Name: 使用冷冻切片进行 果蝇 心脏荧光染色的新型高效方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-28T14:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: 了解果蝇心脏荧光染色新方法，通过冷冻切片技术简化复杂解剖流程，提高组织保存与成像分辨率，实现多蛋白检测与心脏病理研究。

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我们感谢Melkani实验室成员在制定本方案过程中提供的宝贵反馈和帮助。本研究工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）授予G.C.M.的资助AG065992和RF1NS133378支持。此外，本工作还得到了阿拉巴马大学伯明翰分校（UAB）启动资金3123226和3123227对G.C.M.的支持。

1. 仪器设备的准备
<ol>
	<li>确保冷冻切片机已开启并设置为 -20 °C。留出足够时间使温度降至该设定值。若设备处于室温状态，冷却至最佳切片温度约需 5 小时。</li>
	<li>开启载玻片加热台或孵育箱，并将其设定为 37 °C。确保载玻片有足够时间升至所需温度。 
	注意：在此阶段，已标记的载玻片可放置于加热台或孵育箱中，并可无限期保存直至开始切片。</li>
	<li>确保干冰已准备就绪可供使用。一旦完成第 5 步，即可从 –80 °C 的储存环境中取出冰块。</li>
</ol>
2. 溶液的配制
<ol>
	<li>配制 50 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）。配制 10 mL 浓度为 10 mM 的乙二醇四乙酸（EGTA）PBS 溶液。配制 4% 多聚甲醛 PBS 溶液，终体积为实验组数乘以 100 µL。</li>
	<li>在水中配制70%乙醇的清洁溶液&#160;喷雾瓶。配制所有荧光染色溶液。 
	注意：本方案将详细说明如何执行简单的&#160;使用简单的荧光染料或染色剂进行染色。在此&#160;在本案例中，我们将描述使用1x鬼笔环肽594&#160;PBS 中 1:250 的比例。荧光染料浓度&#160;将根据试剂和实验的不同而有所变化&#160;目标。应进行初步测试以确定&#160;适当浓度。抗体染色将不会&#160;此处未详述，但应可适用于传统方法&#160;染色方法</li>
</ol>
3. 组织采集
<ol>
	<li>使用 CO2 麻醉垫麻醉 5-10 只果蝇，并在显微镜下（1x-2x 放大倍数）将果蝇置于视野范围内。CO2 调节器连接至 CO2 麻醉垫的压力应维持在 1 至 5 kPa 之间。 
	注意：也可采用其他麻醉方法（例如 FlyNap2），这些方法对实验结果无显著影响。</li>
	<li>使用弹簧剪刀将 5 至 10 只果蝇去头，并剪除翅膀和腿部。剩余部分为胸部和腹部，统称为果蝇躯体。 
	注意：为确保在第 5 步中果蝇躯体能够正确对齐，残留的翅或腿不得妨碍其在模具底部平放。为此，应尽可能贴近胸部将翅和腿完全剪除。</li>
	<li>使用毛刷轻轻将果蝇躯体转移至预冷并已标记的 1.5 mL 离心管中，置于冰上保存，直至所有实验组样本收集完毕。</li>
</ol>
4. 全组织固定
<ol>
	<li>从冰上取出离心管后，向每管中加入 100 µL 10 mM EGTA（pH 8），以松弛腹部内的心脏组织。确保所有样本完全浸没于溶液中，并在轨道摇床上孵育 10 分钟。&#160;可使用台式离心机帮助样本完全沉入溶液中。</li>
	<li>移除并弃去管中的溶液。每管加入 100 µL PBS，置于轨道摇床上清洗组织 10 分钟。孵育结束后移除并弃去 PBS。</li>
	<li>每管中加入 100 µL 含 4% 多聚甲醛的 PBS 溶液。确保所有样本完全浸没于溶液中。</li>
	<li>将样本置于轨道摇床上，以约 100 单位的速度振荡 15 分钟。注意调整速度，避免组织因剧烈振荡而脱离溶液接触。</li>
	<li>孵育结束后，弃去多聚甲醛溶液，更换为 1× PBS 溶液，孵育 10 分钟，确保所有样本均与溶液接触。将离心管重新放回轨道摇床，速度与步骤 4.4 相近，后续每次洗涤均以此条件进行。</li>
	<li>每次弃去前一步溶液后，用 PBS 清洗组织 2 次，每次 10 分钟，共完成 3 次洗涤。</li>
	<li>最后一次洗涤结束后弃去 PBS 溶液，将样本转移至含 10% 蔗糖的 PBS 溶液中，确保样本在管内与溶液充分接触。为达到最佳饱和效果，建议过夜孵育，或孵育足够长时间直至样本沉降至管底。 
	注意：推荐过夜冷冻保护处理；若需当日成像，则应尽可能延长冷冻保护剂渗透时间。</li>
</ol>
5. 模具制备
<ol>
	<li>此时，从储存处取出干冰，并挑选几块放入一个小的金属或塑料托盘中。托盘的尺寸应能使模具插入，并直接放置在一块较大且尽可能平坦的干冰上。</li>
	<li>用标签标明的模具，将其约50%的空间填充为最佳切割温度（OCT）包埋剂。通过缓慢倾倒包埋剂以减少气泡的产生。</li>
	<li>使用刷子，小心地将样本放置在模具内OCT包埋剂的表面。多个实验组在此阶段应明显分开。 
	注意：必须防止刷子携带蔗糖溶液污染OCT包埋剂而导致其稀释。此外，使用刷子将样本压入OCT深层可能产生大量气泡。应避免这些错误，以防后续切片出现问题。</li>
	<li>使用镊子将每个样本的胸腹部背壁轻轻推至模具底部，通常沿底部推进。然后调整样本位置，优先使腹部平整地贴合模具底部。在X、Y和Z三个维度上对齐所有样本，以确保每个切片能同时包含所有样本。</li>
	<li>腹部可能存在弯曲，尤其是雄性样本；应尽可能将其展平。这对于在冠状面获取较长的连续切片至关重要。在此过程中应避免样本被刺破或压碎在模具底部。需系统性地操作，确保每个样本正确对齐。</li>
	<li>当所有样本就位后，将模具底部直接放置在一块干冰上。观察接触干冰数秒后OCT是否开始冻结。持续冷却，直至所有样本均被模具中已冻结的部分完全包裹。</li>
	<li>达到此阶段后，将模具转移至-20 °C环境中，使其整体完全冻结。待第一部分完全冻结后，填充模具剩余空间。随后可将模具用铝箔包裹后储存于-80 °C以备后续使用，或立即进行切片。 
	注意：在-20 °C和-80 °C两个冷冻阶段之间，应避免模具暴露于空气中。否则可能导致层间产生水分。</li>
</ol>
6. 模具的冷冻切片
注意：通常建议在切割实验组模具之前，先制备并切割一个空白模具。这有助于我们在切片组织前立即确认切片机转轮、刀片以及防卷玻璃的正常功能。此外，从较冷储存环境中取出的任何模具，应在冷冻切片机中适应30分钟后再使用。
<ol>
	<li>将OCT充分涂抹于组织块上，然后将夹头钻头置于其顶部并压平，将其固定在模具上。在冷冻切片机中冷冻至完全凝固，通常需要5分钟。</li>
	<li>将钻头和OCT包埋块从模具中取出，放入夹头中，确保包埋块保持从上到下的正确方向。用夹头钥匙拧紧，直至钻头固定牢固。</li>
	<li>使用调节旋钮和夹头深度控制装置，将包埋块与刀片对齐。设定切片厚度为20 µm或更小。 
	注意：切片越薄，可收集的切片数量越多，越有利于实验。每位受试者的前2–6张切片应包含所需的心脏无遮挡区域，该区域取决于包埋方向和切片厚度。在开始切取关键的前2–6张切片前，必须确保夹头方向调整准确。</li>
	<li>以缓慢但稳定的速度进行切片，使每张切片被防卷曲玻璃板捕获。使用预热的载玻片收集切片。切片后，载玻片在室温下干燥至少30分钟，但不得超过1小时，然后进行第一轮洗涤。</li>
</ol>
7. 荧光染色
<ol>
	<li>干燥结束后，立即使用剃刀片去除组织切片周围多余的OCT包埋剂。此步骤需小心操作，避免触碰到组织。若切片需在后续时间点进行染色，则应将其储存于-80 °C。</li>
	<li>使用疏水性标记笔在每张切片上勾画出该边界。此边界的作用是防止洗涤液和染色液从组织区域流失。 
	注意：本方案描述了使用移液法进行染色和洗涤的步骤，也可使用切片桶和支架。只需将移液加样替换为将切片浸入各新鲜溶液中即可。正如我们近期在脑成像研究中所做17，该免疫染色流程同样适用于心脏组织染色。</li>
	<li>使用1000 µL移液器及配套枪头，轻轻将PBS溶液加至切片表面，对所有切片进行3次洗涤，每次5分钟。尽可能避免将液体直接加在组织上。操作时请勿快速喷射溶液，以免导致组织从载玻片表面脱落。</li>
	<li>弃去最后一次洗涤液，用移液器将荧光染色液（1:250，1x Phalloidin）加至组织上。室温避光孵育1小时。</li>
	<li>此后样本对光敏感。所有后续操作均需在避光条件下进行，或用遮光物覆盖切片。弃去荧光染色液，使用1000 µL移液器以PBS洗涤3次，每次5分钟。</li>
</ol>
8. 成像用样品的封片与制备
<ol>
	<li>弃去最后一次洗涤液，使载玻片上保留少量 PBS。使用 1000 µL 移液器将 3–5 滴封片剂滴加到载玻片上，注意避免直接滴在组织上。</li>
	<li>将盖玻片放置于载玻片上，尽量减少气泡产生。为方便操作，可用镊子夹住盖玻片一端，使其一边接触载玻片边缘，再逐渐放下另一侧，直至完全贴合。小心处理新封片的样本，将其平放于 4 °C 环境中至少保存 24 小时 &#160;。</li>
	<li>使用指甲油密封载玻片；若封片剂本身具有固化特性，则无需密封。避免使用含荧光或亮片成分的指甲油。根据所用荧光染料的不同，可立即进行成像，或保存载玻片以备后续成像使用。</li>
</ol>
9. 成像
注意：使用配备10倍、40倍和60倍物镜的奥林巴斯BX63显微镜进行图像采集。同时使用适用于DAPI、Lipid Spot 488和Phalloidin 594的相应滤光片。
<ol>
	<li>成像前检查载玻片，并使用擦镜纸和70%乙醇水溶液清洁。若在封片后立即进行成像，清洁时需格外小心，避免扰动盖玻片。</li>
	<li>根据整个实验中荧光信号最强的样本，为每个通道选择合适的曝光时间。在尽可能获得明亮图像的同时避免信号饱和，并尽量降低背景。使用各通道的实时预览快速检查每个实验组，确保曝光设置恰当。</li>
	<li>对每个样本进行聚焦时，应始终使用相同的通道以保证一致性。随后采集每个样本的图像。用于比较的所有实验组应在同一天完成图像采集，以避免不同组间因荧光衰减差异而影响结果。</li>
	<li>成像后，将载玻片置于避光条件下，于4 °C保存，以便后续重新成像。</li>
</ol>

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<li>Kelso, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flytrap%2C+a+database+documenting+a+GFP+protein%E2%80%90trap+insertion+screen+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nuc+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Flytrap, a database documenting a GFP protein‐trap insertion screen in Drosophila melanogaster.</a> Nuc Acids Res. 32 (suppl_1), D418-D420 (2004).</li>
<li>Dietzl, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+transgenic+RNAi+library+for+conditional+gene+inactivation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila.</a> Nature. 448 (7150), 151-156 (2007).</li>
<li>Mery, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+muscle+LIM+protein%2C+Mlp84B%2C+is+essential+for+cardiac+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">The Drosophila muscle LIM protein, Mlp84B, is essential for cardiac function.</a> J Exp Biol. 211 (1), 15-23 (2008).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

我们开发了一种高效的方法，用于制备可用于荧光或共聚焦成像观察的Drosophila心脏管。在此之前，本文首先讨论了一种常用但耗时且劳动密集的方法，用于获取并监测Drosophila心脏的细胞学完整性。我们创新且高效的方法通过直接冷冻包埋技术，为传统方法提供了简洁高效的替代方案，该方法可保持Drosophila心脏管的结构完整性。在利用显微镜技术观察Drosophila解剖结构时，保持结构完整性至关重要，且必须根据特定组织或器官进行相应调整。以往的方法包括显微解剖，随后进行固定和染色，该过程繁琐且需要特定的专业技能2,13,15。我们近期已报道了针对Drosophila脑组织的固定、包埋及冷冻切片&#160;方法17，然而目前尚无适用于Drosophila心脏染色的类似方案。因此，本方案专门优化用于<...

心血管疾病（CVD）是全球首要死因，每年导致约1790万人死亡，占全球死亡总数近1/3rd 全球所有死亡人数中的比例。 黑腹果蝇 （通常称为果蝇）被广泛用作研究心脏发育、生理学、代谢、衰老及心肌病的遗传、细胞和分子基础的模式生物1,2,3,4,5,6,7,8,9. 果蝇 模型还被用于研究心肌在全身性肥胖调控中的作用10心血管疾病发病和死亡的主要危险因素。 果蝇 基因组测序研究11 揭示了人类基因存在显著的保守性，包括那些与多种器官（如心脏）发育相关的基因。在这些高度保守的基因中，部分基因与心脏功能障碍相关，例如心肌病或离子通道病。3近年来，研究心脏功能的有效技术不断发展，这拓展了该模型的应用范围，可用于探索运动、饮食和衰老等因素引起的心脏生理学长期变化8然而，技术和后勤方面的挑战常常阻碍了该模型系统的应用。使用该系统的一个挑战在于 黑腹果蝇 在心脏研究中，精确地解剖心脏以保留其细胞结构和心肌成分至关重要。
该 果蝇 心脏或背血管由单层心肌细胞构成的管状结构组成，其管壁附有围心细胞，由悬肌支撑，在成体中还伴有腹侧纵行肌细胞层12准确解剖以暴露这些精细结构是一个耗时且费力的过程。目前的标准方法包括技术难度较高的解剖操作和毛细管负压吸引，需要经过高级培训并具备熟练的运动技能。13,14,15,16通常，解剖从以下步骤开始&#160;切开腹壁，以及存在的挑战&#160;迅速熟悉心脏的微细解剖结构及其&#160;脆弱的结构，以及难以接近的背侧位置。&#160;结合传统解剖技术，可实现对心脏结构和功能的精确分析，为研究心血管疾病提供了更先进的工具&#160;在 果蝇13例如，Alayari 等人利用该方法提供了一种荧光标记的实验方案 果蝇 心脏结构，有助于观察心脏的形态与构造。尽管如此，传统的心脏解剖与染色仍面临诸多挑战，包括难以维持组织完整性以及有效进行心脏染色所需的专业培训。
该方法通过采用一种更简单的方案，以冷冻包埋技术取代整个原有流程，为解决这一问题提供了创新性方案 果蝇 胸部和腹部组织的免疫染色及荧光成像。这种易于掌握的方法可确保更快速、更高效&#160;心脏结构的直观可视化，且具有更高的可重复性。此外，我们介绍了一种涉及干冰的简便方法，可确保样本的均匀排列 果蝇 在同一z平面平整腹部角质层，以简化后续的冷冻切片步骤。我们通过免疫荧光和共聚焦显微镜技术，展示了该方案在检测关键心脏标志物、心脏形态及细胞结构组织方面的有效性。该方法操作简便且效率高，特别适用于高通量研究。 果蝇基于的心脏研究。

<table><tbody><tr><td>1000 &amp;micro;L 移液器</td><td>Eppendorf</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>1000 &amp;micro;L 移液器吸头</td><td>Olympus Plastics</td><td>23-165R</td><td></td></tr><tr><td>10X 磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Fisher</td><td>J62036.K7</td><td>ph=7.4</td></tr><tr><td>200 证明乙醇</td><td>Decon Laboratories</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>20X Tris 缓冲盐水</td><td>Thermo Scientific</td><td>J60877.K2</td><td>pH=7.4</td></tr><tr><td>防滚玻璃片</td><td>IMEB</td><td>AR-14047742497</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Fisher</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>离心管 1.5 mL</td><td>Fisher</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>带电载玻片</td><td>Globe Scientific</td><td>1415-15</td><td></td></tr><tr><td>冷冻切片模具</td><td>Fisher</td><td>2363553</td><td></td></tr><tr><td>冷冻切片机</td><td>Leica</td><td>CM 3050 S</td><td></td></tr><tr><td>冷冻切片机刀片</td><td>C.L. Sturkey</td><td>DT554N50</td><td></td></tr><tr><td>干冰</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>精细镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>果蝇操作垫</td><td>Tritech Research</td><td>MINJ-DROS-FP</td><td></td></tr><tr><td>含 DAPI 的硬化封片介质</td><td>Vectashield</td><td>H-1800</td><td></td></tr><tr><td>吸水纸（Kimwipes）</td><td>Kimtech</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Olympus</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>最佳切割温度包埋剂（OCT 化合物）</td><td>Fisher</td><td>4585</td><td></td></tr><tr><td>20% 多聚甲醛</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15713</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin 594</td><td>Abnova</td><td>U0292</td><td></td></tr><tr><td>剃刀刀片</td><td>Gravey</td><td>#40475</td><td></td></tr><tr><td>弹簧剪</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-10</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Fisher</td><td>S5-500</td><td></td></tr></tbody></table>

一种新颖且高效的方法 黑腹果蝇 心脏冷冻切片荧光染色

Novel And Efficient Method for Drosophila Heart Fluorescence Staining with Cryosectioning

Drosophila 心脏模型被广泛用于研究心脏衰老及模拟&#160;人类心脏疾病。然而，在成像前对 Drosophila 心脏进行解剖是一项精细且耗时的过程，需要高级的训练和熟练的操作技能。为应对这些挑战，我们提出了一种创新性方案，利用冷冻切片技术对 Drosophila 心脏组织进行荧光成像。该方案已在成年 Drosophila 心脏成像中得到验证，但也可适用于发育阶段的研究。该方法在保持组织完整性的前提下，显著提高了荧光染色的效率和可及性。本方案在不牺牲成像质量的前提下简化了操作流程，从而降低了对具备高度训练水平和操作技能的技术人员的依赖。具体而言，我们用更简便的组织包埋等方法取代了毛细管负压吸引等复杂技术。该策略使得心脏结构的观察更加简便且具有更高的可重复性。我们通过有效检测关键心脏标志物，并&#160;实现高分辨率的荧光与免疫染色成像，展示了该方案的实用性，揭示了心脏形态及细胞组织的精细结构。该方法为研究 Drosophila 心脏生物学的研究人员提供了一种可靠且易于使用的工具，有助于深入分析心脏发育、功能及疾病模型。

上述方法无需繁琐的解剖步骤，即可利用荧光成像技术对Drosophila心脏进行研究。这是该方法的主要优势，因为传统的心脏解剖方法需要掌握复杂的操作技能。如图1所示，该方法比心脏解剖更易于新研究人员掌握，并且具有更高的实验灵活性。此外，在OCT包埋模具阶段可将样本储存于-80 °C，数周后仍可使用。技术人员无需长时间培训即可学会简单的解剖与包埋技术，因此该方法具有很高的可及性。
使用本方法可在图2中观察到果蝇（Drosophila）心脏的主要结构特征，例如心房（Ostia）、瓣膜、纵向纤维（支持纤维）和环向纤维（收缩纤维）均得以保存。在衰老及病理条件下，心脏核心结构组分的保存至关重要。除心脏收缩结构外，本方法还可用于观察脂肪体（与人类肝脏同源2，见图3）、体壁肌肉（心脏管的两侧）以及腹部其他结构，从而为心脏管提供空间定位参考...

Drosophila 心脏切片与荧光成像方案简化了心脏结构与病理学的研究。该方法包含简单的切片、染色和成像步骤，避免了传统解剖所需的技术专长。此方法提高了可及性，使 Drosophila 成为更广泛适用于整个科学界心脏相关研究的模型。

果蝇心脏模型被广泛用于研究心脏衰老及模拟人类心脏疾病。然而，果蝇心脏的解剖……

我的研究实验室利用果蝇模型研究衰老和代谢紊乱，探索限时进食和运动作为干预代谢、心肌、睡眠及其他衰老相关疾病的方法。结合机器学习与组学技术，并整合生理学、遗传学和营养学策略，通过3D打印装置和机器学习方法优化果蝇检测流程。果蝇心脏的荧光免疫组织化学染色可实现跨基因型和年龄的多蛋白检测，但仍面临复杂解剖操作、组织保存以及特定蛋白表达模式高分辨率成像等挑战。该方案通过改善组织保存、抗体渗透和成像分辨率，实现了对心脏蛋白标志物更佳的可视化观察。本方法解决了传统全心制片法中存在的复杂解剖操作、组织损伤以及分辨率有限等难题。该方案无需复杂的解剖步骤，可单手操作，并避免使用昂贵的共聚焦显微镜，从而提高了果蝇心脏研究的可及性，使高分辨率成像更加可行。首先，使用二氧化碳麻醉垫麻醉5至10只果蝇。在显微镜下以1倍至2倍放大倍数将果蝇置于视野范围内。使用弹簧剪刀将果蝇去头、剪除翅膀并去除腿部。保留胸部和腹部，合称为虫体。用毛刷将虫体轻轻放入预先标记并置于冰上的1.5毫升离心管中，直至所有实验组均收集完毕。从冰上取出离心管后，向每管中加入100 µL pH 8的10毫摩尔乙二醇四乙酸（EGTA）溶液。确保所有组织块完全浸没，将试管置于摇床上振荡10分钟。随后移除并弃去试管中的乙二醇四乙酸溶液。每管加入100 µL磷酸盐缓冲液，洗涤组织10分钟。在洗涤过程中将试管置于摇床上。弃去 PBS 后，用移液器向每根试管中加入 100 µL 含 4% 多聚甲醛的 PBS 溶液。将试管置于摇床上，以 100 单位振荡 15 分钟，确保组织始终与溶液接触。然后，弃去多聚甲醛溶液。最后一次洗涤完成后，将样本转移至含有10%蔗糖的PBS溶液中。确保样本在离心管内与溶液充分接触。从储存处取出干冰，并挑选几块放入一个小的金属或塑料托盘中。选择一个尺寸合适的托盘，使其能够插入模具，并将托盘直接放置在一块大而平坦的干冰上。将已标记的模具填充至50%体积的最佳切割温度包埋剂（OCT compound），缓慢倾倒以尽量减少气泡产生。用刷子小心地将解剖并固定好的果蝇虫体放置于模具内 OCT 化合物的表面。使用镊子将每只虫体推至模具底部，使胸部和腹部的背壁大致沿底部对齐。调整虫体位置，使腹部平贴于模具底部。在 X、Y 和 Z 三个维度上对齐所有样本，以确保每个切片同时包含所有受试对象。校正腹部的曲度，尤其是雄性样本的腹部曲度，尽可能将其压平，但不得刺破或压碎样本。所有受试对象就位后，调整模具位置，使其底部直接置于干冰上。确保OCT包埋剂在接触时开始冻结，并持续操作直至所有样本完全被包埋在模具中。冷冻后，将模具转移至设定为-20°C的冰箱中，使其彻底完全冻结。待样本完全冻结后，用OCT包埋剂填充模具的剩余部分。将切片夹头安装到模具上时，需在组织块上涂抹足量的OCT包埋剂。将夹头平整地压在包埋剂上，并在冷冻切片机中冷冻约五分钟，直至完全凝固。随后将夹头、OCT包埋块从模具中取出。将刀头装入卡盘，确保包埋块从上到下保持正确方向，然后拧紧卡盘钥匙以固定刀头。接着，使用调节旋钮和卡盘深度控制装置，将包埋块与刀片对齐，并将切片厚度设置为20微米或更低。以缓慢但稳定的速度从包埋块上切割每一刀，使防卷玻璃在切片生成时将其捕获。使用预热的载玻片收集切片。用剃刀刀片去除切片周围多余的OCT包埋剂。使用疏水性标记笔勾画每张载玻片的边界，以使洗涤液和染色液局限于组织区域。使用1000微升移液器，用PBS清洗载玻片三次，每次五分钟，避免接触组织。弃去最后一次洗涤液后，将荧光染色液滴加到组织上，室温避光孵育一小时。然后弃去荧光染色液，再用PBS清洗载玻片三次，每次五分钟。随后，弃去最后一次 PBS 洗涤液，仅在载玻片上留下少量溶液。使用 1000 微升移液器，向载玻片上滴加 3 至 5 滴封片介质，注意避免直接滴加到组织上。用镊子夹住盖玻片一侧边缘，逐渐放下另一侧，直至盖玻片与载玻片完全贴合。使用不含荧光或闪粉的指甲油封片。如果封片剂未完全固化，可根据荧光染料的特性立即成像或保存切片以备后续使用。成像前检查切片是否洁净，并用含70%乙醇的水溶液浸湿的擦拭纸轻轻清洁。分析实验中荧光信号最强的样本，以选择每个荧光通道的合适曝光时间。在实时预览模式下对每个实验组的所有通道进行观察，以确认曝光参数设置正确。为保持一致性，使用相同的荧光通道对每个样本进行调焦，并为所有样本采集图像。成像后，将载玻片置于四摄氏度避光保存，以备后续图像重采。该荧光成像方法保留了果蝇心脏的关键结构特征，例如心室开口（ostia）、瓣膜、纵向纤维和环向纤维。整个心脏管状结构及精细的微小结构在不同放大倍数下均被成功捕获，其中10X用于观察整体结构，40X至60X放大则可显示更精细的结构，如环向收缩纤维和纵向稳定纤维。代表性荧光显微图像显示了w1118果蝇心脏结构的保存情况，其中DAPI染色的细胞核、绿色染色的脂质以及用鬼笔环肽染成红色的含肌动蛋白肌原纤维清晰可见。鬼笔环肽染色有效凸显了纵向和环向纤维，表明尽管经历了冷冻和切片处理的压力，肌动蛋白丝结构仍得以保留。脂质斑点染色揭示脂肪储存主要集中在心脏管附近。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

使用冷冻切片进行 果蝇 心脏荧光染色的新型高效方法

本文介绍了一种对幼虫和成虫黑腹果蝇（Drosophila...

荧光标记 黑腹果蝇 心脏结构

我们描述了一种用于晚期Drosophila胚胎的固定、包埋、切片及成像方法，以进行胚胎心脏管的透射电子显微镜观察。该技术可实现对心脏管腔以及衬于管腔内壁的基底膜的可视化观察。...

用于胚胎电子显微镜观察的样本制备 黑腹果蝇 胚胎心脏管

我们描述了一种简化的方法，用于制备特定基因型的黑腹果蝇（Drosophila）胚胎的“去膜”样本。该方法可高效地开展多种遗传筛选实验，同时能够清晰地观察晚期胚胎中的各种结构。...

活体解剖 黑腹果蝇 胚胎：通过抗体染色快速筛选突变体文库的优化方法

明确肌肉损伤的潜在机制至关重要。本文介绍了制备果蝇胸部肌肉石蜡包埋切片和冷冻切片的组织学技术，该方法可用于分析肌肉形态以及肌肉细胞中蛋白质和其他组分的定位。...

石蜡包埋和冷冻切片的Drosophila成体肌肉

此处我们描述一种整体荧光标记方法 原位 杂交（FISH）方案，用于确定果蝇胚胎发育期间表达的RNA的表达与定位特性， 黑腹果蝇.

完整组织 RNA 荧光 原位 杂交检测 Drosophila 胚胎

免疫染色是一种用于可视化组织内特定细胞类型和蛋白质的有效技术。通过利用超声处理，本文所述的方案消除了在对晚期胚胎和幼虫进行免疫染色前解剖黑腹果蝇（Drosophila...

超声处理辅助的晚期胚胎与幼虫免疫荧光染色 黑腹果蝇 组织 原位

我们介绍一种用于对完整胚胎期和出生后心脏内部标记有荧光蛋白的细胞进行三维成像的实验方案。通过结合组织透明化方法与整体染色技术，可清晰、准确地成像胚胎期或出生后心脏内部的单个荧光蛋白标记细胞。...

单细胞分辨率下透明化胚胎及出生后心脏的成像

我们开发了一种简单且可适应的工作流程，用于从基于荧光成像的细胞生物学研究中提取定量数据，以分析神经退行性 Drosophila...

神经退行性变的定量细胞生物学研究 果蝇 使用 ImageJ 对荧光标记蛋白进行无偏分析

在此，我们描述了一种用于检测与定位的实验方案 黑腹果蝇 从收集到预包埋和包埋、免疫染色以及 mRNA 检测的胚胎蛋白与 RNA 原位...

一种用于免疫组织化学与RNA的实验方案 原位 早期分布 果蝇 胚胎

扩增辅助迭代荧光原位杂交（EASI-FISH）是一种强大的技术，结合了扩增显微镜与荧光原位杂交（FISH），用于在厚组织中检测多个基因的表达。本方案概述了该方法的最新进展及其在完整Drosophila中枢神经系统标记中的应用。...

完整组织中基因表达的多重检测 果蝇 利用扩增辅助迭代荧光技术研究大脑 原位 杂交

本研究介绍了一种简化的组织处理流程，包括断头、固定、冷冻切片、荧光染色、免疫染色和成像，该方法可进一步扩展至共聚焦和多光子成像。该技术具有与复杂解剖方法相当的效率，且无需依赖高超的手术操作技能。定量图像分析为其提供了广泛的研究潜力。...

直接冷冻切片 果蝇 用于增强脑组织荧光染色与免疫染色的头部装置

了解果蝇心脏荧光染色新方法，通过冷冻切片技术简化复杂解剖流程，提高组织保存与成像分辨率，实现多蛋白检测与心脏病理研究。

一种新颖且高效的方法黑腹果蝇心脏冷冻切片荧光染色

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