大鼠迷走神经直接注射操作方案

我们开展基因替代疗法的临床前研究。我们利用实验动物建立最佳的药物递送方法，以解决自主神经系统和周围神经系统相关的问题。基于载体的基因替代疗法是基因治疗领域中的一项新兴技术。腺相关病毒载体的应用是目前可行的潜在选择之一。AAV9 已被广泛应用于基因治疗研究中，将目的基因递送至中枢神经系统和周围神经系统。目前，研究人员尚缺乏足够的手段将药物直接递送至周围神经系统。某些神经系统疾病涉及周围神经系统或自主神经系统，然而，针对这些情况仍缺乏有效的药物递送方法。

该方法展示了一种将药物直接递送至大鼠迷走神经以解决自主神经系统问题的途径，适用于临床前研究。此外，通过必要的修改，该方法还可推广应用于其他物种的外周神经药物递送。Gray实验室将继续开展基于AV介导的临床前基因治疗研究，研究对象包括啮齿类动物和大型动物。此外，我们致力于开发新的方法，以推动基因替代治疗策略的实现。

[旁白] 首先，将一支100微升的玻璃注射器（去除推杆）连接至一根27号针头。将一段长约45厘米的无菌聚乙烯导管一端连接到该27号针头上，然后将一支3毫升塑料注射器装上另一根27号针头，并吸取约0.5毫升的0.9%生理盐水。使用该0.9%生理盐水从导管开放端开始灌注，确保整段导管以及玻璃注射器的筒身完全充满，直至生理盐水溢出。完成后，取下并丢弃3毫升注射器及其针头。接着，将推杆插入玻璃注射器筒内，并轻轻向前推至筒身中部，然后将玻璃注射器放入注射泵中。使用注射泵将推杆略微向后拉动，在导管开放端形成一段约1.5厘米长的气隙。用10微升微量移液器吸取至少5微升染料与候选药物的混合液，滴加到一块无菌的Parafilm膜上。借助注射泵将候选药物混合液吸入导管中，并用记号笔标记注射混合液的液面位置。在导管末端安装一根35号针头，并用胶带将其固定在手术台的洁净表面上，确保其位置固定、保持无菌且不接触其他物体。启动注射泵10至15秒，直至注射液开始从针尖渗出。将已麻醉的大鼠转移至备有脱毛和术区准备设备的台面。在大鼠双眼内涂抹人工泪液软膏，以防角膜过度干燥。根据批准的机构动物实验方案，给予镇痛药物，以控制大鼠苏醒后可能出现的疼痛。剃除颈部颈区腹侧的毛发，从下颌至胸骨，沿中线向两侧各延伸约2厘米。用70%乙醇和10%碘伏溶液对剃毛区域进行三次消毒，每次均以同心圆方式由内向外擦拭。将大鼠以仰卧位转移至解剖显微镜下的手术台。确保大鼠身下的加热垫温度适宜，并调节显微镜焦距，以便清晰观察颈部手术区域。用不可吸收缝线钩住大鼠上门齿，将缝线的自由端固定于鼻罩内，以确保在整个麻醉过程中鼻孔始终位于鼻罩内部。将大鼠摆放成头部位于右利手术者左侧的位置。在颈部下方放置一块无菌纱布垫，以使颈区组织对齐并拉直。用无菌手术巾覆盖大鼠身体，仅暴露手术区域。在手术台四个角使用磁性固定器固定四根牵开针。现在，在即将做切口的颈区中线处皮下注射局部麻醉药。使用手术刀片在下颌与胸骨之间的颈区腹侧中线处做一道长约2厘米的纵向皮肤切口。然后用无菌棉签钝性分离切开的皮肤边缘。利用牵开针将分离的皮肤边缘向相反方向牵开。使用棉签进一步钝性分离筋膜层，深入组织，并将唾液腺向侧方推开。接着用棉签分离胸骨舌骨肌，并用牵开针将其向侧方牵开。继续分离气管左侧的组织，直至暴露颈动脉鞘。使用精细镊子在颈动脉鞘上制造一个小孔，注意避免损伤颈动脉，然后小心地将左侧迷走神经从颈总动脉上分离出来。当镊子完成神经与血管的分离后，用连接在1毫升注射器上的25号弯针，以非优势手钩住并固定迷走神经。优势手持装有候选药物-染料混合液的注射器针头。为便于顺利穿刺，用25号钩针轻轻牵拉以保持神经处于拉直状态。将针头刺入神经，并在保持与迷走神经平行的前提下向前推进超过0.5厘米。然后稍向后退针，使约0.4至0.5厘米的针头保留在神经内部。单根针头对神经的穿刺次数不得超过三次。确认针头插入后，保持其位置不动，开启注射泵。密切观察灌注过程，确保液体完全进入神经内并流动顺畅。通过导管上的标记点追踪药物-染料混合物的推进情况。观察神经逐渐呈现染料的颜色。完成注射后，撤出25号弯针，用无菌棉签轻轻将周围组织复位。随后移除牵开针。使用可吸收或不可吸收缝线关闭切口，必要时可在缝线之间涂抹少量组织胶，以确保切口完全闭合。