一种新颖且高效的方法 黑腹果蝇 心脏冷冻切片荧光染色

我的研究实验室利用果蝇模型研究衰老和代谢紊乱，探索限时进食和运动作为干预代谢、心肌、睡眠及其他衰老相关疾病的方法。结合机器学习与组学技术，并整合生理学、遗传学和营养学策略，通过3D打印装置和机器学习方法优化果蝇检测流程。果蝇心脏的荧光免疫组织化学染色可实现跨基因型和年龄的多蛋白检测，但仍面临复杂解剖操作、组织保存以及特定蛋白表达模式高分辨率成像等挑战。

该方案通过改善组织保存、抗体渗透和成像分辨率，实现了对心脏蛋白标志物更佳的可视化观察。本方法解决了传统全心制片法中存在的复杂解剖操作、组织损伤以及分辨率有限等难题。该方案无需复杂的解剖步骤，可单手操作，并避免使用昂贵的共聚焦显微镜，从而提高了果蝇心脏研究的可及性，使高分辨率成像更加可行。

首先，使用二氧化碳麻醉垫麻醉5至10只果蝇。在显微镜下以1倍至2倍放大倍数将果蝇置于视野范围内。使用弹簧剪刀将果蝇去头、剪除翅膀并去除腿部。

保留胸部和腹部，合称为虫体。用毛刷将虫体轻轻放入预先标记并置于冰上的1.5毫升离心管中，直至所有实验组均收集完毕。从冰上取出离心管后，向每管中加入100 µL pH 8的10毫摩尔乙二醇四乙酸（EGTA）溶液。

确保所有组织块完全浸没，将试管置于摇床上振荡10分钟。随后移除并弃去试管中的乙二醇四乙酸溶液。每管加入100 µL磷酸盐缓冲液，洗涤组织10分钟。

在洗涤过程中将试管置于摇床上。弃去 PBS 后，用移液器向每根试管中加入 100 µL 含 4% 多聚甲醛的 PBS 溶液。将试管置于摇床上，以 100 单位振荡 15 分钟，确保组织始终与溶液接触。

然后，弃去多聚甲醛溶液。最后一次洗涤完成后，将样本转移至含有10%蔗糖的PBS溶液中。确保样本在离心管内与溶液充分接触。

从储存处取出干冰，并挑选几块放入一个小的金属或塑料托盘中。选择一个尺寸合适的托盘，使其能够插入模具，并将托盘直接放置在一块大而平坦的干冰上。将已标记的模具填充至50%体积的最佳切割温度包埋剂（OCT compound），缓慢倾倒以尽量减少气泡产生。

用刷子小心地将解剖并固定好的果蝇虫体放置于模具内 OCT 化合物的表面。使用镊子将每只虫体推至模具底部，使胸部和腹部的背壁大致沿底部对齐。调整虫体位置，使腹部平贴于模具底部。

在 X、Y 和 Z 三个维度上对齐所有样本，以确保每个切片同时包含所有受试对象。校正腹部的曲度，尤其是雄性样本的腹部曲度，尽可能将其压平，但不得刺破或压碎样本。所有受试对象就位后，调整模具位置，使其底部直接置于干冰上。

确保OCT包埋剂在接触时开始冻结，并持续操作直至所有样本完全被包埋在模具中。冷冻后，将模具转移至设定为-20°C的冰箱中，使其彻底完全冻结。待样本完全冻结后，用OCT包埋剂填充模具的剩余部分。

将切片夹头安装到模具上时，需在组织块上涂抹足量的OCT包埋剂。将夹头平整地压在包埋剂上，并在冷冻切片机中冷冻约五分钟，直至完全凝固。随后将夹头、OCT包埋块从模具中取出。

将刀头装入卡盘，确保包埋块从上到下保持正确方向，然后拧紧卡盘钥匙以固定刀头。接着，使用调节旋钮和卡盘深度控制装置，将包埋块与刀片对齐，并将切片厚度设置为20微米或更低。以缓慢但稳定的速度从包埋块上切割每一刀，使防卷玻璃在切片生成时将其捕获。

使用预热的载玻片收集切片。用剃刀刀片去除切片周围多余的OCT包埋剂。使用疏水性标记笔勾画每张载玻片的边界，以使洗涤液和染色液局限于组织区域。

使用1000微升移液器，用PBS清洗载玻片三次，每次五分钟，避免接触组织。弃去最后一次洗涤液后，将荧光染色液滴加到组织上，室温避光孵育一小时。然后弃去荧光染色液，再用PBS清洗载玻片三次，每次五分钟。

随后，弃去最后一次 PBS 洗涤液，仅在载玻片上留下少量溶液。使用 1000 微升移液器，向载玻片上滴加 3 至 5 滴封片介质，注意避免直接滴加到组织上。用镊子夹住盖玻片一侧边缘，逐渐放下另一侧，直至盖玻片与载玻片完全贴合。

使用不含荧光或闪粉的指甲油封片。如果封片剂未完全固化，可根据荧光染料的特性立即成像或保存切片以备后续使用。成像前检查切片是否洁净，并用含70%乙醇的水溶液浸湿的擦拭纸轻轻清洁。

分析实验中荧光信号最强的样本，以选择每个荧光通道的合适曝光时间。在实时预览模式下对每个实验组的所有通道进行观察，以确认曝光参数设置正确。为保持一致性，使用相同的荧光通道对每个样本进行调焦，并为所有样本采集图像。

成像后，将载玻片置于四摄氏度避光保存，以备后续图像重采。该荧光成像方法保留了果蝇心脏的关键结构特征，例如心室开口（ostia）、瓣膜、纵向纤维和环向纤维。整个心脏管状结构及精细的微小结构在不同放大倍数下均被成功捕获，其中10X用于观察整体结构，40X至60X放大则可显示更精细的结构，如环向收缩纤维和纵向稳定纤维。

代表性荧光显微图像显示了w1118果蝇心脏结构的保存情况，其中DAPI染色的细胞核、绿色染色的脂质以及用鬼笔环肽染成红色的含肌动蛋白肌原纤维清晰可见。鬼笔环肽染色有效凸显了纵向和环向纤维，表明尽管经历了冷冻和切片处理的压力，肌动蛋白丝结构仍得以保留。脂质斑点染色揭示脂肪储存主要集中在心脏管附近。