来自单个分子的时间分辨荧光各向异性表征生物分子的局部灵活性

本研究旨在利用共聚焦显微镜模式下的时间分辨荧光各向异性，研究生物分子在单分子水平上的局部柔韧性和动力学。单分子检测和定位已经实现了生物分子的观察，但捕获其动态需要其他方法。时间分辨荧光方法有助于填补这一空白。

用于实验研究生物分子动力学的常用工具，包括单分子品格和核磁共振。在单分子水平上，对光子进行各种分析、处理、光子荧光发射，包括时间分辨分析和突发方差分析。

使用多个荧光团进行 smFRET 实验可能会给实验设计和制备足够高质量的样品带来复杂性。使用单个标记和荧光各向异性可以解决其中一些复杂性。

我们发现，人类 FoxP1 叉头结构域的单体形式表现为无序蛋白质，并在二聚化时增加其折叠数量。

[导师]首先，通过 0.22 微米孔径过滤器过滤制备的标准缓冲溶液。然后通过木炭过滤器过滤标准缓冲液以获取单分子。对于荧光探针，准备制备的BODIPY Fluorescent Pro的小体积等分试样。为了校准偏振分辨设置，首先，打开平行和垂直的探测器通道并打开蓝色激光器电源。确保激光功率设置为 60 微瓦，并打开时间相关的单光子计数或 TCSPC 软件控制面板。接下来，将一微升 100 纳摩尔罗丹明 110 与 49 微升蒸馏水混合。在显微镜物镜顶部加入一滴浸没液。将盖板玻璃放在显微镜物镜上，并确保水滴位于镜头的中心。将 50 微升稀释的罗丹明 110 溶液添加到盖玻片中心进行校准测量。将图像平面调整为位于溶液内部和玻璃表面上方。使用对焦旋钮，找到第二个明亮的焦点并将其调整到 1 1/2 圈。现在以时间标记时间解析模式打开软件，然后单击“开始”按钮。记录 120 秒的计数率。对于背景测量，将 50 微升蒸馏水添加到盖板玻璃的中心并重复采集。记录光子计数率 300 秒，并将文件保存为 water.ptu。如需额外的背景测量，请在盖板玻璃中心添加 50 微升标准缓冲液。记录 300 秒的光子计数率，并将文件保存为 standard_buffer.ptu。现在启动 Burst Integration Fluorescence Lifetime、BIFL 分析软件，然后从自动窗口中单击“确认设置”。接下来，单击“从文件获取参数”，然后单击“确定”。要选择要分析的测量值，请单击“数据路径数组”，然后选择适当的数据集。现在加载数组的水测量 water.ptu 文件，例如 Green Scatter、Green 背景的 standard_buffer.ptu 文件和 Green thick 的 Rhodamine110.ptu。在“单分子选择参数”下，单击“下一步”，然后单击“调整”以打开一个新的弹出窗口。然后按阈值修改光子间到达时间，并为平均光子间到达时间选择单分子事件时间。现在单击最小数量以设置每个单个分子事件的最小光子数。然后单击返回和确定关闭弹出窗口。单击颜色拟合参数以使用荧光衰减参数调整绿色和其他颜色的初始荧光寿命。通过调整 from 和 to 值来修改、提示和延迟值，然后关闭弹出窗口。最后，按 保存 处理 ASCII 文件并将它们保存在所选文件夹中。将过夜的大肠杆菌 C41 预接种物转移到 500 毫升 LB 培养基中，并以 1：500 的稀释比例预先添加抗生素。在 600 纳米处测量培养物的吸光度以监测培养物生长。当光密度达到0.5-0.7之间时，加入IPTG至终浓度为0.5毫摩尔，诱导蛋白质表达，孵育。当培养物达到1.4至1.6的光密度时，将细菌细胞以3,000g在4摄氏度下离心20分钟。丢弃上清液后，将沉淀储存在零下 20 摄氏度直至使用。接下来，将 50 至 100 微摩尔的 FoxP1 蛋白添加到 DTT 或 TCEP 的十摩尔过量中并孵育。使用色谱柱适配器将 PD-10 脱盐柱放入 50 毫升离心管中进行缓冲液交换。向色谱柱中加入5毫升PBS缓冲液进行平衡，并以1,000g离心两分钟。将 PD-10 色谱柱转移到新鲜的 50 毫升管中，并在色谱柱中加入两毫升 PBS 缓冲液。现在将 500 微升 FoxP1 蛋白加载到色谱柱中。 通过以 1,000 g 离心两分钟洗脱色谱柱以收集纯化的蛋白质。将蛋白质转移到 10 千道尔顿截止分子量超离心过滤器中。在7,500g离心10分钟后，收集浓洗脱液。测量蛋白质浓度。然后加入 BODIPY 并在旋转器上在 4 摄氏度下孵育两个小时。重复缓冲液交换和蛋白质浓度。确定蛋白质浓度后，使用公式测量标记程度。将 495 微升超纯水和 5 微升吐温 20 加入腔室载玻片的孔中，并充分混合。在室温下孵育 30 分钟后，用超纯水轻轻清洗腔室两次并干燥。要校正背景荧光，请对缓冲溶液进行测量。通过从快速旋转的染料中获取数据来校准平行和垂直检测器的相对灵敏度对于单体 FoxP1 的单分子荧光各向异性实验，在腔室载玻片中将 100 皮摩尔 BODIPY 标记的 FoxP1 和 100 纳摩尔未标记的 FoxP1 添加到 500 微升标准缓冲液中。开始测量，并在 BIFL 软件中检查 30 秒内记录的突发次数在 60 到 90 之间。如果样品浓度更高，请将其稀释，直到爆发计数落在此范围内。最后，分析测量结果。单分子荧光各向异性寿命分析揭示了源自 FoxP1 DNA 结合结构域中两个不同旋转相关时间的单一分布，表明有序和无序结构集合并存。爆发方差分析确定了 FoxP1 分子的一个子集表现出高各向异性和过量变异，表明存在动态构象变化。光子分布分析区分了单体和二聚体 FoxP1 状态，显示出不同的各向异性分布和汇率。二聚化影响了 FoxP1 的局部和全局运动，超方差测量表明特定半胱氨酸标记位点的各向异性变化显着。动态各向异性分析表明，FoxP1在二聚化和DNA结合时发生部分展开，改变了结构化和无序群体的比例。