从全血中分离与鉴定低密度和正常密度中性粒细胞

我们的研究旨在了解中性粒细胞亚群的作用，以及它们如何参与狼疮等炎症性疾病的发病机制。从更广泛的意义上讲，我们的工作还揭示了人类生物学中中性粒细胞群体的异质性，以及这种异质性如何随着不同生理状态而发生变化。新兴研究表明，人类的中性粒细胞群体具有异质性。

然而，由于难以在不激活且数量充足的情况下可靠地分离中性粒细胞亚群，中性粒细胞仍常被作为单一细胞群体进行研究。本方案提供了一种非接触式分离及对中性粒细胞亚群进行基本表征的方法，克服了上述问题。尽管相关研究尚有限，但已有研究表明，低密度中性粒细胞等中性粒细胞亚群在妊娠和炎症等生理状态改变的情况下，以及在结核病、自身免疫性疾病和癌症等疾病中均发挥着重要作用。

本方案将有助于对这些细胞在人类健康与疾病中的作用开展可重复且可靠的科学研究。在已建立经过验证的、可靠的低密度中性粒细胞与正常密度中性粒细胞分离方案后，我们目前的研究重点是解答与炎症状态下低密度中性粒细胞相关的基本科学问题。我们尤其关注这些细胞在细胞数量、免疫表型、免疫代谢等方面与正常密度中性粒细胞的差异。

首先，标记四个50毫升的锥形管，分别用于制备100%、81%、70%和55%的等渗工作溶液。向标记为100%的试管中加入27毫升密度梯度介质，再加入3毫升10X PBS。接着，量取各浓度工作溶液所需的等渗100%工作溶液和1X PBS体积，分别加入对应的锥形管中。

使用巴斯德移液管充分混匀以确保均匀性。现在，小心地将 3 毫升等渗 81% 工作液加入到 15 毫升锥形管底部。然后缓慢而轻柔地将 3 毫升等渗 70% 工作液叠加在上层，确保各层不混合。

配制细胞分离缓冲液时，将2%胎牛血清、1毫摩尔EDTA与PBS混合，定容至500毫升。用移液器充分混匀以确保溶液均匀。使用前，将磁珠涡旋振荡30秒，以确保其充分重悬。

每位供体分别取 4 毫升全血，分装至三个独立的 14 毫升圆底试管中。每管加入 200 微升中性粒细胞分离试剂盒溶液和 200 微升磁珠。轻轻吹打混匀，使混合物重悬，然后孵育，以使试剂结合不需要的细胞。

接下来，向每根试管中加入细胞分离缓冲液，使总体积达到12毫升，并充分混匀。将去盖的试管置于磁力架上孵育。然后使用血清学移液管，小心地将每根试管中含有中性粒细胞的澄清细胞悬液转移至新的洁净试管中。

然后将原始离心管从磁铁上取下，再次涡旋振荡磁珠30秒。在重新悬浮和孵育前，向新转移的细胞悬液中加入200 µL磁珠，操作方法如前所示。

将试管去盖后放回磁力架上。室温孵育10分钟后，将含有分离中性粒细胞的澄清细胞悬液转移至新试管中。将从全血中分离得到的中性粒细胞悬液收集至同一个50毫升试管中。

使用细胞分离缓冲液将试管补至总体积为 50 毫升。开启刹车进行离心，弃去上清液，将中性粒细胞沉淀重悬于 1 毫升细胞分离缓冲液中。再次离心悬浮液后，弃去上清液，将中性粒细胞沉淀重悬于 3 毫升 55% 密度梯度介质中。

将含有细胞悬液的3毫升55%密度梯度介质缓慢地铺加到预先制备好的密度梯度管上，注意避免扰动梯度层。以720 G离心30分钟，离心过程中不使用刹车。离心结束后，小心操作离心管，避免扰动各层。

使用移液管小心分离含有低密度和正常密度中性粒细胞的各层，并将其转移至分别标记的15毫升离心管中。为去除残留的密度梯度介质，向每支15毫升离心管中加入PBS至15毫升刻度线处。随后，在室温下以400 ×g离心5分钟，离心时开启刹车。

在进一步实验之前，使用血细胞计数板对每一份样品中的细胞进行计数。总中性粒细胞在密度梯度介质上的分层成功形成了两个明显的条带，其中低密度中性粒细胞形成上层条带，正常密度中性粒细胞形成下层条带。

每毫升中性粒细胞数量超过500万至600万个时，会导致密度梯度介质过载，使细胞条带变得弥散，增加亚型混合的风险。低密度中性粒细胞的平均分离纯度为93.8%，正常密度中性粒细胞的平均分离纯度为96.3%，其他细胞类型的污染极少。