Name: 大鼠直接迷走神经注射方案 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-14T14:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: 学习大鼠直接迷走神经注射方案，实现靶向药物递送以研究自主神经系统疾病。该方法利用玻璃注射器和微量泵精确注入候选药物，为基因替代治疗的临床前研究提供可靠技术基础。

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我们感谢德克萨斯大学西南医学中心动物资源中心设施为大鼠手术空间所做的安排。本工作的经费由以下机构提供给 SJG：美国国立卫生研究院/国家神经疾病与卒中研究所 R01 NS087175 项目、Hannah's Hope Fund 以及 Taysha Gene Therapies。

以下方案根据机构伦理准则以及机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准进行。
1. 实验环境准备
注意：本方案适用于至少2个月大的成年大鼠。较小的动物（包括小鼠和更年轻的大鼠）虽然可行，但不推荐，且操作难度将显著增加。
<ol>
	<li>在迷走神经手术前48小时，提供湿润的颗粒饲料或任何其他软质食物（如兽医康复凝胶）。由于动物在术后可能难以进食，应在手术前向动物引入这些食物，帮助它们熟悉其味道，并激发进食意愿。</li>
	<li>大鼠应在手术前至少1周以及术后1周内单独饲养于笼中（或根据机构指南执行）。这有助于它们适应独居带来的应激，并防止术后被同笼动物抓挠伤口。</li>
</ol>
2. 手术物品和空间的准备
<ol>
	<li>提前列出手术所需的所有物品清单，并仔细检查所有物品是否均已备齐。</li>
	<li>手术前使用适当的灭菌方法对所有物品进行灭菌处理。</li>
	<li>在解剖显微镜下设置无菌手术区域。在显微镜下方放置加热垫，以保持大鼠在手术期间体温。</li>
	<li>将所有手术器械放置在覆盖无菌巾的手术台上。在解剖显微镜下预留足够的手术操作空间。确保显微镜焦距处于最佳状态，能够完整观察到手术区域及神经结构。</li>
	<li>将注射泵放置在靠近手术台的位置，确保输液管长度足以到达注射部位。</li>
	<li>将手术器械放置在术者惯用手的一侧。</li>
</ol>
3. 准备候选药物与示踪染料的混合物
<ol>
	<li>确保将候选药物用推荐的稀释液稀释至所需浓度，使得5 µL药物与染料的混合物中含有需递送的准确剂量的候选药物。通过直接迷走神经注射法推荐的最大注射体积为5 µL（包含示踪染料，见步骤3.2）。</li>
	<li>将一种相容性染料与候选药物混合，以实现实时追踪注射准确性的目的。例如，1% 焦油紫（Luxol Fast Blue）或0.002% 荧光素（fluorescein）的终浓度均为适用的相容性染料。 
	注意：在染料与候选药物的混合物中，应使用染料的最佳浓度。若混合物中染料浓度过低，则可能无法观察到注射过程的追踪信号；若染料浓度过高，则可能导致混合物过于浓稠、黏度升高，从而堵塞注射针头。</li>
</ol>
4. 将候选药物和染料混合物装入管路
<ol>
	<li>将一支100 µL玻璃注射器（去除推杆）连接至27 G针头。</li>
	<li>将约45 cm长的无菌聚乙烯管的一端连接至27 G针头。</li>
	<li>取一支3 mL塑料注射器，安装27 G针头，并吸入约0.5 mL的0.9%生理盐水。</li>
	<li>从聚乙烯管的开口端用0.9%生理盐水充满整段管路及玻璃注射器的整个筒身，直至液体溢出。 
	注意：必须避免气泡滞留在管路内。</li>
	<li>取下并丢弃3 mL注射器及针头。</li>
	<li>将玻璃注射器的推杆插入筒身，并轻轻向前推至筒身中部位置。</li>
	<li>将玻璃注射器安装到注射泵中。</li>
	<li>使用注射泵轻微回拉推杆，在管路开口端形成约1.5 cm长的气隙。</li>
	<li>用10 µL微量移液器吸取至少5 µL染料与候选药物的混合液，滴加到一片无菌的Parafilm膜上。</li>
	<li>通过注射泵回拉推杆，将候选药物混合液吸入管路中。保持生理盐水与注射溶液之间存在气隙，但应避免在注射溶液内部 trapped 气泡。用记号笔标记管路中注射混合液的液面位置。 
	注意：管路内候选药物-染料混合液与无菌生理盐水之间的气隙至关重要，可防止两种溶液混合。</li>
	<li>将35 G针头与管路连接。用胶带将针头固定在手术台的洁净表面上，确保针头稳固、不晃动、不接触其他物体，并保持无菌状态。</li>
</ol>
5. 注射针头的预处理
<ol>
	<li>将注射泵程序设置为以 0.5 µL/min 的速度输注。</li>
	<li>启动注射泵约 10–15 秒，直至注射液开始从针尖流出。若针尖处出现微量液体，且导管与注射针连接处（或注射器、导管、针头的任何其他部位）无泄漏，表明装置正确无误。 
	注意：若未观察到针尖处有微小液滴，表明针头可能堵塞。针头堵塞可能由候选药物与染料混合物的高黏度、系统内残留过多空气，或玻璃注射器未正确安装于注射泵中所致。参见 图 1 中针头与导管连接处泄漏的示例。预灌注至关重要，因其有助于确认针头是否通畅，并确保向神经内注射时液体能够顺利通过。</li>
</ol>
6. 大鼠手术前准备
<ol>
	<li>获取大鼠的体重，以计算所需镇痛剂的剂量。例如，大鼠皮下注射卡洛芬的剂量为 5 mg/kg。 
	注意：卡洛芬建议在注射前于 4 °C 保存。</li>
	<li>使用异氟烷蒸发器对大鼠进行麻醉，诱导麻醉时气流速率为 3%–4%，持续约 2–3 分钟。维持麻醉时将异氟烷气流速率降低至约 1.75%–2%。</li>
	<li>将大鼠转移至配备脱毛和术区准备装置的独立操作台，确保该操作台靠近手术区域。</li>
	<li>在大鼠双眼涂抹人工泪膏，以防止眼睛过度干燥。</li>
	<li>根据批准的机构动物实验方案，在大鼠恢复意识时给予镇痛剂以控制疼痛。</li>
	<li>使用毛发剪刀剃除颈部腹侧颈椎区域的毛发，从下颌至胸骨，沿中线两侧各剃除约 2 cm 垂直距离范围内的毛发。</li>
	<li>使用 70% 乙醇和 10% 聚维酮碘对术区进行消毒，交替使用酒精棉片和聚维酮碘棉片擦拭术区三次，擦拭时应从术区中心向外呈环形擦拭。</li>
	<li>将大鼠转移至显微镜下的手术台，保持仰卧位。调节显微镜焦距，以便观察颈椎区域的手术部位。</li>
</ol>
7.&#160;进行大鼠手术，将候选药物直接注射至左侧迷走神经（图2、图3和图4）
注意：本方法的这一部分需要第二人协助外科医生。
<ol>
	<li>将大鼠仰卧置于解剖显微镜下的加热垫上，显微镜配备有固定光源。</li>
	<li>用不可吸收缝线钩住大鼠的上颌前牙，并将缝线的游离端固定在鼻罩内侧，确保在整个麻醉过程中大鼠的鼻孔始终位于鼻罩内部。</li>
	<li>将大鼠摆放在手术者面前，使其头部位于右手手术者左侧（或左手手术者右侧）。在此体位下，手术者的前侧与大鼠身体呈垂直状态。在大鼠颈部下方放置灭菌纱布垫，并调整大鼠颈部区域的角度，使颈部区域伸直。这有助于更清晰地定位左侧迷走神经并进行注射操作。</li>
	<li>用无菌手术巾覆盖大鼠全身，暴露手术区域。</li>
	<li>使用4个带弹性体的磁性固定器分别固定四个牵开器针，并将固定器置于手术台的四个角落。</li>
	<li>在颈部切口处的中线皮内注射局部麻醉剂。例如，通常使用利多卡因和布比卡因的混合物。</li>
	<li>在颈部腹侧的颈区，于下颌与胸骨之间的中线位置，使用手术刀片做一个长约2 cm的纵向皮肤切口（图3A).</li>
	<li>用无菌棉签钝性分离皮肤切口边缘。</li>
	<li>使用拉钩尖端将切口部位的皮肤边缘向相反方向牵开。</li>
	<li>用棉签分离筋膜以深入操作。将唾液腺推向外侧。</li>
	<li>用棉签分离胸锁乳突肌，并用针将其向两侧牵开。随着胸锁乳突肌分离范围扩大，气管在中央显露，表面覆盖有胸骨舌骨肌。图3B). 
	注意：切勿对气管施加压力。</li>
	<li>在大鼠气管左侧继续分离组织，直至暴露颈动脉鞘，鞘内可见左迷走神经与颈总动脉伴行。</li>
	<li>在显微镜下用精细镊子小心地在颈动脉鞘上刺一个小孔，注意避免损伤其下方的颈动脉。用精细镊子将左侧迷走神经与颈总动脉分离。 
	注意：手术区域解剖结构较为关键。颈动脉管壁较厚、光滑，不易受损，但精细镊子的尖端可能损伤血管，导致出血。同时需注意避免损伤神经。</li>
	<li>用镊子将神经与动脉分离后，从该孔处使用连接1 mL注射器的25 G弯针 &#34;钩&#34; 并用非优势手握住神经图 4A). 
	注意：弯曲针的针尖已钝化处理，以避免损伤神经和血管。使用止血钳将针尖弯曲角度定制为约90°。图2).</li>
	<li>用惯用手持取装有候选药物-染料混合物的注射针，沿神经走向轻轻刺入神经，使针尖斜面朝上。
	<ol>
		<li>为便于穿刺，用25 G钩子轻轻牵拉以保持神经平直。将针头插入神经，并在保持与迷走神经平行的同时向前推进超过0.5 cm。然后稍向后退针，使约0.4–0.5 cm的针头保留在神经内。 
		注意：针头的角度应足够浅，以刺入神经内部而不会穿透至对侧。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>有时在预冲时针头在神经外无阻塞，但候选药物-染料混合物在神经内无法顺利通过。为避免这种情况，应限制单根针头对神经的穿刺次数不超过3次。若针头变钝，发生阻塞或其他不良注射的风险将增加。</li>
	<li>确保针头完全位于神经内部。保持位置固定不动，然后打开注射泵。 
	注意：仔细检查注射部位，确保候选药物-染料混合物未从神经处回流。</li>
	<li>注射过程中，持续观察灌注液是否保持在神经内部并顺畅流动。利用灌注管上所做的标记，监测药物-染料混合物从起始点的移动情况。
	<ol>
		<li>如果候选药物-染料混合物流动不顺畅，拔出针头并重复预充步骤（步骤 5.2）。然后将针头重新插入神经，继续输注。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>神经开始呈现出染料的颜色（图4B以0.5 µL/min的速度持续灌注10分钟，以完全注入5 µL的候选药物-染料混合物。 
	注意：建议根据需要使用少量温热的0.9%无菌生理盐水冲洗暴露的组织，以防止过度干燥和损伤。</li>
	<li>在注入5 µL后停止注射泵，将针头保留在原位额外1分钟，以使候选药物-染料混合物充分从注射部位扩散。随后拔出针头。</li>
	<li>移除25 G弯针。使用无菌棉签轻轻将组织复位至原始位置。取出牵开器头端。</li>
	<li>使用不可吸收缝线（也可使用可吸收缝线）缝合伤口。必要时可在缝线之间涂抹少量组织胶，以确保伤口完全闭合。</li>
</ol>
大鼠术后护理
<ol>
	<li>在伤口闭合后，皮下注射约 3 mL 0.9% 温热生理盐水。这有助于大鼠立即恢复水分。</li>
	<li>将大鼠置于热源中，直至其从麻醉状态完全恢复至正常状态。记录恢复过程中观察到的任何异常情况。 
	注意：如果神经注射操作耗时较长，恢复时间可能会更长。</li>
	<li>将大鼠转移至其原有笼子中，笼底放置湿润饲料。确保随时有水供应。术后观察大鼠约 2 小时，以确保其不感到寒冷。 
	注意：如果大鼠感觉寒冷，应将其置于热源中额外数小时。</li>
	<li>术后 12 小时、24 小时、36 小时、48 小时和 72 小时对大鼠进行监测，并记录观察结果。根据批准的机构动物实验方案，按时重复给予镇痛药物以控制疼痛。例如，卡洛芬以 5 mg/kg 的剂量皮下注射，每 24 小时一次，共两次。如果大鼠疼痛持续超过 48 小时，应咨询兽医。</li>
	<li>根据大鼠状况，在术后 24 小时再次皮下注射约 3 mL 0.9% 温热生理盐水。</li>
	<li>持续评估伤口情况，确保伤口干燥并处于愈合过程中。 
	注意：若伤口出现红肿、疼痛，且大鼠表现出活动减少、精神萎靡，可能提示伤口存在炎症，需进一步咨询兽医。疼痛的大鼠常表现为弓背、毛发凌乱、眼睛发红及活动减少，通常蜷缩于笼子角落。</li>
	<li>伤口愈合后两周内拆除不可吸收缝线。</li>
</ol>

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</ol>

作者NR和XC无利益冲突。RMB和SJG是通过迷走神经注射将基因转移至自主神经系统相关知识产权的发明人（美国专利#11,753,655）。SJG和RMB已从Taysha基因治疗公司获得专利使用费收入，且SJG还从Taysha基因治疗公司获得过咨询收入。

直接注射至大鼠左侧迷走神经的方法可安全实施，且术后无并发症。向迷走神经递送药物可用于靶向自主神经系统（ANS）。该方法包含若干关键步骤，需要经过练习并具备中等到较高的外科操作技能。
该手术操作需要在大鼠中实施平衡的全身麻醉。外科医生应尽量缩短手术时间，以减少麻醉剂的暴露，从而促进更好的术后恢复，尤其是在老年大鼠中。该方法还要求手术者具备经过训练的无菌外科技术，以确保注射操作和术后恢复的成功。迷走神经的解剖位置深在且处于关键区域13。左侧迷走神经与左侧颈总动脉并行走行，在分离和注射过程中存在损伤动脉和神经的风险。正确分离迷走神经与颈总动脉需要较高的操作熟练度和技术水平。在操作过程中，应以适当的角度牵拉神经，同时保持针头位于神经内部。
尽管目前仅有同一研究团队发表的两篇关于大鼠5和小鼠6直接迷走神经操作的文献，但这两项研究均缺乏对手术操作过程的详细描述。使用35 G针头注射神经具有操作便捷...

正确应用给药方法是获得成功治疗效果的关键因素之一。尽管向中枢神经系统（CNS）递送治疗剂的方法众多，但通过直接神经注射将药物递送至周围神经系统（PNS）的方法报道较少。直接神经注射，例如向大鼠背根神经节（DRG）注射，已在临床前研究中被尝试用于更深入地理解疼痛机制、药物毒性、基因转移1,2,3以及通用方法的开发1,4。其他关于直接神经注射的报道包括脊神经注射4、坐骨神经注射1，以及在大鼠5和小鼠6中的迷走神经注射。最近，有研究提出了一种软骨上注射方法，以改善治疗药物在兔视神经乳头中的分布7。
由于背根神经节（DRG）中的细胞体具有感觉功能，因此DRG被认为是直接注射携带转基因的载体（如腺相关病毒（AAV））的理想部位2。已有研究描述了DRG注射的手术和非手术方法1,8。然而，关于非手术DRG注射方法结果的一致性，目前存在争议1。有研究提出，采用部分椎板切除术的手术方法在大鼠中进行DRG注射可达到100%的成功率，且不会引起行为学结果的改变3，而在小鼠中则可采用部分骨切除的方法9。多项研究报道了用于药物递送的DRG注射方法，这些方法已应用于大鼠和小鼠的临床前基因治疗研究1,2,10。涉及局部注射的载体介导基因治疗研究可能具有以下优势：降低脱靶表达、减少系统性毒性、所需病毒载量和注射体积更小，以及降低免疫原性并发症的风险11,12。
通过暴露大鼠大腿中部水平的右侧坐骨神经，已尝试将物质直接注射至坐骨神经（人体最长的神经）。该方法采用经拉制的玻璃移液管，并配备由微处理器控制的注射系统，以1.2 µL/min的流速向神经内注射总量为10 µL的染料1。该实验结果显示，染料未能有效分布至背根神经节（DRG）水平，其分布范围主要局限于注射部位周围。类似地，其他直接神经注射方法（如脊神经注射）也已尝试使用染料，以评估在大鼠体内合适的注射体积及染料分布模式。研究表明，脊神经注射的最优体积为2 µL，而通过DRG注射3 µL染料可在大鼠的背侧和腹侧根神经节中均观察到染料分布1。在小鼠中，DRG注射的最优体积根据品系和体型不同，报道范围为1.0 µL至1.5 µL2,9。
在大鼠5和小鼠6中采用直接迷走神经注射方法，以评估神经损伤或细胞完整性在人源α-突触核蛋白传递中的作用。这两项由同一研究团队开展的研究，描述了一种简要的将AAV载体直接注射至颈部左侧迷走神经的方法。在大鼠实验中，使用尖端直径为60 µm的玻璃毛细管，通过5 µL Hamilton注射器以0.5 µL/min的流速注射2 µL载体。在小鼠实验中，使用连接于10 µL NanoFil注射器的36号钝头钢针，以160 nL/min的流速注射总量为750 nL的载体溶液6。这些实验结果显示，转基因在大鼠和小鼠脑桥及中脑的轴突中成功递送并表达。同样，左侧迷走神经的背侧运动核也显示出对转基因的阳性免疫反应。这些证据表明，直接迷走神经注射方法可能是一种可靠的基因治疗手段，可使细胞转导延伸至通过迷走神经发出轴突的多个脑区。然而，这些方法均未提及使用任何示踪染料来评估注射的准确性。
本文介绍了一种使用无毒示踪染料直接注射左侧迷走神经的方法，该方法主要适用于临床前研究阶段的研究人员。文中讨论了可能导致药物递送困难的潜在问题以及克服这些问题的方法，并通过图片展示了递送失败的原因及实现成功递送的操作方式。

<table><tbody><tr><td>1 mL BD&amp;nbsp;结核菌素注射器，带可拆卸 25 G x 5/8&quot; 针头</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>SKU:309626</td><td>用于连接弯针以牵拉迷走神经，并在注射时固定神经。</td></tr><tr><td>0.5% 盐酸布比卡因注射液</td><td>Hospira</td><td>NDC 0409-1162-19</td><td>局部麻醉药，用于局部组织麻醉。</td></tr><tr><td>100 mL 0.9% 氯化钠注射液 USP</td><td>Stericare Solutions</td><td>Item #6240</td><td>生理盐水，用于大鼠及组织的再水化。</td></tr><tr><td>20 个钝头牵开器头，7.5 mm</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>Surgi 5018</td><td>用于手术时分离并固定组织。</td></tr><tr><td>3 mL BD-Luer-Lok 注射器，无菌，一次性使用&amp;nbsp;</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>SKU # 309657</td><td>用于向大鼠注射生理盐水，并将生理盐水注入聚乙烯导管中。</td></tr><tr><td>AK-Fluor10%</td><td>Akorn</td><td>NDC 17478-253-10</td><td>可在神经内显影的荧光素染料，用于追踪注射的准确性。</td></tr><tr><td>动物体重秤</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>SCL 4000</td><td>用于测量大鼠体重。</td></tr><tr><td>Ansell ENCORE Perry Style 42 PF 外科手套</td><td>Ansell</td><td>ASTM D3577</td><td>无菌手套，供外科医生在手术时使用。</td></tr><tr><td>人工泪液软膏 3.5g</td><td>Pivetal</td><td>NDC 46066-753-55</td><td>用于眼部，防止眼睛过度干燥。</td></tr><tr><td>婴儿-迈斯特止血钳&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>13013-14</td><td>用于紧急情况下的止血，也可用于弯曲 25 G x 5/8&quot; 针头。</td></tr><tr><td>BD Intramedic PE 导管</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>14-170-12A</td><td>用于注射装置系统，连接 Hamilton 针头和 NanoFil 针头，同时容纳注射混合液。</td></tr><tr><td>BD Precison Glide 针头，25 G x 5/8&quot;</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>REF#305122</td><td>用于向大鼠注射生理盐水，以及制作弯针。</td></tr><tr><td>BD Precison Glide 针头，27 G x &amp;frac12;&quot;</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>REF#301629</td><td>用于将无菌生理盐水注入 BD 皮内导管中。</td></tr><tr><td>Benchmark Accuris &amp;rdquo;NextPette&amp;rdquo; 可调体积移液器微型起始套装，包含 4 支移液器：10/20/200/1000 &amp;mu;L，另附支架</td><td>MilliporeSigma</td><td>BMSP7700S1</td><td>用于移取无菌溶液。</td></tr><tr><td>聚维酮碘 10%（Betadine）&amp;nbsp;</td><td>Honestmed</td><td>67618015017</td><td>用于手术区域的消毒。</td></tr><tr><td>卡洛芬注射液 50 mg/mL</td><td>由 Covtrus 提供 (6451506845)</td><td>SKU 591149</td><td>本实验中，我们使用了由德克萨斯大学西南医学中心动物资源中心提供的稀释卡洛芬，剂量为 5 mg/kg。</td></tr><tr><td>弯针（定制）</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>REF#305122</td><td>使用止血钳将 BD PrecisionGlide 25 G x 5/8&quot; 针头弯曲成 90 度，针尖磨钝。使用前需灭菌。用于钩住迷走神经，并在分离和注射时固定神经。</td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>Motic&amp;nbsp;</td><td>SMZ-171-BLED（带光源双目镜）</td><td>用于迷走神经分离、注射及检查注射渗漏时放大关键解剖区域。</td></tr><tr><td>手术单&amp;nbsp;</td><td>Dynarex</td><td>Reorder#8122</td><td>灭菌后用作手术覆盖布。</td></tr><tr><td>Dukal 棉签，非无菌</td><td>Dukal</td><td>Item 9003</td><td>用于钝性分离组织，使用前需灭菌。</td></tr><tr><td>Dumont #7 精细镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11274-20</td><td>用于将左侧迷走神经从颈总动脉分离。其弯曲设计便于操作。</td></tr><tr><td>Ethicon PDS II 无染色单丝缝线 - 缝线，4/0 18 PDS II CLR MONO PS</td><td>Ethicon</td><td>VA - Z682G</td><td>用于伤口缝合。</td></tr><tr><td>Ethilon 尼龙缝线 黑色单丝</td><td>Ethicon</td><td>1856G</td><td>在使用不可吸收缝线时用于伤口缝合。也可用于钩住大鼠门齿，将鼻部固定于鼻罩内。</td></tr><tr><td>精细镊子 - 镜面抛光</td><td>Fine Science Tools</td><td>11412-11</td><td>用于将迷走神经从颈总动脉分离。此为直头镊子。</td></tr><tr><td>精细剪刀 - 锐利型</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-09</td><td>用于剪切组织。</td></tr><tr><td>Hamilton 清洁液</td><td>Hamilton</td><td>HT18311</td><td>用于使用后清洁 Hamilton 设备。</td></tr><tr><td>Hamilton 针头，27G，小针座 RN 针头，2&amp;rdquo;，PT3，6/包</td><td>Hamilton</td><td>7762-01</td><td>用于连接 BD Intramedic&amp;trade; PE 导管。</td></tr><tr><td>Hamilton 注射器，710RN&amp;nbsp;</td><td>Hamilton</td><td>7638-01</td><td>用于迷走神经注射时容纳药物。</td></tr><tr><td>胰岛素注射器</td><td>EXEL INT, Comfort point</td><td>REF 26027</td><td>用于注射卡洛芬和局部麻醉药。</td></tr><tr><td>利多卡因 2% 注射液</td><td>Covetrus</td><td>Reorder#002468</td><td>用于与布比卡因混合后在切口部位注射。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Luxol 快蓝 MBSN</td><td>Acros Organics</td><td>212170250</td><td>可在神经内显影的染料，用于与药物混合，使注射混合物可见。</td></tr><tr><td>玻璃珠微型灭菌器</td><td>Fine Science Tools</td><td>Item No. 18090-46</td><td>用于大鼠手术过程中间歇性灭菌手术器械。</td></tr><tr><td>NanoFil 针头-NF35BV-2&amp;nbsp;</td><td>World Precision Instrument</td><td>NC9708956</td><td>用于将药物-染料混合物注入迷走神经内。</td></tr><tr><td>Olsen-Hegar 带剪刀的持针器</td><td>Fine Science Tools</td><td>12002-12</td><td>用于伤口缝合。</td></tr><tr><td>Parafilm M 实验室包裹膜，4 英寸 x 125 英尺，每盒 1 卷，共 12 卷</td><td>Honestmed</td><td>PM#996</td><td>用于承载分装的 5 μL 药物-染料混合物，以便准确将混合物装入 BD&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; 皮内导管。&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PDI 酒精消毒棉片</td><td>Honestmed</td><td>NDC 10819-3914-2</td><td>用于手术区域的消毒。</td></tr><tr><td>Premium Care 无菌 VII 型纱布垫，8 层，2&quot; x 2&quot;</td><td>Dukal</td><td>Item C5119</td><td>手术时置于大鼠颈部下方作为垫衬。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Press&amp;rsquo;n Seal 保鲜膜</td><td>Glad</td><td></td><td>用于手术时覆盖大鼠，起到类似手术单的作用。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>大鼠牵开器套装</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>Surgi 5002</td><td>用于保持切口开放，便于将迷走神经从颈动脉分离。</td></tr><tr><td>RightTemp Jr.</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td></td><td>20.3 cm 宽 x 25.4 cm 长（8 英寸宽 x 10 英寸长），用于保持大鼠体温。</td></tr><tr><td>S&amp;T 镊子 - SuperGrip 尖端</td><td>Fine Science Tools</td><td>00632-11</td><td>缝合时用于夹持组织而不造成损伤。</td></tr><tr><td>S&amp;T 缝线打结镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>00272-13</td><td>用于收紧缝线。</td></tr><tr><td>手术刀片 #15</td><td>Fine Science Tools</td><td>10015-00</td><td>用于在颈部腹侧皮肤做切口。</td></tr><tr><td>手术刀柄-#7</td><td>Fine Science Tools</td><td>10007-12</td><td>用于固定手术刀片。</td></tr><tr><td>注射泵</td><td>&amp;nbsp;KD Scientific</td><td>78-81-8052GL</td><td>&amp;nbsp;序列号 D107034，型号 LEGATO-180，为可编程泵，可在程序控制下泵送小体积混合液。</td></tr><tr><td>TipOne 滤芯吸头补充起始系统</td><td>USA Scientific</td><td>Item #1120-3510</td><td>用于移取药物和染料混合物。</td></tr><tr><td>异氟烷蒸发器，漏斗加液型</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>Vetflow 1231</td><td>用于麻醉大鼠。</td></tr><tr><td>Vetbond 组织粘合剂</td><td>3M Science Applied to Life</td><td>ID B00016067</td><td>在缝合不理想时，用于封闭切口处的组织。</td></tr><tr><td>Wahl BravMini+ 专业无线剪毛器套装</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>CL7300-Kit</td><td>用于剪除大鼠毛发。</td></tr></tbody></table>

大鼠迷走神经直接注射操作方案

Direct Vagus Nerve Injection Protocol For Rats

目前存在大量促进药物递送至中枢神经系统的策略与方法。然而，直接向周围神经系统递送药物的研究相对较少，可供研究人员参考的详细方法学文献也较为有限。本文介绍一种以迷走神经为模型神经的周围神经系统药物直接注射技术。该方法可用于治疗自主神经系统疾病，特别是通过靶向左侧迷走神经实现药物干预，且经适当调整后，亦可推广至其他神经的直接注射。本文详述了在麻醉成年大鼠身上、于解剖显微镜下进行显微外科手术操作的全部关键步骤。文中还描述了使用示踪染料以实时监测注射准确性的方法，并提供了成功与失败注射案例的图示。若操作得当，迷走神经直接注射可安全实施，大鼠耐受性良好，且无术后并发症。例如，在术者完成本方法培训后，连续六只大鼠均成功完成注射，无一出现并发症。该直接神经注射方法适用于临床前大鼠研究，可实现包括但不限于基因治疗在内的多种试剂向周围神经的递送。

本研究共使用六只成年大鼠（3只雄性，3只雌性）。其中一只大鼠被多次注射，以展示注射失败的情况，表现为染料在注射部位周围扩散（图5A）。其余所有大鼠均显示注射顺利且神经染色清晰，如图4B和图5B所示。
图1 展示了一种情况：当注射针与导管的连接设置不正确时，染料在针头与导管之间发生泄漏。本实验所用的1%染料并不太黏稠，但由于密封不严，染料无法顺利通过注射针。此类问题在引液过程中很容易被发现（见步骤5.2）。为解决此问题，应检查针头与导管之间的连接是否正确。确保约有3 mm长的针头已插入导管中，并确认导管与针头的尺寸匹配。在纠正错误连接后，应重新进行引液操作，特别是当引入了气泡时（重复步骤5.2）。
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我们介绍一种用于大鼠的直接迷走神经注射方案，可将药物直接递送至神经内部，且不会引起注射后的并发症。该方法适用于涉及自主神经系统调控的临床前神经科学研究。通过必要的修改，该技术也可用于大鼠及其他物种其他神经的直接注射。

目前存在大量用于促进药物向中枢神经系统递送的策略与方法。然而，直接递送药物至中枢神经系统……

我们开展基因替代疗法的临床前研究。我们利用实验动物建立最佳的药物递送方法，以解决自主神经系统和周围神经系统相关的问题。基于载体的基因替代疗法是基因治疗领域中的一项新兴技术。腺相关病毒载体的应用是目前可行的潜在选择之一。AAV9 已被广泛应用于基因治疗研究中，将目的基因递送至中枢神经系统和周围神经系统。目前，研究人员尚缺乏足够的手段将药物直接递送至周围神经系统。某些神经系统疾病涉及周围神经系统或自主神经系统，然而，针对这些情况仍缺乏有效的药物递送方法。该方法展示了一种将药物直接递送至大鼠迷走神经以解决自主神经系统问题的途径，适用于临床前研究。此外，通过必要的修改，该方法还可推广应用于其他物种的外周神经药物递送。Gray实验室将继续开展基于AV介导的临床前基因治疗研究，研究对象包括啮齿类动物和大型动物。此外，我们致力于开发新的方法，以推动基因替代治疗策略的实现。[旁白] 首先，将一支100微升的玻璃注射器（去除推杆）连接至一根27号针头。将一段长约45厘米的无菌聚乙烯导管一端连接到该27号针头上，然后将一支3毫升塑料注射器装上另一根27号针头，并吸取约0.5毫升的0.9%生理盐水。使用该0.9%生理盐水从导管开放端开始灌注，确保整段导管以及玻璃注射器的筒身完全充满，直至生理盐水溢出。完成后，取下并丢弃3毫升注射器及其针头。接着，将推杆插入玻璃注射器筒内，并轻轻向前推至筒身中部，然后将玻璃注射器放入注射泵中。使用注射泵将推杆略微向后拉动，在导管开放端形成一段约1.5厘米长的气隙。用10微升微量移液器吸取至少5微升染料与候选药物的混合液，滴加到一块无菌的Parafilm膜上。借助注射泵将候选药物混合液吸入导管中，并用记号笔标记注射混合液的液面位置。在导管末端安装一根35号针头，并用胶带将其固定在手术台的洁净表面上，确保其位置固定、保持无菌且不接触其他物体。启动注射泵10至15秒，直至注射液开始从针尖渗出。将已麻醉的大鼠转移至备有脱毛和术区准备设备的台面。在大鼠双眼内涂抹人工泪液软膏，以防角膜过度干燥。根据批准的机构动物实验方案，给予镇痛药物，以控制大鼠苏醒后可能出现的疼痛。剃除颈部颈区腹侧的毛发，从下颌至胸骨，沿中线向两侧各延伸约2厘米。用70%乙醇和10%碘伏溶液对剃毛区域进行三次消毒，每次均以同心圆方式由内向外擦拭。将大鼠以仰卧位转移至解剖显微镜下的手术台。确保大鼠身下的加热垫温度适宜，并调节显微镜焦距，以便清晰观察颈部手术区域。用不可吸收缝线钩住大鼠上门齿，将缝线的自由端固定于鼻罩内，以确保在整个麻醉过程中鼻孔始终位于鼻罩内部。将大鼠摆放成头部位于右利手术者左侧的位置。在颈部下方放置一块无菌纱布垫，以使颈区组织对齐并拉直。用无菌手术巾覆盖大鼠身体，仅暴露手术区域。在手术台四个角使用磁性固定器固定四根牵开针。现在，在即将做切口的颈区中线处皮下注射局部麻醉药。使用手术刀片在下颌与胸骨之间的颈区腹侧中线处做一道长约2厘米的纵向皮肤切口。然后用无菌棉签钝性分离切开的皮肤边缘。利用牵开针将分离的皮肤边缘向相反方向牵开。使用棉签进一步钝性分离筋膜层，深入组织，并将唾液腺向侧方推开。接着用棉签分离胸骨舌骨肌，并用牵开针将其向侧方牵开。继续分离气管左侧的组织，直至暴露颈动脉鞘。使用精细镊子在颈动脉鞘上制造一个小孔，注意避免损伤颈动脉，然后小心地将左侧迷走神经从颈总动脉上分离出来。当镊子完成神经与血管的分离后，用连接在1毫升注射器上的25号弯针，以非优势手钩住并固定迷走神经。优势手持装有候选药物-染料混合液的注射器针头。为便于顺利穿刺，用25号钩针轻轻牵拉以保持神经处于拉直状态。将针头刺入神经，并在保持与迷走神经平行的前提下向前推进超过0.5厘米。然后稍向后退针，使约0.4至0.5厘米的针头保留在神经内部。单根针头对神经的穿刺次数不得超过三次。确认针头插入后，保持其位置不动，开启注射泵。密切观察灌注过程，确保液体完全进入神经内并流动顺畅。通过导管上的标记点追踪药物-染料混合物的推进情况。观察神经逐渐呈现染料的颜色。完成注射后，撤出25号弯针，用无菌棉签轻轻将周围组织复位。随后移除牵开针。使用可吸收或不可吸收缝线关闭切口，必要时可在缝线之间涂抹少量组织胶，以确保切口完全闭合。

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Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

大鼠直接迷走神经注射方案

来源：Sanchez, C. A., et al．大鼠慢性植入用外周神经刺激电极的制备．J. Vis.

通过慢性植入的外周神经袖带电极对大鼠进行迷走神经刺激

本视频介绍了在经脊髓直流电刺激下对大鼠运动神经元进行的体内细胞内记录。该方案描述了如何在脊髓阳极或阴极极化前、期间和之后，测量运动神经元的膜特性并记录其节律性放电活动。...

大鼠脊髓运动神经元的经脊髓直流电刺激

来源：Grames, M. S., 等．大鼠腺相关病毒静脉注射方法与技巧及中枢神经系统转导评估．J. Vis. Exp.

在大鼠模型中静脉注射重组腺相关病毒载体

传入性迷走神经信号将来自腹腔和胸腔器官中受体的重要信息传递至中枢神经系统。迷走神经的结状神经节包含多种类型的受体，可调节迷走神经活性。本方案描述了一种将神经化学物质局部注射至结状神经节的方法。...

一种向Sprague-Dawley大鼠结状神经节注射的方法

迷走神经刺激（VNS）已成为一种诱导前脑靶向突触可塑性以调节多种行为的工具。本方案描述了如何实施迷走神经刺激以促进恐惧消退记忆的巩固。...

迷走神经刺激作为诱导与消退学习相关通路可塑性的工具

迷走神经刺激已被证实具有显著降低外周炎症的效果。本文介绍了一种改良的迷走神经刺激方案，可用于进一步研究胆碱能抗炎机制在局限性炎症反应中的作用。...

延长恢复时间并减少脂多糖给药以研究迷走神经刺激在有限炎症反应中的作用机制

本文介绍了一种利用掺入试剂或生物探针中的染料所产生的近红外荧光成像数据来验证大鼠尾静脉注射效果的方法。在注射前后对尾部进行成像，定量分析荧光信号，并据此评估注射质量。...

使用近红外标记试剂验证大鼠尾静脉注射的新最佳实践

本文介绍了一种通过将导管植入大鼠脊柱腰段鞘内空间，向其中枢神经系统递送药物的方法。我们重点阐述反义寡核苷酸的递送，但该方法同样适用于其他治疗方式的给药。...

大鼠中枢神经系统中反义寡核苷酸的鞘内递送

本方案描述了在同时进行经脊髓直流电刺激的条件下，对大鼠腰段运动神经元进行体内细胞内记录的方法。该方法使我们能够在脊髓阳极或阴极极化之前、期间和之后，测量运动神经元的膜特性并记录其节律性放电活动。...

在体条件下对经脊髓直流电刺激期间类型明确的大鼠脊髓运动神经元进行细胞内记录

本方案描述了在大鼠腹部迷走神经上植入电极阵列的外科手术技术，以及利用植入装置进行长期电生理记录和刺激的方法。...

清醒大鼠腹部迷走神经刺激与记录研究的植入手术

本方案描述了一种采用经结膜入路注射大鼠视神经的独特技术。...

经结膜途径向大鼠视神经注射

学习大鼠直接迷走神经注射方案，实现靶向药物递送以研究自主神经系统疾病。该方法利用玻璃注射器和微量泵精确注入候选药物，为基因替代治疗的临床前研究提供可靠技术基础。

大鼠迷走神经直接注射操作方案

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