Name: 果 蝇 头部的直接冷冻切片，用于增强脑荧光染色和免疫染色 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-07T14:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: 了解果蝇脑部组织的直接冷冻切片技术，包括断头、固定、切片和荧光染色步骤。该方法简化了复杂解剖操作，无需昂贵设备即可实现高质量成像分析。

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我们感谢Melkani实验室成员在制定本方案过程中提供的宝贵反馈和帮助。果蝇品系Elav-Gal4（BL#458）和UAS-ApoE4（BL#76607）来自美国印第安纳州布卢明顿市的布卢明顿&#160;Drosophila&#160;品系中心（Bloomington, IN, USA）。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号为AG065992和RF1NS133378，授予G.C.M.。本研究还获得了阿拉巴马大学伯明翰分校（UAB）启动资金3123226和3123227对G.C.M.的支持。

1. 仪器设备的准备
<ol>
	<li>确保冷冻切片机已开启并设置为 -20 °C。开启载玻片加热器或小型培养箱，并将其温度设置为 37 °C。 
	注意：在此阶段，已标记的载玻片可放置于加热器或培养箱中，可无限期保存直至进行切片。</li>
</ol>
2. 溶液的配制
<ol>
	<li>从10倍浓度磷酸盐缓冲液（PBS）储备液配制50 mL 1倍浓度磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4。用PBS配制终体积为10 mL的4%多聚甲醛溶液。</li>
	<li>在喷雾瓶中配制70%乙醇水溶液作为清洁液。配制封闭液（用20倍浓度Tris缓冲盐水储备液配制含3%牛血清白蛋白（BSA）的Tris缓冲盐水）。配制一抗溶液（稀释比例根据实验而定）。此处使用ApoE小鼠抗体在含3% BSA的TBS中1:250稀释的溶液。</li>
	<li>配制二抗溶液（稀释比例根据实验而定）。此处使用Alexa Flour 750 A21037山羊抗小鼠二抗在含3% BSA的TBS中1:500稀释的溶液。</li>
	<li>配制荧光染料溶液（稀释比例根据实验而定）。此处配制5 µg/mL Nile Red的PBS溶液。 
	注意：所有溶液，尤其是荧光溶液，应冷藏并保存在避光冷藏容器中。使用前需恢复至室温。</li>
</ol>
3. 组织采集
<ol>
	<li>在获得老化培养瓶中的果蝇后，打开 CO2 麻醉垫的阀门，迅速将果蝇倾倒至麻醉垫上，以避免其逃逸。等待果蝇基本失去意识，几乎不再活动。通过移动载物垫将果蝇置于 SZ61 显微镜物镜下方，调节放大倍数和焦距，使果蝇清晰可见且便于进行断头操作。 
	注意：本示例所用果蝇为 ELAV/+ 和 ELAV&#62;ApoE4</li>
	<li>将弹簧剪插入果蝇胸部与头部之间，用力夹紧，每实验组剪下 5 至 10 个果蝇头部。将未使用的果蝇放回其老化培养瓶中。 
	注意：若担心固定剂渗透不充分，可在步骤 4.1 中对头部后部做一小切口，以增强固定剂的渗透。</li>
	<li>使用毛刷将头部轻柔转移至预贴标签并置于冰上的 1.5 mL 离心管中，直至 ELAV/+ 和 ELAV&#62;ApoE4 各组样本收集完毕。</li>
</ol>
4. 组织整体固定
<ol>
	<li>从冰上取出离心管，每管加入100 µL含4%多聚甲醛的PBS溶液，确保所有头部组织完全浸没于溶液中。若头部组织粘附在管壁上而未能接触溶液，可用毛刷轻轻将其推入液面下，或轻敲管子使其接触溶液。</li>
	<li>将离心管置于摇床上，以中等速度振荡15分钟。15分钟后，弃去多聚甲醛溶液，每管加入1×PBS溶液孵育10分钟，确保所有头部组织浸没于溶液中。</li>
	<li>每次均弃去前一步的溶液，用PBS溶液洗涤组织3次，每次10分钟，共洗涤3次。</li>
	<li>最后一次洗涤后，将头部组织转移至含10%蔗糖的PBS溶液中，确保组织完全浸没于管内液体中，并于4℃过夜孵育以实现充分饱和。 
	注意：若需当天成像，可缩短蔗糖渗透时间；但相应的冷冻保护效果也会相应减弱。</li>
</ol>
5. 模具制备
<ol>
	<li>将最佳切割温度（OCT）包埋剂注入已标记的模具中，填充至约50%，使其扩散至模具的四个角落。</li>
	<li>使用刷子小心地将头部样本放置于模具内OCT的表面。当将多个实验组放入同一模具时，应确保各组在模具内相互分隔，以避免混淆。 
	注意：务必防止刷子携带先前的蔗糖溶液污染OCT，导致其稀释。此外，使用刷子将样本压入OCT深处可能在头部周围产生大量气泡。应避免这些错误，以防后续切片出现问题。</li>
	<li>使用镊子尖端，缓慢将每个头部推至模具底部，使眼睛朝向底部。此方向选择用于冠状面切片。</li>
	<li>在此过程中避免头部被刺破或压碎。在X、Y和Z三个维度上对齐所有头部，确保每个切片同时包含所有样本。应缓慢浸入以减少气泡形成。</li>
	<li>当所有头部均正确对齐后，小心地将模具直接放入-20 °C环境中冷冻。 
	注意：若在切片过程中发现头部对齐明显偏差，可考虑使用干冰或液氮对模具进行快速初始冷冻。</li>
	<li>当模具基本冻结后，用OCT填充剩余空间，并在长期储存于-80 °C前完成冻结。</li>
</ol>
6. 模具的冷冻切片
注意：通常建议在切割实验组模具之前，先制备并切割一个空白模具。这可以在对组织进行切片前立即确保轮子、刀片和防滚玻璃的正常功能。
<ol>
	<li>在模具上涂抹足量的OCT包埋剂，将卡盘头置于其上并压平，以将卡盘头固定在模具上。将模具放入冷冻切片机中完全冷冻，通常在5分钟内完成。</li>
	<li>将卡盘头及OCT冻块从模具中取出，放入卡盘中，确保模具保持从上到下的正确方向。用卡盘钥匙拧紧，直至卡盘头固定牢固。</li>
	<li>使用调节旋钮和卡盘深度控制装置，将组织块与刀片对齐。</li>
	<li>将切片厚度设为20 µm。以缓慢但稳定的速度进行切片，使防卷板玻璃捕获每一片切片。使用预热的载玻片收集切片：将载玻片接触切片的近端边缘，使切片自然卷附到载玻片上。当适当留出间距时，标准尺寸的载玻片（25 mm × 75 mm × 1 mm）最多可容纳八片切片。 
	注意：在选择收集哪些切片时需做出判断。由于包埋方向的关系，较早切出的切片来自头部的前部区域，而较晚切出的切片则来自后部区域。因此，若对某一特定区域更感兴趣，可相应调整切片的选择。或者，也可将所有切片依次收集在多张载玻片上，直至组织完全切完。</li>
	<li>让载玻片在室温下干燥至少30分钟，但不超过1小时。</li>
</ol>
7. 染色与免疫组织化学（IHC）
注意：本方案将详细说明使用未标记的一抗进行免疫组化染色的方法。若需同时使用荧光染料标记的抗体或其他可在单步完成的荧光染色剂，应将其与二抗共同使用。
<ol>
	<li>干燥结束后，立即用刀片去除载玻片边缘的OCT包埋剂，为疏水边界留出空间。使用&#160;标记笔在每张载玻片上画出疏水边界。静置使其干燥5分钟。</li>
	<li>用PBS轻轻吹打载玻片表面，对所有载玻片进行洗涤，每次5分钟，共洗涤3次，尽可能避免将液体直接加在组织上。 
	注意：此处使用1000 µL移液器最为合适。一张带有组织的标准尺寸载玻片，完全覆盖所需溶液量约为750 µL。也可使用载玻片架和容器进行操作。</li>
	<li>载玻片洗涤后，将含3% BSA的TBS封闭液滴加至载玻片上。室温孵育30分钟。</li>
	<li>弃去封闭液，滴加&#160;一抗溶液。本实验中使用的是在含3% BSA的TBS中按1:250稀释的SC-13521 ApoE抗体。4 °C过夜孵育，或室温孵育1小时。使用湿润的擦拭纸或纸巾覆盖以防止溶液在过夜孵育期间干燥。</li>
	<li>弃去一抗溶液，用移液器以PBS洗涤3次，每次5分钟。</li>
	<li>加入二抗溶液。本实验中使用的是在含3% BSA的TBS中按1:500稀释的AF 750山羊抗小鼠抗体，同时加入浓度为5 µg/mL的尼罗红染料。室温孵育1小时。 
	注意：我们将荧光染料与二抗同时在同一种缓冲液（含3% BSA的TBS）中孵育。只要两种试剂之间无已知干扰，此方法为首选。若存在干扰，则应分别孵育，并在两次孵育之间增加额外的3次洗涤步骤。</li>
	<li>用PBS洗涤载玻片3次，每次5分钟。最后一次洗涤后，在载玻片上保留&#160;少量PBS。</li>
</ol>
8. 成像用样品的封片与制备
<ol>
	<li>使用 1000 µL 移液器，将 3–5 滴含 DAPI（0.9 µg/mL）的硬化封片介质均匀滴加到载玻片上，避免直接滴在组织上。</li>
	<li>将盖玻片盖在载玻片上，避免产生气泡。 
	注意：使用镊子有助于操作，可使盖玻片先滑至载玻片表面附近，再缓慢释放。</li>
	<li>小心处理新封片的载玻片，并将其平放保存直至完全干燥。若需长期保存，应用指甲油密封。</li>
	<li>应尽快采集图像，以避免荧光衰减。</li>
</ol>
9. 图像采集
注意：图像采集将详细介绍使用 Olympus Cell Sense Dimensions 软件的操作方法。
<ol>
	<li>成像前，检查载玻片并用70%乙醇水溶液擦拭。若封片后立即进行成像，清洁时需格外小心，避免扰动盖玻片。在成像前，让载玻片和盖玻片表面干燥5分钟。</li>
	<li>选择每个需要采集的通道，本例中为DAPI、尼罗红（Nile Red）和AF 750通道。
	<ol>
		<li>按以下说明选择所需放大倍数。放大倍数的选择取决于实验设计；此处使用10倍放大倍数。 
		注意：所有放大倍数均可使用，包括油镜。如需要，可在载玻片表面滴加浸油。</li>
		<li>针对每个通道，根据实验中荧光最强的样本校准合适的曝光时间。在尽可能获得明亮图像的同时，避免过度曝光。 
		注意：通常导致成像质量差的两个主要因素是过度曝光（导致细节丢失）和背景信号过高（难以与真实信号区分）。此外，每种不同的放大倍数都必须独立设置曝光参数。</li>
		<li>在菜单中选择保存文件夹并命名合并后的图像。采集完成后，所有图像将保存在此文件夹中，并使用此处定义的名称。</li>
		<li>开始采集图像时，首先在能够提供最佳焦平面的通道中对样本进行聚焦，然后开始采集。为保证实验一致性，后续每个样本均应在同一通道中进行聚焦。</li>
		<li>所有用于后续比较的实验组应在同一天内完成成像，以避免不同组间因荧光衰减而产生偏差。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
10. 定量分析
注意：定量分析可使用多种软件完成。本文以 Olympus CellSense Dimensions 软件为例进行说明。
<ol>
	<li>采集完成后，检查图像。将存在缺陷&#160;或切片伪影&#160;的图像从定量分析文件夹中移除。选择能够反映定量目标的图像。常见的缺陷包括气泡、组织撕裂、组织重叠以及灰尘或碎屑。
	<ol>
		<li>为选择合适的图像，应确保所有包含脑组织的图像均用于定量分析，以反映全脑范围内的整体表达情况。或者，仅选择反映前脑、中脑或后脑的图像，以揭示这些区域间表达差异。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在计数与测量菜单中，确定图像定量所需的感兴趣参数及其边界条件。
	<ol>
		<li>若需通过平均强度值比较进行ApoE表达的定量分析，应设置阈值范围，使该通道的所有像素均被纳入分析（0至无穷大）。此外，使用可用的绘图工具勾画出感兴趣区域。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对所有文件进行批量处理，或对每张图像单独执行计数与测量。
	<ol>
		<li>进行批量处理时，先记录定量分析的设置与执行过程，然后选择目标文件夹以执行定量分析。批量处理可通过宏管理器选项卡实现，可显著加快工作流程。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将数据表导出至电子表格以便作图。可通过计数与测量结果菜单完成此操作，或在批量处理时自动打开或导出为表格。这些数据表将包含步骤10.2中选定的全部参数。</li>
	<li>进行统计分析与绘图时，可直接使用电子表格软件或其他软件进行数据可视化。熟练掌握所用软件对于准确呈现实验结果至关重要。本示例中，将突变体脑内ApoE表达的绝对强度值相对于对照组进行归一化，随后使用GraphPad Prism进行作图。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

此处，我们介绍一种对冷冻切片进行精确荧光成像的实验方案 黑腹果蝇 头部。这是一种直接的方法，具有多个重要优势：方法简单，任何具备基本实验室安全培训的人员均可操作；可灵活用于检测任何存在高质量抗体的目标蛋白的表达；并且能够精确定量目标蛋白的表达量及其在头部各区域的表达位置。如果组织和图像质量足够高，该方法还可能实现整个头部蛋白表达的三维定位 mapping 果蝇 头部
与技术上较为复杂的脑组织分离后结合共聚焦显微镜成像的方法不同，本方案可实现对整个 Drosophila 头部的成像，而不仅限于脑部。这一点尤为重要，因为果蝇视觉系统是研究神经元功能的重要模型21，但在脑组织分离过程中，部分结构可能丢失。此外，该方法可在同一组织切片中提供内部对照组织，例如喙器肌肉，以判断目标蛋白的表达是否特异性存在于特定细胞类型或组织类型中22。这使得不同组织之间能够进行直接比较，避免了使用不同切片时可能因实验条件微小差异而带来的影响。本方案的另一优势在于...

从社会互动1、感觉信息的感知与处理2、学习3到运动4等复杂行为均由大脑驱动。神经系统疾病也日益普遍，并且预计会随着时间推移而增加5,6。研究大脑在健康与疾病状态下的工作机制至关重要。分子生物学的中心法则指出，生物功能单位最重要的功能之一由蛋白质执行7，而蛋白质的表达量及其表达位置对于理解大脑功能至关重要。
黑腹果蝇，俗称果蝇，是研究衰老及病理生理条件下脑功能的极具价值的模式生物8先进的遗传工具的可获得性 果蝇 使研究人员能够探索几乎任何蛋白质的功能9，几乎每个基因的全面基因文库均可轻松获取10结合其较短的生命周期和较高的繁殖率，这些特征使得 果蝇 脑科学研究的卓越模型11这已带来重大成果，包括绘制出果蝇的完整脑图谱12，甚至因阐明昼夜节律和分子钟的神经机制而为诺贝尔奖的获得作出贡献13,14,15因此， 果蝇 仍然是一个强大而多功能的系统，推动着我们对大脑功能的理解，并为神经系统过程提供了前所未有的洞察。
免疫组织化学和免疫荧光是研究蛋白质表达的基础工具 原位 与只能进行半定量分析且通常在整体组织上进行的蛋白质印迹（Western Blot）等技术相比16，或使用质谱等复杂且昂贵的技术来检测蛋白质水平17，免疫组织化学相对简单，既可定量蛋白质表达水平，也可检测蛋白质在组织或细胞内的定位。重要的是，荧光免疫组织化学还可进行多重检测，以同时测量多种蛋白质，从而鉴定特定细胞类型和组织，或在同一组织样本中回答多个科学问题。此外，通过组织固定可实现不同实验条件、基因型、年龄及昼夜节律时间点之间的比较。然而，荧光免疫组织化学技术具有一定的挑战性，多种因素可能影响成像质量。本优化的冷冻切片与免疫染色方案适用于 果蝇 旨在通过改善组织保存、抗体渗透以及神经元群和蛋白质标志物的可视化，来提升高分辨率成像效果。该方法针对传统技术中存在的复杂解剖过程、组织损伤以及全脑样本成像分辨率受限等问题而开发18该方案结合冷冻切片与荧光染色技术，以确保在多个z平面中保持结构完整性并实现清晰成像。与整体封片制备相比，该方法可最大限度减少形变，促进抗体更深层渗透，从而提供清晰的神经解剖学及蛋白质定位分析。18其多功能性可适用于其他组织和模式生物，为神经科学研究提供了一种可靠且高效的工具19,20它可以被用于研究几乎任何蛋白质，并可应用于各种条件、疾病或模型的研究。

<table><tbody><tr><td>1000 µL 移液器</td><td>Eppendorf</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>1000 µL 移液器吸头</td><td>Olympus Plastics</td><td>23-165R</td><td></td></tr><tr><td>10X 磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Fisher</td><td>J62036.K7</td><td>pH=7.4</td></tr><tr><td>200 证明乙醇</td><td>Decon Laboratories</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>20X Tris 缓冲盐水</td><td>Thermo Scientific</td><td>J60877.K2</td><td>pH=7.4</td></tr><tr><td>AF750 山羊抗小鼠二抗</td><td>Alexa Fluor</td><td>A21037</td><td></td></tr><tr><td>防卷曲玻璃片</td><td>IMEB</td><td>AR-14047742497</td><td></td></tr><tr><td>ApoE 小鼠一抗</td><td>Santa Cruz</td><td>SC13521</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Fisher</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 离心管</td><td>Fisher</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>带电载玻片</td><td>Globe Scientific</td><td>1415-15</td><td></td></tr><tr><td>冷冻切片模具</td><td>Fisher</td><td>2363553</td><td></td></tr><tr><td>冷冻切片机</td><td>Leica</td><td>CM 3050 S</td><td></td></tr><tr><td>冷冻切片机刀片</td><td>C.L. Sturkey</td><td>DT554N50</td><td></td></tr><tr><td>蒸馏水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>干冰</td><td>???</td><td>???</td><td></td></tr><tr><td>精细镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>果蝇操作垫</td><td>Tritech Research</td><td>MINJ-DROS-FP</td><td></td></tr><tr><td>含 DAPI 的硬化封片介质</td><td>Vectashield</td><td>H-1800</td><td></td></tr><tr><td>吸水纸（Kimwipes）</td><td>Kimtech</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Olympus</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>Nile Red&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>N3013</td><td></td></tr><tr><td>最佳切割温度包埋剂（OCT）</td><td>Fisher</td><td>4585</td><td></td></tr><tr><td>旋转摇床</td><td>OHAUS</td><td>SHLD0415DG</td><td></td></tr><tr><td>20% 多聚甲醛</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15713</td><td></td></tr><tr><td>剃须刀片</td><td>Gravey</td><td>#40475</td><td></td></tr><tr><td>弹簧剪</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-10</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Fisher</td><td>S5-500</td><td></td></tr></tbody></table>

直接冷冻切片 果蝇 用于增强脑组织荧光染色与免疫染色的头部装置

Direct Cryosectioning of Drosophila Heads for Enhanced Brain Fluorescence Staining and Immunostaining

对黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）大脑进行免疫染色，对于研究复杂行为、神经回路及蛋白质表达模式背后的机制至关重要。传统方法常面临诸多挑战，例如复杂的解剖操作、组织完整性的维持，以及在高分辨率成像过程中特异性表达模式的可视化。本文介绍一种优化后的实验方案，结合了冷冻切片、荧光染色与免疫染色技术。该方法可改善组织保存效果和信号清晰度，减少果蝇大脑成像过程中繁琐的解剖步骤。本方法包括快速解剖、最佳固定、冷冻保护及冷冻切片，随后进行荧光染色和免疫染色。该方案显著降低了组织损伤，增强了抗体渗透性，并获得清晰、轮廓分明的图像。我们通过高保真地可视化特定神经元群体和突触蛋白，验证了该方法的有效性。这一多功能方法可实现对成年果蝇大脑中多种蛋白质标记物在多个z平面的分析，并可适用于其他组织和模式生物。本方案为开展高质量果蝇神经生物学研究中的免疫组织化学实验提供了可靠且高效的工具。该方法的精细可视化能力有助于对神经解剖学、病理学及蛋白质定位进行系统性分析，因而在神经科学研究中具有重要价值。

上述方法可实现对成年果蝇大脑进行可靠且无需繁琐解剖的荧光成像。如图1所示，该方法操作简便，只要所有样本、仪器和材料准备就绪，即可快速完成。此外，在OCT包埋模具阶段可将样本储存于-80 °C，数周后仍可使用。研究人员无需经过长期培训即可掌握这一简单的解剖与包埋技术，因此该方法具有很高的可及性。
使用该方法进行荧光显微镜观察的示例如图2A-D所示。抗体标签（ApoE）和荧光染料（尼罗红）的表达均清晰明确。此外，也可观察到脑组织具有较高的完整性。可进一步利用常见的图像处理软件功能（如去卷积）来提高图像清晰度，该效果也在图2A'-D'中展示。去卷积有助于提高图像的锐度和对比度，并降低噪声。
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本研究介绍了一种简化的组织处理流程，包括断头、固定、冷冻切片、荧光染色、免疫染色和成像，该方法可进一步扩展至共聚焦和多光子成像。该技术具有与复杂解剖方法相当的效率，且无需依赖高超的手术操作技能。定量图像分析为其提供了广泛的研究潜力。

免疫染色黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）大脑对于研究复杂行为、神经回路及蛋白质表达背后的机制至关重要……

我们的团队利用果蝇模型研究代谢、心脏、肌肉、睡眠及衰老相关疾病。本 JoVE 论文详细介绍了脑组织处理的简化流程，包括断头、固定、冷冻切片、染色和成像。我的研究团队率先开发了果蝇模型，用于研究多种人类疾病及衰老过程。我们还研究了限时进食和运动等干预措施。我们采用机器学习、组学和分子生物学方法，研究昼夜节律和遗传因素等，以揭示它们对细胞完整性、生理功能和行为的影响。这一简化的黑腹果蝇（Drosophila）脑研究方案避免了复杂的解剖操作，仅需单手即可完成，且无需昂贵的共聚焦显微镜，从而提高了可及性并降低了对仪器设备的依赖。首先，从老化培养瓶中取出果蝇，然后打开二氧化碳垫的阀门，迅速将果蝇倾倒至垫上，以防止其逃逸。待果蝇基本失去意识后，将二氧化碳垫移至SZ61显微镜物镜下方，使果蝇位于显微镜视野中。调节放大倍数和焦距，直至果蝇清晰可见且便于进行头部切除操作。 使用弹簧剪，在果蝇的胸部与头部之间放置刀片，用力挤压以去除实验组每组5至10个果蝇的头部。将已使用过的果蝇放回其老化培养管中。用毛笔轻轻将去头的果蝇头部转移至置于冰上的、已标记的1.5毫升离心管中。从冰上取出离心管后，用移液器向每根管中加入100微升4%多聚甲醛和PBS溶液，确保所有果蝇头部完全浸没。如果头部附着在管壁上，可用毛刷轻轻将其推入液面下，或轻敲离心管底部使其接触溶液。随后将离心管置于摇床，中速振荡孵育15分钟。弃去多聚甲醛溶液，更换为 PBS，确保所有果蝇头部均浸没于液体中。最后一次洗涤后，将果蝇头部转移至含 10% 蔗糖的 PBS 溶液中，确保其完全浸没于离心管内。取已标记的模具，加入适量的最佳切割温度包埋剂（OCT 化合物），填充至模具约 50% 的容量，并使其均匀扩散至模具的四个角落。使用刷子将收集的固定果蝇头部小心地放置于模具内OCT包埋剂的表面。用镊子尖端轻轻将每个头部推至模具底部，确保眼睛朝下，以便沿冠状面进行切片。在X、Y和Z三个维度上仔细排列所有头部，以保证所有切片能同时包含全部实验组。正确对齐头部后，小心地将模具直接放入设定为零下20摄氏度的冷冻机中进行冷冻。当模具中的样品大部分已冻结后，用OCT包埋剂填充剩余空间。对于模具的冷冻切片，需在模具顶部涂抹足量的OCT包埋剂，以便将夹头部件固定到模具上。将切片置于冷冻台上表面，放入冷冻切片机中完全冻结，通常需要五分钟。随后将切片及OCT包埋块从模具中取出。将包埋块放入持样器中，确保其上下方向正确，然后拧紧持样器钥匙，直至包埋块牢固固定。使用调节旋钮和卡盘深度控制装置，将样品块与刀片对齐。将冷冻切片机的切片厚度设置为 20 微米，以缓慢且均匀的动作进行切片，同时利用防卷板玻璃收集每一片切片。然后用预热的载玻片收集切片：将载玻片接触切片的近端边缘，使切片缓缓升至载玻片上。将载玻片在室温下干燥，时间至少30分钟，但不超过1小时。取冷冻切片的Drosophila果蝇头部，用剃刀刀片去除载玻片边缘残留的OCT包埋剂，为疏水性边界预留空间。然后使用疏水性标记笔在每张载玻片周围画出边界，并静置干燥5分钟。用 PBS 轻轻地在载玻片上加样，对所有载玻片清洗三次，每次五分钟。清洗后，将 3% BSA 的 Tris 缓冲盐溶液封闭液加到载玻片上，孵育 30 分钟至 1 小时。然后弃去封闭液，加入一抗溶液至载玻片上。将抗体在4°C下孵育过夜，或在室温下孵育一小时，期间使用湿纸巾覆盖以防止干燥。弃去一抗溶液，用PBS缓冲液洗涤载玻片，每次五分钟，共洗涤三次。随后向载玻片加入二抗溶液，并在室温下孵育一小时。用 PBS 清洗载玻片三次后，仅在载玻片上保留少量 PBS。接着，使用 1000 微升移液器，将 3 至 5 滴含 DAPI 的硬化封片剂均匀地滴加在载玻片上。将盖玻片轻轻覆盖在载玻片上，确保放置过程中不产生气泡。小心处理新封片的载玻片，并将其平放保存，直至封片剂完全干燥。若需长期保存，应密封载玻片边缘。应尽快拍摄载玻片图像，以尽量减少荧光衰减。在图像采集过程中，为确保所有实验组之间的一致性，需在相同通道中对每个独特的样本进行对焦。针对每个通道校准曝光，以避免所选所有通道中出现过曝现象。确保所选曝光参数保持恒定，并适用于所有样本，尤其在不同实验组之间。 在Elav+和Elav-ApoE4样本的脑区中，ApoE抗体标签的表达明显富集。尼罗红染色显示了脂质的积累，在两种基因型的脑区中均可见。

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科研

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神经科学

果 蝇 头部的直接冷冻切片，用于增强脑荧光染色和免疫染色

本视频展示了对转基因果蝇大脑进行免疫荧光染色，以实现胶质细胞的单细胞成像。该果蝇大脑在胶质细胞特异性重组酶系统的调控下，表达与不同抗原表位组合融合的膜靶向蛋白。分离并固定的脑组织经针对这些抗原表位的一抗孵育后，再使用荧光染料偶联的二抗进行染色。该标记方法可实现对不同脑区中多种胶质细胞亚群的同时成像。...

果蝇大脑的免疫荧光染色用于胶质细胞的单细胞成像

免疫染色是一种用于可视化组织内特定细胞类型和蛋白质的有效技术。通过利用超声处理，本文所述的方案消除了在对晚期胚胎和幼虫进行免疫染色前解剖黑腹果蝇（Drosophila...

超声处理辅助的晚期胚胎与幼虫免疫荧光染色 黑腹果蝇 组织 原位

一种简单的单步解剖方案用于成年个体整体装片制备 果蝇 大脑

本方案描述了成年个体的解剖与免疫染色方法 黑腹果蝇 脑组织。具体而言，本方案重点介绍了使用 果蝇...

成年黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）大脑中蘑菇体与光感受器神经元的解剖及免疫荧光染色

细胞表现出不同的形态，并与其邻近细胞建立多种相互作用。本方案描述了如何利用成熟的Gal4/UAS表达系统揭示单个细胞的形态，并研究细胞间的相互作用。...

多色 FlpOut 技术在研究胶质细胞高分辨率单细胞形态及细胞间相互作用中的应用 果蝇

我们开发了一种简单且可适应的工作流程，用于从基于荧光成像的细胞生物学研究中提取定量数据，以分析神经退行性 Drosophila...

神经退行性变的定量细胞生物学研究 果蝇 使用 ImageJ 对荧光标记蛋白进行无偏分析

本文介绍了一种用于解剖的手术方法 果蝇...

用于免疫组织化学、Western 印迹分析和 RNA 提取的 Drosophila 蛹期视网膜解剖

扩增辅助迭代荧光原位杂交（EASI-FISH）是一种强大的技术，结合了扩增显微镜与荧光原位杂交（FISH），用于在厚组织中检测多个基因的表达。本方案概述了该方法的最新进展及其在完整Drosophila中枢神经系统标记中的应用。...

完整组织中基因表达的多重检测 果蝇 利用扩增辅助迭代荧光技术研究大脑 原位 杂交

Drosophila 心脏切片与荧光成像方案简化了心脏结构与病理学的研究。该方法包含简单的切片、染色和成像步骤，避免了传统解剖所需的技术专长。此方法提高了可及性，使 Drosophila...

一种新颖且高效的方法 黑腹果蝇 心脏冷冻切片荧光染色

本方案涉及一种非放射性方法 原位...

双荧光 原位 新鲜脑切片中的杂交反应

了解果蝇脑部组织的直接冷冻切片技术，包括断头、固定、切片和荧光染色步骤。该方法简化了复杂解剖操作，无需昂贵设备即可实现高质量成像分析。

直接冷冻切片果蝇用于增强脑组织荧光染色与免疫染色的头部装置

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直接冷冻切片 果蝇 用于增强脑组织荧光染色与免疫染色的头部装置

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