细胞内感染模型的建立与评估：针对Staphylococcus aureus

我们的研究聚焦于金黄色葡萄球菌感染，旨在建立一种胞内感染模型。该模型将有助于深入理解胞内感染的机制，并为预防和治疗此类感染提供严格的依据。目前金黄色葡萄球菌胞内感染的最新研究进展主要集中于探究其感染机制，以调控细菌在细胞内的存活与扩散，并进一步优化药物设计及结构修饰，从而提高治疗效果。

该研究领域采用细胞培养、新兴的细胞测序技术、高通量筛选技术、基因编辑技术以及其他相关技术，研究细胞内的细菌感染。与传统感染模型相比，我们优化了针对细胞内感染的实验条件。在单独用金黄色葡萄球菌感染细胞后，将感染细菌的细胞接种至小鼠体内，以建立细胞内感染模型。

该方法通过最大限度减少游离细菌的干扰，提高了效率，确保更准确地保留细胞内感染过程。我们的方法将致力于抗体药物的开发，并为进一步预防和治疗细菌感染奠定基础。配制6%淀粉肉汤时，按3:10:5的质量比，依次将牛肉浸膏粉、蛋白胨和氯化钠加入玻璃容器中。

加入100毫升双蒸水，搅拌至各组分溶解。将溶液放入微波炉中加热。然后按质量比6加入可溶性淀粉，搅拌混合物直至完全溶解。

在 121 摄氏度下高压灭菌培养基 30 分钟。灭菌后，将培养基于 4 摄氏度保存，直至形成糊状。为收集小鼠腹腔巨噬细胞，用左手抓住小鼠颈部并控制其尾巴。

然后将小鼠翻转，使其头部朝下，腹部朝上。向小鼠腹腔注射3毫升6%淀粉肉汤。注射72小时后，处死麻醉的小鼠，并用75%乙醇进行消毒。

使用眼科剪剪开小鼠腹部，充分暴露腹膜。通过腹腔注射将 10 毫升 DMEM 注入腹腔。轻轻揉搓腹部一分钟，以冲洗腹腔。

然后，使用注射器将灌洗液收集到一个 50 毫升离心管中。将灌洗液在 300 ×g 条件下离心 5 分钟，弃去上清液。用 10 毫升添加了 10% FBS、青霉素和链霉素的 DMEM 重新悬浮细胞沉淀。

取10微升细胞悬液，加入细胞计数仪中进行细胞计数。用DMEM FBS将细胞稀释至浓度为2 × 10⁶ 个细胞/毫升。每孔加入1毫升细胞悬液，接种于6孔板中。

将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育4小时。孵育结束后，移除上清液。用无菌PBS洗涤细胞两次，每孔加入1毫升DMEM，于相同条件下过夜培养。

将腹腔巨噬细胞与金黄色葡萄球菌 MRSA-252 共同孵育 2 小时。移除上清液，并用 PBS 洗涤细胞两次。每孔加入 1 毫升含 100 微克/毫升庆大霉素的完全 DMEM 培养基，在 37°C、5% CO₂ 条件下孵育 2 小时。

孵育后，用 PBS 洗涤细胞三次。使用细胞刮刀将腹腔巨噬细胞收集到 50 毫升离心管中。以 1000 ×g 离心五分钟。

向感染了胞内 MRSA-252 的巨噬细胞中加入终浓度为 10 微克/毫升的溶菌酶，37°C 孵育 10 分钟。用 PBS 洗涤细胞两次后，将细胞重悬于 1 毫升 PBS 中。随后取出约 20 微升分装样品，加入 0.1% Triton X-100 处理 5 分钟以裂解细胞。

用 PBS 对裂解的细胞悬液进行系列稀释，并将稀释液滴加到胰蛋白胨大豆琼脂平板上。在 37 摄氏度下培养过夜。次日，计数细菌菌落，以计算腹腔巨噬细胞内的 MRSA-252 细菌数量。

将小鼠置于红外线理疗灯下，直至尾静脉扩张。将小鼠随机分为四组。通过尾静脉向小鼠体内静脉注射3 × 10⁶ CFU 浮游态MRSA-252。

24小时后，处死麻醉的小鼠，并用75%乙醇彻底消毒。一手用镊子提起腹部皮肤，另一手用眼科剪剪开皮肤。在腹腔内找到肾脏，并小心将其完全剥离。

将肾脏转移至含有1毫升PBS的研磨管中，研磨至无固体组织残留。将匀浆后的组织倒入离心管中。使用PBS对组织匀浆液进行系列稀释。

将每种稀释液分别点样于不同的三联大豆琼脂平板上，于37摄氏度培养过夜。次日计数细菌菌落并分析数据。在优化的吞噬条件下，结合延长的抗生素处理，成功建立了金黄色葡萄球菌（S.aureus）的胞内感染模型，部分细菌可在巨噬细胞内存活。

感染耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的巨噬细胞在抗生素治疗两小时后仍保留胞内细菌，而此时上清液中已无细菌存在。在体内实验中，小鼠细菌定植检测显示，万古霉素可清除胞外金黄色葡萄球菌，但无法清除胞内细菌。