Name: 分析脾和心脏巨噬细胞以及骨髓单核细胞中的 离体 代谢通量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-28T14:35:00.000+00:00
Duration: 6 min 26 s
Description: 了解离体代谢通量分析方法，用于研究心肌梗死期间巨噬细胞代谢调控及其对心脏重塑的影响。该技术结合体内遗传学方法与精准细胞提取，可快速分析新鲜分离的活细胞代谢变化。

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我们将会&#160;感谢为本研究提供资助的基金项目&#160;本工作：NIH/NHBLI 166737，NIH R00&#160;HL146888，NIH U54HL169191，NIH/NIGMS&#160;P20GM104357 和 NIH/NIGMS P30GM149404 资助了本研究工作。

以下方法描述了从心肌梗死（MI）后梗死心脏、脾脏和骨髓中提取巨噬细胞并进行离体代谢通量分析的实验方案（图1）。对于MI后的心脏和脾脏，所采用的提取方法相同。所有涉及小鼠的实验方案均经密西西比大学医学中心机构动物照护与使用委员会批准（方案编号 #1371，Mouton）。
1. 从梗死心脏和脾脏中提取巨噬细胞
注意：组织巨噬细胞的提取采用阴性筛选策略，首先去除被Ly6G-微珠标记的中性粒细胞，然后采用阳性筛选策略，利用CD11b-微珠获取巨噬细胞3,4,5,6。进行本方案时，操作应迅速，并始终保持细胞处于低温环境。
<ol>
	<li>根据 AALAC 和机构指南，通过异氟烷过量麻醉后摘除心脏的方式处死小鼠。</li>
	<li>迅速取出心脏和脾脏，并称量组织重量。</li>
	<li>在检测前，将 EDTA（2 mM）和 0.5% 牛血清白蛋白（w/v）溶于磷酸盐缓冲液（PBS）中，配制 PEB 缓冲液。保持低温。</li>
	<li>将心脏置于冷的汉克斯平衡盐溶液（HBSS）中，用无菌手术刀切成小块。</li>
	<li>配制含有 600 U/mL II 型胶原酶和 60 U/mL I 型 DNase 的消化液。将组织与 10 mL 消化液混合于 MACS 细胞解离管中。 
	注意：每份组织需使用 10 mL 消化液，请预先配制足够量（室温使用）。</li>
	<li>按照制造商说明书，使用细胞解离仪孵育组织。此步骤将在 37 °C 下轻柔旋转孵育约 1 小时，以获得单细胞悬液。</li>
	<li>将悬液转移至 15 mL 圆锥形离心管中，在 4 °C 下以 300 × g 离心 10 分钟。</li>
	<li>将沉淀重悬于 1 mL PEB 缓冲液中。为获得单细胞悬液，将悬液通过 30 µm 滤膜过滤。</li>
	<li>为裂解红细胞，加入 10 mL 1× 红细胞裂解液，在 4 °C 避光孵育 5–10 分钟。</li>
	<li>在 4 °C 下以 300 × g 离心 10 分钟。</li>
	<li>将沉淀重悬于 1 mL PEB 缓冲液中，使用血细胞计数板进行细胞计数。</li>
	<li>在 4 °C 下以 300 × g 离心 10 分钟。</li>
	<li>为去除中性粒细胞，按每 107 个细胞加入 90 µL PEB 缓冲液和 10 µL 抗 Ly6G 微珠的比例配制微珠悬液。将细胞沉淀与微珠悬液混合，在 4 °C 避光孵育 10 分钟。</li>
	<li>加入 10 mL PEB 缓冲液洗涤未结合的微珠，在 4 °C 下以 300 × g 离心 10 分钟。</li>
	<li>将磁性分离柱（MS 或 LS 型）安装于磁力架上。加入 0.5–1.0 mL PEB 缓冲液润洗分离柱。 
	注意：对于免疫细胞含量较高的组织（如脾脏），磁性柱容易堵塞而无法流过液体。因此，建议脾脏使用 LS 型分离柱。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于 500 µL PEB 缓冲液中。将细胞悬液加入磁性分离柱，让未标记的细胞（即非中性粒细胞）流穿。用 500 µL PEB 缓冲液洗涤柱子两次。将流穿的未标记细胞（即巨噬细胞及其他细胞）收集至 15 mL 圆锥形离心管中。</li>
	<li>在 4 °C 下以 300 × g 离心 10 分钟。</li>
	<li>按每 107 个细胞加入 90 µL PEB 缓冲液和 10 µL 抗 CD11b 微珠的比例配制微珠悬液。将细胞沉淀与微珠悬液混合，在 4 °C 避光孵育 15 分钟。</li>
	<li>重复步骤 1.13–1.15。</li>
	<li>标记的巨噬细胞将结合在磁性柱上。为收集巨噬细胞，将磁性柱从磁力架上取下，置于新的 15 mL 圆锥形离心管上方。</li>
	<li>向柱中加入 1 mL 添加了 0.1% 胎牛血清（FBS）的 RPMI 培养基。使用推杆将巨噬细胞洗脱至离心管中。使用血细胞计数板对巨噬细胞进行计数。 
	注意：巨噬细胞现已收集至离心管中，可直接用于后续实验。</li>
</ol>
2. 从骨髓中提取单核细胞
注意：从骨髓中提取单核细胞采用阴性选择策略，即通过免疫磁珠标记非单核细胞（包括淋巴细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞、红系细胞和粒细胞（即中性粒细胞））并将其去除。
<ol>
	<li>根据AALAC和机构指南，通过过量异氟烷使小鼠安乐死后摘除心脏。</li>
	<li>将小鼠的腿部去除。在冷的HBSS中，将肌肉从胫骨和股骨上解剖分离，直至骨骼干净。</li>
	<li>小心切除骨骼的两端。使用带有27 G针头的10 mL注射器，用PEB缓冲液将骨髓冲洗至15 mL锥形管中。将悬液在300 × g 4 °C 下离心 10 分钟。</li>
	<li>执行步骤 1.8–1.12。</li>
	<li>每 5 × 10⁶ 个细胞加入 175 µL PEB 缓冲液、25 µL FcR 封闭试剂和 50 µL 单核细胞生物素标记抗体混合物7 的&#160;总细胞数。4 °C避光孵育5分钟。</li>
	<li>加入10 mL PEB缓冲液洗涤，300 × g离心 g 4 °C 下离心 10 分钟。</li>
	<li>收集沉淀，将细胞重悬于500 µL PEB缓冲液和100 µL抗生物素微珠中，4 °C避光孵育10分钟。</li>
	<li>将磁珠柱（LS）置于磁力架上。加入1.0 mL PEB缓冲液润洗柱子。</li>
	<li>立即将细胞悬液加入柱中。用15 mL离心管收集穿流液，其中含有单核细胞。非单核细胞则结合在磁性柱上。</li>
	<li>用1 mL PEB缓冲液洗涤柱子2次。使用血细胞计数板对单核细胞进行计数。</li>
	<li>为准备下一步的单核细胞，以 300 × g 4 °C下离心10分钟。进行通量分析时，将细胞沉淀重悬于1 mL RPMI + 0.1% FBS中。进行流式细胞术时，将细胞保存在预冷的PEB缓冲液中，并继续进行染色操作。</li>
</ol>
3. 代谢通量分析用细胞的制备
<ol>
	<li>水合传感器盒（在检测前一天进行）
	<ol>
		<li>从包装中取出传感器盒。将传感器板（绿色）从孔中取出，并用移液器向每个孔中加入 200 µL 校准液。将传感器板重新放回盒板顶部，使传感器浸没在校准液中。</li>
		<li>将传感器盒放入无 CO2 的加湿培养箱（37 °C）中过夜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>接种细胞
	<ol>
		<li>在 96 孔培养板中，每孔加入 200 µL 培养基接种细胞，孵育至少 1 小时。至少留一个空孔用于背景测量（空白孔中加入相同体积的培养基）。 
		注意：最佳细胞数量应在实验前确定。详见讨论部分中的&#34;故障排除提示&#34;以获取更多细节。</li>
		<li>准备进行检测时，配制代谢通量检测用培养基（即不含葡萄糖、谷氨酰胺、丙酮酸等的基础 RPMI 或 DMEM 培养基）。进行糖酵解应激检测时，确保基础培养基中添加 2 mM 谷氨酰胺。进行线粒体应激检测时，确保基础培养基中添加 2 mM 谷氨酰胺、10 mM 葡萄糖和 1 mM 丙酮酸。</li>
		<li>小心地用新的基础培养基缓慢替换旧培养基（注意不要冲走细胞）。在显微镜下检查细胞，确保细胞仍然存在。</li>
		<li>将细胞板放入无 CO2 的加湿培养箱（37 °C）中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>加载通量板
	<ol>
		<li>从培养箱中取出已水合的传感器盒/通量板。</li>
		<li>根据糖酵解或线粒体应激检测的需要，配制检测化合物。
		<ol>
			<li>糖酵解检测：使用糖酵解基础培养基，分别用 3 mL 溶解葡萄糖，用 270 µL 溶解寡霉素（100 µM），用 3 mL 溶解 2-脱氧葡萄糖，配制储备液。再配制 10 µM 的寡霉素工作液。</li>
			<li>线粒体检测：使用线粒体基础培养基，分别用 630 µL 溶解寡霉素（100 µM），用 720 µL 溶解羰基氰化物-p-三氟甲氧基苯腙（FCCP，100 µM），用 540 µL 溶解鱼藤酮/抗霉素 A（50 µM）。再分别配制寡霉素（0.5–2.5 µM）、FCCP（0.125–2.0 µM）和鱼藤酮/抗霉素 A（0.5 µM）的工作液。 
			注意：我们发现使用 1.5 µM 寡霉素和 2.0 µM FCCP 可获得最佳结果。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>按照以下体积将检测化合物加入各加药孔：A 孔 20 µL，B 孔 22 µL，C 孔 25 µL，D 孔 27 µL。可选：将待测药物或化合物加入 A 孔，将检测化合物加入 B、C 和 D 孔，以评估其对糖酵解或线粒体呼吸的急性影响。若不使用额外药物或化合物，则 D 孔留空。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>运行检测
	<ol>
		<li>打开软件，选择 线粒体应激检测。 
		注意：该程序也可用于糖酵解应激检测，因为会同时测量细胞外酸化率（ECAR）。</li>
		<li>选择将要使用的孔。为扣除背景信号，确保至少有一个孔不含细胞。</li>
		<li>运行程序。将通量板取下盖子后放入仪器中进行校准（约 20 分钟）。</li>
		<li>通量板校准完成后，软件将提示加载细胞板。从培养箱中取出细胞板，取下通量板底部，将细胞板放入仪器托架中，点击“运行”。检测过程约需 2.5 小时完成。</li>
		<li>使用代谢通量分析软件7 或其他选择的分析软件对结果进行分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Ma, Y., Mouton, A. J., Lindsey, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+macrophage+biology+in+the+steady-state+heart%2C+the+aging+heart%2C+and+following+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Cardiac macrophage biology in the steady-state heart, the aging heart, and following myocardial infarction.</a> Transl Res. 191, 15-28 (2018).</li>
<li>Mouton, A. J., Li, X., Hall, M. E., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity%2C+hypertension%2C+and+cardiac+dysfunction%3A+Novel+roles+of+immunometabolism+in+macrophage+activation+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Obesity, hypertension, and cardiac dysfunction: Novel roles of immunometabolism in macrophage activation and inflammation.</a> Circ Res. 126 (6), 789-806 (2020).</li>
<li>Mouton, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimethyl+fumarate+preserves+left+ventricular+infarct+integrity+following+myocardial+infarction+via+modulation+of+cardiac+macrophage+and+fibroblast+oxidative+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Dimethyl fumarate preserves left ventricular infarct integrity following myocardial infarction via modulation of cardiac macrophage and fibroblast oxidative metabolism.</a> J Mol Cell Cardiol. 158, 38-48 (2021).</li>
<li>Mouton, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+changes+in+glucose+metabolism+reflect+polarization+in+resident+and+monocyte-derived+macrophages+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cardiovasc+Med%22%5BJournal%5D)">Temporal changes in glucose metabolism reflect polarization in resident and monocyte-derived macrophages after myocardial infarction.</a> Front Cardiovasc Med. 10, 1136252(2023).</li>
<li>Mouton, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamine+metabolism+improves+left+ventricular+function+but+not+macrophage-mediated+inflammation+following+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Glutamine metabolism improves left ventricular function but not macrophage-mediated inflammation following myocardial infarction.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 327 (3), C571-C586 (2024).</li>
<li>Mouton, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+macrophage+polarization+over+the+myocardial+infarction+time+continuum%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Res+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Mapping macrophage polarization over the myocardial infarction time continuum.</a> Basic Res Cardiol. 113 (4), 26(2018).</li>
<li>XF software. Agilent Seahorse Analytics. , Agilent Technologies, Inc. Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-software/agilent-seahorse-analytics-787485">https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-software/agilent-seahorse-analytics-787485</a> (2025).</li>
<li>Matsuura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+suppresses+glucose+uptake+and+glycolysis+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Diabetes suppresses glucose uptake and glycolysis in macrophages.</a> Circ Res. 130 (5), 779-781 (2022).</li>
<li>Alexander, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bmal1+integrates+mitochondrial+metabolism+and+macrophage+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Bmal1 integrates mitochondrial metabolism and macrophage activation.</a> Elife. 9, e54090(2020).</li>
<li>Wan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-34a+regulates+macrophage-associated+inflammation+and+angiogenesis+in+alcohol-induced+liver+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatol+Commun%22%5BJournal%5D)">miR-34a regulates macrophage-associated inflammation and angiogenesis in alcohol-induced liver injury.</a> Hepatol Commun. 7 (4), e0089(2023).</li>
<li>Nomura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+oxidation+in+macrophage+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fatty acid oxidation in macrophage polarization.</a> Nat Immunol. 17 (3), 216-217 (2016).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycolytic+reprogramming+in+macrophages+and+MSCs+during+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Glycolytic reprogramming in macrophages and MSCs during inflammation.</a> Front Immunol. 14, 1199751(2023).</li>
<li>Desousa, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calculation+of+ATP+production+rates+using+the+Seahorse+XF+Analyzer%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Calculation of ATP production rates using the Seahorse XF Analyzer.</a> EMBO Rep. 24 (10), e56380(2023).</li>
<li>Lewis, A. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+immunometabolic+cardiac+inflammation+imaging+using+hyperpolarized+magnetic+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Noninvasive immunometabolic cardiac inflammation imaging using hyperpolarized magnetic resonance.</a> Circ Res. 122 (8), 1084-1093 (2018).</li>
<li>Walls, J., Romero, M. Assessing T cell bioenergetic poise and spare respiratory capacity using extracellular flux analysis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWalls%2C+J+%22Agilent+Technologies+application+note%22">Agilent Technologies application note</a>. , 5994-4494 (2022).</li>
</ol>

作者声明无任何利益冲突。

本方法详细描述了从骨髓、脾脏和梗死心脏中快速提取巨噬细胞的流程，所提取的细胞可用于后续分析，例如细胞外代谢通量分析。这两种方法的结合是一种强大的工具，能够量化巨噬细胞在不同疾病或损伤状态，或运动等代谢状态下的代谢变化。尽管本方法主要聚焦于骨髓和脾脏来源的巨噬细胞，但也可使用其他巨噬细胞储存库，例如腹腔8。尽管我们并非首个采用该方法的研究团队，但我们希望本文能够提高该方法在各实验室中的应用率，并促进实验操作的标准化。
尽管这些方法获得的数据为深入了解不同巨噬细胞区室的代谢状态提供了宝贵信息，但仍强烈建议结合其他方法来补充代谢通量数据，以更全面地描绘代谢图景。例如，常将代谢通量数据与代谢组学（即细胞内代谢物的定量分析）以及代谢酶的基因/蛋白表达水平和（或）活性测定相结合，从而对巨噬细胞的代谢状态进行系统而全面的评估5,9。在许多情况下，可使用来自同一只动物的细胞进行不同的检测。
<p class="jove_con...

免疫代谢学是一个新兴领域，致力于研究在不同病理状态和损伤条件下，免疫细胞中代谢重编程所发挥的作用。巨噬细胞是先天免疫系统的关键组成部分，在炎症反应、抗感染应答、抗原呈递以及伤口愈合过程中发挥着至关重要的作用1。在不同疾病状态下，巨噬细胞如何在促炎性和抗炎性（M1样和M2样）亚型之间极化，是当前持续且深入研究的课题。近期研究表明，代谢重编程是巨噬细胞极化背后的关键机制。目前的理论范式认为，总体而言，M1样巨噬细胞（通常类似于单核细胞）更多依赖糖酵解来驱动促炎功能，而M2样巨噬细胞则更多依赖线粒体氧化磷酸化来抑制促炎反应并支持抗炎过程2。深入了解在不同疾病状态下巨噬细胞代谢的变化，有助于揭示可能用于靶向代谢通路的潜在治疗策略。
例如，我们的实验室已深入研究了心肌梗死（MI）期间巨噬细胞代谢重编程的作用3,5,4。巨噬细胞在心肌梗死期间的炎症反应和伤口愈合过程中发挥关键作用，因此随着梗死心脏经历重塑并形成替代性瘢痕组织，巨噬细胞会从M1样表型向M2样表型极化。利用本文所述方法，我们已证明这种极化过程伴随着葡萄糖和谷氨酰胺代谢以及线粒体功能的独特变化。本文描述了从心脏巨噬细胞、脾脏巨噬细胞以及骨髓单核细胞中分离细胞的方法，这些方法可与细胞外通量分析相结合，在一天内评估离体（ex vivo）代谢通量。我们希望这些方法能为评估免疫细胞的代谢表型提供一种标准化流程，从而提高不同实验室在研究这一重要课题时的可重复性。

<table><tbody><tr><td>小鼠抗CD11b超纯磁珠</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-126-725</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗Ly6G超纯磁珠</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-120-337</td><td></td></tr><tr><td>II型胶原酶</td><td>Worthington</td><td>NC9522060</td><td></td></tr><tr><td>I型脱氧核糖核酸酶</td><td>MillPore Sigma</td><td>11284932001</td><td></td></tr><tr><td>GentleMACS Octo组织解离仪</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-427</td><td></td></tr><tr><td>GentleMACS C型解离管</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td>MACS细胞解离管&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>汉克平衡盐溶液</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-025-076</td><td></td></tr><tr><td>LS型磁性分离柱</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS多用支架</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>MS型磁性分离柱&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>小鼠骨髓单核细胞分离试剂盒</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-100-629</td><td>包含1 mL单核细胞生物素标记抗体混合物、2 mL抗生物素磁珠、1 mL Fc受体阻断试剂</td></tr><tr><td>OctoMACS磁性分离器</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-108</td><td></td></tr><tr><td>预分离滤器（30 &amp;micro;m）</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>QuadroMACS磁性分离器</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-051</td><td></td></tr><tr><td>红细胞裂解液（10倍浓缩）</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-183</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XFe96细胞能量代谢分析仪</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 FluxPak试剂盒</td><td>Agilent</td><td>103792-100</td><td>18个Pro传感器微孔板、18个Pro细胞培养微孔板、1瓶Seahorse XF校准液</td></tr><tr><td>Seahorse XF糖酵解压力测试试剂盒</td><td>Agilent</td><td>103020-100</td><td>6个一次性包装袋，每个包含葡萄糖、寡霉素和2-脱氧-D-葡萄糖</td></tr><tr><td>Seahorse XF线粒体压力测试试剂盒</td><td>Agilent</td><td>103015-100</td><td>6个一次性包装袋，每个包含寡霉素、FCCP以及鱼藤酮/抗霉素A</td></tr><tr><td>Seahorse XF RPMI培养基，pH 7.4，500 mL</td><td>Agilent</td><td>103576-100</td><td>不含酚红、碳酸氢盐、葡萄糖、丙酮酸或谷氨酰胺</td></tr></tbody></table>

分析 离体 脾脏和心脏巨噬细胞及骨髓单核细胞中的代谢流

Analyzing Ex Vivo Metabolic Flux in Splenic and Cardiac Macrophages and Bone Marrow Monocytes

代谢重编程是单核细胞/巨噬细胞在促炎与抗炎状态之间活化和极化的特征之一。例如，促炎性（即M1样）单核细胞/巨噬细胞更依赖无氧糖酵解，而对线粒体氧化磷酸化的依赖性较低；相比之下，抗炎性（M2样）巨噬细胞则更依赖在线粒体中进行的葡萄糖和脂肪酸氧化。本文详细描述了从体内两个主要的单核细胞/巨噬细胞储存库——脾脏和骨髓，以及心肌梗死后受损组织（如心脏）中分离巨噬细胞的实验方案。
通过使用抗体标记的微珠进行免疫磁珠分选，可分离巨噬细胞或单核细胞，该方法能高效结合细胞且不破坏其表型。分离后的细胞在96孔板中培养，随后利用代谢通量分析仪进行细胞外通量分析。该方法可在少量细胞（少至2–3 × 105 个细胞）中同时测定糖酵解和线粒体氧化磷酸化水平。此方法可在1天内完成，结果可靠且可重复。最终，这些方法有助于加深我们对损伤和疾病过程中免疫与炎症反应所伴随的代谢变化的理解，从而为免疫代谢通路的新型治疗靶点开发提供依据。

从不同组织中获得的典型细胞数量取决于动物的体型、年龄和性别。对于一只成年雄性小鼠（即16周龄，体重约30 g），脾脏可获得3.0–4.0 × 106个巨噬细胞，而骨髓（两根胫骨和两根股骨）通常可获得1.0–1.5 × 106个单核细胞（图2A）。梗死心脏获得的细胞数量通常也较高，具体数量取决于心肌梗死（MI）后的天数4,5,6。在第3天，每颗心脏通常可获得约1.5 × 106个细胞。健康心脏中的巨噬细胞数量极少（0.1–0.2 × 105/心脏）6；因此，若以健康（非梗死）心脏来源的巨噬细胞作为对照，可能需要合并多颗心脏的样本。图2B展示了从分离的巨噬细胞或单核细胞中获得的代表性流式细胞术图谱，显示这...

本文详细描述了从骨髓、脾脏和梗死心脏中提取巨噬细胞的方法，并进一步评估活细胞中代谢通量的实验流程。

代谢重编程是单核细胞/巨噬细胞活化以及在促炎与抗炎状态之间极化的特征之一。例如，……

我们的研究聚焦于心肌梗死期间免疫代谢的作用。我们希望了解免疫细胞代谢的变化如何调控其在心脏损伤和炎症过程中的表型。我们将体内遗传学方法与精确的细胞提取、细胞表型分析、代谢表型分析、转录组学和代谢组学相结合，以更深入地理解巨噬细胞代谢对心脏重塑的影响。本方案使我们能够了解心肌梗死（MI）后巨噬细胞代谢在不同疾病状态（如肥胖或糖尿病）下的变化，以及不同治疗方法对巨噬细胞代谢的影响。该技术可对 freshly extracted live macrophages 进行快速分析，从而避免长期培养。同时，它还允许对同一细胞中的其他表型变化进行同步评估。该方案将有助于我们及其他研究人员进一步理解巨噬细胞在不同炎症或自身免疫状态下的代谢特征。该方案也可经修改后用于研究其他免疫亚型。[旁白] 首先，获取实验小鼠的腿骨，并小心切除骨的两端。使用带有27号针头的10毫升注射器，将骨髓冲洗至含有PEB缓冲液的15毫升锥形管中。在4摄氏度下以300 ×g离心10分钟。制备单细胞悬液并裂解红细胞。然后向总计5×10⁷个细胞中加入PEB缓冲液，随后加入Fc受体阻断试剂和单核细胞生物素抗体混合物。将混合物在4摄氏度避光孵育5分钟。用10毫升PEB缓冲液洗涤细胞，并在4摄氏度下以300 ×g离心10分钟。接下来，收集细胞沉淀，重悬于500微升PEB缓冲液和100微升抗生物素微珠中。在4摄氏度避光孵育10分钟。现在，在支架上准备磁性分离柱，并加入1毫升PEB缓冲液。立即将细胞悬液上样至柱中，收集穿流液（含单核细胞）至15毫升管中。用1毫升PEB缓冲液洗涤柱两次后，使用血细胞计数板对穿流液中的单核细胞进行计数。为下一步实验做准备，将单核细胞在4摄氏度下以300 ×g离心10分钟。进行通量分析时，将细胞沉淀重悬于1毫升含0.1% FBS的RPMI培养基中。将剩余细胞保存在冷的PEB缓冲液中用于流式细胞术，并继续染色操作。在检测前一天，从包装中取出传感器微孔板。将绿色传感器板从孔中取下，向每个孔加入200微升校准液。将传感器板重新放回微孔板上，使传感器浸没在校准液中。将微孔板置于37摄氏度、无二氧化碳的湿润培养箱中过夜。然后将细胞与200微升培养基接种至96孔培养板中，孵育至少1小时。准备用于检测的代谢通量培养基。使用不含葡萄糖、谷氨酰胺或丙酮酸的基础RPMI或DMEM培养基，并根据特定检测需求补充相应成分。小心地用新配制的基础培养基替换孔中的旧培养基，并在显微镜下检查细胞以确认其完整性。将细胞板置于37摄氏度、无二氧化碳的湿润培养箱中。现在从培养箱中取出已水合的传感器微孔板，并准备用于糖酵解或线粒体应激检测的测试化合物。将适量的测试化合物加入微孔板的加样孔中。打开软件并选择“线粒体应激检测”。选择要使用的孔，确保至少有一个孔为空白对照以进行背景测量。运行程序时，将微孔板（不带盖）放入仪器进行校准

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

分析脾和心脏巨噬细胞以及骨髓单核细胞中的 离体 代谢通量

单核细胞是先天免疫的关键调节因子，在外周单核吞噬细胞系统的更新以及炎症发生时发挥重要作用。本文描述了对小鼠颅骨骨髓进行实时成像以研究单核细胞动员机制的实验步骤。...

追踪小鼠骨髓单核细胞 体内

代谢重编程是M1和M2型巨噬细胞极化的特征及先决条件。本文描述了一种用于检测小鼠骨髓来源巨噬细胞糖酵解和线粒体功能基本参数的实验方法。该工具可用于研究特定因素如何影响巨噬细胞的代谢及其表型。...

利用实时细胞外通量分析对极化M1和M2型骨髓源性巨噬细胞进行代谢表征

代谢研究在免疫学领域中的重要性日益凸显。本文介绍了一种优化的方法，用于检测小鼠脾细胞以及T和B淋巴细胞的糖酵解和线粒体呼吸作用。...

一种优化的分析淋巴细胞糖酵解和线粒体呼吸的实验方案

本方案介绍了一种简单高效的方法，用于在稳态或炎症状态下从小鼠心肌中分离、鉴定和定量免疫细胞。该方案结合了酶消化和机械消化，以制备单细胞悬液，并可进一步通过流式细胞术进行分析。...

心脏血管外免疫细胞的分离与鉴定

本文介绍了一种从白血病患者骨髓中分离白血病细胞并分析其代谢状态的实验方案。对原代白血病细胞代谢特征的评估有助于更深入地了解原代细胞的代谢需求，并可能推动实现更加个性化的治疗方案。...

原代白血病细胞代谢特征的评估

造血干细胞祖细胞（HSPCs）在血液形成过程中由于其代谢可塑性，会从静息状态转变为分化状态。本文介绍了一种优化的检测HSPCs线粒体呼吸和糖酵解的方法。...

造血干祖细胞代谢分析

本文介绍的方法总结了利用细胞外通量分析仪实时测定非贴壁小鼠造血干细胞和原始祖细胞（HSPCs）的细胞外酸化率（ECAR）和氧消耗率（OCR），以评估其细胞生物能量学的优化实验方案。...

利用细胞外通量分析仪评估小鼠造血干细胞及原始祖细胞的细胞生物能量代谢

本文介绍了一种简单的小鼠骨髓细胞分离与染色方案，用于表征造血干细胞和祖细胞，以及支持性微环境中的内皮细胞和间充质干细胞。方案中还包括一种富集位于骨内膜区和骨髓中央区域细胞的方法。...

小鼠骨髓造血干细胞与祖细胞及基质微环境细胞的流式细胞术分析

一个 离体 高脂饮食诱导脂肪组织炎症的小鼠模型

Toxoplasma gondii 在活化骨髓来源巨噬细胞及缓殖子条件下包囊壁的形成

了解离体代谢通量分析方法，用于研究心肌梗死期间巨噬细胞代谢调控及其对心脏重塑的影响。该技术结合体内遗传学方法与精准细胞提取，可快速分析新鲜分离的活细胞代谢变化。

分析离体脾脏和心脏巨噬细胞及骨髓单核细胞中的代谢流

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