症研究中的三维组织构建提供了可靠的技术方案。

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本工作部分由加速奖（Accelerator Award）项目编号 n&#176; A26815，题为： &#34;单细胞癌症演化在临床中的研究&#34; 由英国癌症研究会与AIRC基金会合作资助（编号&#176; 22790）以及欧盟—下一代欧盟，任务4，组成部分1，CUP D53D23003310006。

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作者声明无任何利益冲突。

在转化医学研究中，SBMes 在从组织工程到药物测试的多种研究领域中具有重要价值2,3特别是在癌症研究中，它们已成为基础性工具，因其可模拟肿瘤微环境的力学和生化特性，从而能够构建更真实反映肿瘤生长、转移及治疗反应的模型。SBMe 是应用最广泛的生物基质，尤其适用于三维类器官培养。13,14来源于Engelbreth-Holm Swarm小鼠肉瘤的天然细胞外基质，其具有独特的成分组成，包括IV型胶原、层粘连蛋白、巢蛋白和小带蛋白。这些成分存在于多种正常组织中，从而使SBMe能够更真实地模拟复杂的基底膜结构。SBMe可促进细胞自我组装成高度模拟天然组织特征的三维结构。 在体内 组织14然而，它具有复杂的流变行为和较低的力学性能，无法使用标准的气动驱动分配系统进行打印，否则会以不可控的方式从 cartridge 中喷出<sup class="xr...

在转化研究中，构建能够紧密模拟体内环境的三维体外模型对于推动科学认知和治疗手段的开发至关重要1。构建这类模型的关键在于使用细胞外基质（ECM）类似物，例如可溶性基底膜提取物（SBMes），它们能更真实地反映天然组织的复杂性。SBMes 在从组织工程到药物测试等多种研究领域中具有重要价值2,3。尤其在癌症研究中，SBMes 已成为基础性材料，因其可模拟肿瘤微环境的力学和生化特性，从而支持构建更能真实反映肿瘤生长、转移及治疗反应的模型。
事实上，尽管过去几十年取得了显著进展，许多疗法仍不断失败，导致临床治疗中频繁出现治疗失败。这种失败通常归因于由细胞高度异质性引起的耐药机制。4,5有效的 体外 能够准确重现人类肿瘤复杂性的模型，对于深入理解癌症演化并预测这一现象至关重要。
传统的二维细胞培养在癌症研究中具有基础性作用，但由于无法模拟真实肿瘤的三维结构和微环境，可能产生关于药物疗效和肿瘤行为的误导性信息6,7,8。相比之下，三维体外（in vitro）模型已成为有前景的替代方法，通过模拟三维复杂性，更准确地再现肿瘤微环境及其生物学行为9,10。
在癌症研究中，类器官被广泛用作三维模型，以研究疾病机制和药物疗效，因为它们能够更准确且更真实地模拟人体组织和器官。源自Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤细胞的可溶性基底膜提取物（SBMe）在推动癌症研究方面发挥了关键作用11,12。SBMe提供了一种凝胶状基质，使细胞能够在其中生长、增殖并自组织形成类器官结构，从而确保其正常发育和生长13,14。
然而，由于可溶性基底膜提取物（SBMe）具有独特且复杂的特性，其应用面临诸多挑战。作为一种非牛顿流体，SBMe表现出剪切稀化特性，即其黏度随剪切应力的增加而降低，导致在不同外力作用下其操作和施用过程不一致。此外，其触变性进一步增加了复杂性，因为在剪切应力移除后，其黏度会随时间逐渐恢复15,16。这些特性，结合较低的机械强度（储能模量值根据蛋白浓度在10 Pa至5,000 Pa之间变化）以及对温度敏感的性质，加剧了操作难度，因此在制备、使用以及直接进行生物打印时需要极为精细的控制。
标准的气动驱动式生物打印系统无法精确控制SBMe的分配，因为施加压力会导致材料从注射器中喷出后出现不可控的行为。这种现象类似于聚合物熔体中所描述的“突喷”效应，即当压力超过某一临界值时，流速会突然增加17,18,19。正如我们在先前的研究中所述16，体积控制式分配策略能够将SBMe的挤出过程与分配器内因基质流变特性、工作条件和喷嘴几何结构而产生的压力解耦。近年来，市场上已有多项尝试采用相同原理，其中以Corning公司的Matribot系统处于领先地位。该系统通过精确控温条件，可实现对SBMe及其他温度敏感型生物墨水的操作与沉积。然而，其成本较高，可能限制了小型实验室的获取与使用。
在我们之前发表的论文中，我们提出了一种低成本的定制替代方案——一种基于体积控制的生物打印系统16。该版本基于一台经过改装的入门级3D打印机，并配备了一个定制的3D打印挤出装置。尽管该系统在生物打印方面具有良好的效果，但在打印重复性方面仍存在一些局限性。由于其源自入门级3D打印机，因此在Z轴运动和自动归位方面存在一些问题。为满足这些需求，我们开发了该定制低成本体积分配系统的升级版本，并建立了利用SBMe进行生物打印结构的特定实验方案。
本文提供了该系统的构建与使用方案。该系统由基于先前研究16的定制容积控制挤出装置、生物打印仪外壳和控制系统组成。各模块分别进行生产和组装。按照基质操作的方案说明，将系统组装并用特定的gcode文件编程后，可使用SBMe精确打印出形态保真度良好的单层或多层纯或稀释结构。

用于转化研究中可溶性基底膜提取物生物打印的容积式挤出生物打印机的设计与验证

Design and Validation of a Volumetric-extrusion Bioprinter for Bioprinting of Soluble Basement Membrane Extract for Translational Research

在转化研究中，3D 体外 模型对于推动科学认知和治疗手段的开发至关重要。为此，源自小鼠肉瘤细胞的可溶性基底膜提取物（SBMes）在模拟体内微环境的力学和生化特性方面发挥着关键作用。 在体内 微环境。它们在从组织工程到药物测试的多种研究领域中具有重要价值。特别是在癌症研究中，它们已成为基础性工具，因为该领域广泛使用的传统二维细胞培养可能提供误导性信息，因其无法模拟三维（3D）结构和肿瘤微环境。
在癌症研究中，有效的三维 体外 模型对于深入理解癌症演化过程及预测药物耐药机制等挑战至关重要。类器官已成为一种具有前景的三维 体外 模型，能够更准确地反映肿瘤生物学特性。它们在SBMes中生长，因为SBMes可形成一种使细胞能够生长并自组织为三维结构的环境。然而，SBMe存在显著挑战，包括机械性能较低和复杂的流变行为，从而限制了其在市售的气动挤出式生物打印系统中的应用。 
为解决这些局限性，我们开发了一种低成本、体积可控的生物打印系统及使用SBMe打印结构的特定方案。该系统基于体积式挤出装置，克服了传统气动驱动方法的局限性。系统在组装完成后，通过特定g代码编程，可对纯化或稀释的SBMe进行生物打印，从而获得单层或多层结构。该方法为构建三维细胞培养模型提供了更可靠且可扩展的技术途径，有助于更有效地开展新型治疗方法和药物测试的研究。

本文介绍了一种使用低成本、自制容积式生物打印机，以SBMe材料进行生物打印构建物的实验方案。我们提供了该系统的详细描述及用于构建系统的3D打印*.STL文件，并通过打印单层和多层结构，展示了其在癌症研究中的潜在应用价值。每个3D打印部件在组装前均已彻底清除支撑结构或不必要的打印残留物。图8展示了整体组装结构的不同视角，提供两种不同选择：(A) 采用分体式设计，以便于在生物安全柜内减小占用空间；或(B)将电子控制模块直接连接至结构上，以获得更紧凑的系统设计。
本体积生物打印系统及所展示方案的目的是提供一种使用纯SBMe16进行生物打印构建的替代策略。得益于该方法，我们能够获得具有良好形状保真度的自支撑结构。图9和图10展示了使用所述系统优化打印过程的示例。如图所示，必须始终评估打印精度，以确定...

可溶性基底膜提取物是癌症研究中最常用的生物基质，但其复杂的流变行为使得在商业化的生物打印系统上进行生物打印十分困难。本研究提出了一种定制化的生物打印策略，能够以良好的形状保真度制备出单层和多层的纯基质结构。

在转化研究中，三维体外模型对于推动科学认知和治疗手段的开发至关重要。为此，源自小鼠肉瘤细胞的可溶性基底膜提取物（SBMes）在模拟体内微环境的力学和生化特性方面发挥着关键作用。它们在从组织工程到药物测试等多个研究领域均具有重要价值。尤其在癌症研究中，传统的二维细胞培养虽被广泛使用，但由于无法再现肿瘤的三维（3D）结构及其微环境，可能产生误导性结果，因此SBMes的应用变得尤为基础。在癌症研究中，有效的三维体外模型对于深入理解肿瘤演化过程以及预测诸如耐药机制等挑战至关重要。类器官作为一种前景广阔的三维体外模型，能够更准确地反映肿瘤生物学特征。它们在SBMes中生长，因为后者为细胞提供了可生长并自组织形成三维结构的环境。然而，SBMes存在显著局限性，包括力学性能较低和复杂的流变行为，使其难以适用于市面上现有的气动挤出式生物打印系统。为克服这些限制，我们开发了一种低成本、体积可控的生物打印系统及配套的SBMes打印专用方案。该系统基于体积式挤出装置，克服了传统气动驱动方法的局限性。系统在组装完成后，通过输入特定的g代码即可实现纯态或稀释态SBMes的生物打印，从而获得单层或多层结构。该方法为构建三维细胞培养模型提供了更可靠且可扩展的技术路径，有助于推动新型疗法研发和药物测试的进一步发展。

本研究的目标是设计并验证一种低成本的体积控制式生物打印系统，并开发用于生物打印可溶性基底膜提取物的特定方案。SBME因其独特而复杂的血清学特性，在操作过程中面临诸多挑战，需要在制备过程中进行精细控制，并严重限制了其作为纯材料的使用。标准的以实践为导向的生物打印系统无法对SBME的分配进行有效控制，通常需要使用生物墨水混合物，从而引入变异性。体积控制式生物打印系统可解决这些问题，但现有系统仅限于恒定溶液的应用。与现有技术相比，我们自主研发的体积控制式生物打印系统提供了一种本地化的低成本解决方案，能够使用SBME实现纯态或稀释态结构的生物打印，并具有良好的形状保真度。[讲师] 首先，将STL设计文件加载到切片软件中。将模型放置在平面上，并将其移动至X、Y、Z轴坐标为65、42.5、0毫米的位置。在对象列表中点击STL文件名并选择“复制所选”，创建两个副本，分别移至坐标：16、42.5、0毫米和-33、42.5、0毫米。进入阶段菜单中的打印设置，在壁面部分将壁线数量设为零；在顶部和底部部分将顶部和底部厚度设为零。在填充面板中，将填充模式设为网格，填充线间距设为5毫米，填充线方向设为零。在移动部分禁用回抽，在冷却部分禁用打印冷却。在构建板附着部分，选择“无”作为构建板附着类型。在特殊模式部分，选择“逐个打印”作为打印顺序。点击切片按钮生成G代码。使用记事本打开G代码文件，在第12行“由Cura_SteamEngine 4.9.0生成”之后，删除M104 S200、M105和M109 S200三行。在“;MESH列文件名.STL”行之前添加G1 Z25。将下一行拆分为两行。在每个部件最后一层指令中，TIME_ELAPSED注释之后的所有行中，将Z值修改为Z25。将含有商用小鼠前列腺癌细胞的培养瓶置于生物安全柜下。使用移液器从培养瓶中移除细胞培养基。用2毫升PBS清洗细胞一次，然后吸除。向培养瓶中加入500微升胰蛋白酶。将培养瓶放入培养箱中孵育5分钟，以促进细胞从培养皿上脱落。检查细胞消化情况。随后，向培养瓶中加入4.5毫升培养基。轻轻冲洗培养皿，确保所有脱落的细胞均悬浮于培养基中。吸出培养基并转移至15毫升离心管中。取20微升该悬液与台盼蓝混合。用移液器将10微升该混合液加入细胞计数板中，计数活细胞。将剩余细胞悬液在4摄氏度下以345 g离心5分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于冷的可溶性基底膜提取物（SBME基质）中，调整至所需细胞密度。使用预冷的注射器吸取含有细胞的基质悬液800微升。排出注射器中残留的气泡后，将注射器放入无菌盒中，孵育15分钟以完成凝胶化。孵育结束后，将注射器插入生物打印机打印头中。确保注射器活塞与推块接触。使用注射器活塞固定器固定活塞和注射器，通过两颗螺钉及对应螺母紧固。使用挤出机底部的M4螺母调节弹簧压力，并将注射器锁定到位。在生物打印机菜单中选择自动回零设置，对系统进行校准，以自动检测各轴原点。将六孔板放置于打印平面。使用移动轴命令移动挤出机，直至针尖接触孔底，手动定义Z轴零点。在生物打印机菜单中选择G代码文件，开始打印，在每个孔中沉积边长为2.6厘米的六层方形网格。打印完成后，使用倒置显微镜检查打印过程是否成功。将多孔板放入培养箱中孵育2分钟，使SBME在挤出后充分稳定。最后，向每个孔中加入2毫升细胞培养基。该图展示了蛇形图案可打印性的评估，重点关注不同进料速率下的纤维均匀性和铺展比。当进料速率从E100增加至E200时，铺展比也随之增加，表明在较高流速下纤维沉积更宽。当打印速度从5毫米/秒变化至20毫米/秒时，所有测试条件下铺展比均保持相对稳定，表明打印速度对纤维宽度影响较小。该图展示了单层和多层网格的可打印性评估结果。在单层结构中，孔径的变化导致网格均匀性出现明显差异。在打印多层网格时，构建体基本保持了形状保真度。打印结构的平均纤维直径与CAD模型及单层结构一致，表明生物打印过程在多层结构和不同几何形状下均具有良好的可靠性。该图评估了3D生物打印构建体与对照样品的细胞活力。细胞活力保持在80%以上，与对照组相似，表明打印过程对细胞活力影响极小。10倍和20倍放大倍数下的显微图像显示两组之间无显著形态学差异，证实细胞分布和形态在两组中相似。

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Research

科研

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Bioengineering

生物工程

用于转化研究的可溶性基底膜提取物生物打印的体积挤出生物打印机的设计和验证

采用生物打印机基于可牺牲模具制备出具有特定图案的水凝胶。首先用第二种水凝胶填充泊洛沙姆模具，随后将其洗脱，形成可被第三种水凝胶填充的孔隙结构。该方法利用泊洛沙姆快速洗脱和良好可打印性的特点，实现由生物聚合物构建复杂结构。...

打印热响应性反向模具以制备用于三维细胞培养的图案化双组分水凝胶

设计并制造了一种笛卡尔式生物打印机，可实现多种材料在精确且可重复的几何形状中的沉积，同时允许对环境因素进行控制。利用该三维生物打印机，可打印出复杂且具有活性的结构，并能够轻松实现重复制备。...

使用三喷头笛卡尔打印机进行细胞构建物生物打印的活性研究

我们提供一种基于微流控生物打印策略的通用方案，用于构建微纤维血管床，其中可进一步将第二种细胞类型接种于该微纤维结构的间隙空间，以生成带血管化的组织和类器官。...

用于构建血管化组织和类器官的微流控生物打印技术

我们开发了一种异质性乳腺癌模型，该模型由永生化的肿瘤细胞和成纤维细胞嵌入可生物打印的海藻酸盐/明胶生物墨水中构成。该模型可重现 体内...

可生物打印的海藻酸盐/明胶水凝胶3D 体外 模型系统诱导细胞球体形成

本研究的目的是设计并构建一种基于储料装置的熔融挤出式三维打印机，该打印机采用开源且低成本的组件，适用于生物医学和食品打印行业。...

开源低成本生物墨水与食品熔融挤出3D打印机的设计

本文介绍了一种明胶甲基丙烯酰胺的3D生物打印方法。...

基于明胶甲基丙烯酰胺水凝胶生物墨水的3D生物打印方案

工程化皮瓣需要整合功能性血管网络。在本方案中，我们介绍一种制造包含分级血管网络的3D打印组织皮瓣的方法，并将其直接与大鼠股动脉进行显微外科吻合。...

利用3D打印技术制备工程化血管皮瓣

水凝胶形成过程中的剪切处理可产生微凝胶悬浮液，该悬浮液具有剪切变稀特性，但在去除剪切力后能迅速重构。此类材料已被用作生物打印复杂、含细胞结构的支撑基质。本文描述了用于制备支撑床及相容性生物墨水的方法。...

通过凝胶化过程中剪切处理形成琼脂糖流体凝胶用于悬浮3D生物打印

本文介绍了如何使用3D生物打印光可调水凝胶来研究细胞外基质硬化和成纤维细胞活化。...

3D生物打印光可调水凝胶以研究成纤维细胞活化

我们介绍一种利用3D生物打印技术在标准六孔板上高通量制备具有可调尺寸和特定图案血管通道的实验方案，该技术被称为“孔板上的血管”（vessels-on-a-plate,...

高通量生物打印方法用于在标准六孔板中灵活构建具有可调尺寸与图案的血管通透性模型

利用κ-卡拉胶亚微凝胶介质嵌入式生物打印类组织结构

了解用于生物打印可溶性基底膜提取物的体积挤出生物打印机的设计与验证方法。该系统实现了高细胞存活率和良好形状保真度，为癌症研究中的三维组织构建提供了可靠的技术方案。

用于转化研究中可溶性基底膜提取物生物打印的容积式挤出生物打印机的设计与验证

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