Name: 金黄色葡萄球菌细胞内感染模型的开发与评价 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-17T14:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: 了解金黄色葡萄球菌细胞内感染模型的建立方法，利用细胞培养、基因编辑和高通量测序技术研究细菌在宿主细胞内的存活与扩散机制，为开发新型治疗策略提供重要依据。

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本工作得到国家自然科学基金（NSFC，项目编号32300779、32270989）、重庆市自然科学基金（CSTB2022NSCQ-MSX0156）、重庆市教委科学技术研究项目（KJQN202312802）和中国博士后科学基金（2024M754250）的资助。

实验动物为6至8周龄的无特定病原体（SPF）雌性BALB/c小鼠，购自北京华阜康生物科技股份有限公司（中国北京）。所有动物实验均经第三军医大学实验动物福利与伦理委员会批准，并依照机构及国家关于实验动物使用的政策和指南进行。小鼠饲养于SPF级设施中，自由摄取无菌饲料和饮水。动物被随机分组，并在实验开始前给予至少7天的适应期。
1. 金黄色葡萄球菌（S. aureus）的准备
<ol>
	<li>菌株复苏：取一管冻存的MRSA252，灼烧并冷却接种环，蘸取菌液划线接种于胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）平板上（参见 材料表) 采用划线平板法28，37 °C 过夜培养。</li>
	<li>细菌活化：次日，取一个50 mL摇瓶，加入20 mL胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）培养基（参见 材料表用10 µL移液枪枪头挑取单个菌落并加入摇菌管中。在37 °C、220 rpm条件下过夜培养。</li>
	<li>二次活化：次日，取一个含有15 mL TSB培养基的50 mL摇瓶。从含有初次活化菌液的摇瓶中吸取200 µL菌液，加入另一个含有20 mL TSB培养基的新摇瓶中，在220 rpm、37 °C条件下振荡培养4小时。</li>
	<li>收集二次活化的细菌溶液至50 mL离心管中，3,000 x g 10 分钟后，弃去上清液。</li>
	<li>将沉淀的细菌重悬于10 mL生理盐水中，于3,000 x g 10 分钟。重复此步骤 2 次。</li>
	<li>测量菌液的OD600值，并用生理盐水将其调整至1.0。此时，本实验中MRSA252的菌量为1.0 × 109 CFU/mL 
	注意：将菌液加入不含抗生素的培养基中，并稀释至所需浓度；本实验所用的所有细菌均按上述方法制备。</li>
</ol>
2. 细胞内感染模型的建立 体外
<ol>
	<li>RAW264.7 细胞的制备 
	注意：本研究中使用的细胞系均购自ATCC。所有细胞系支原体污染检测结果均为阴性。所有实验均使用处于对数生长期的细胞进行。
	<ol>
		<li>将细胞从液氮中取出，在37 °C水浴中解冻。</li>
		<li>将 RAW264.7 细胞放入 15 mL 离心管中，加入 2 mL 杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM；参见 材料表) 加入10%胎牛血清（见 材料表）、青霉素（100 单位/毫升）和链霉素（100 µg/mL；参见 材料表；在37 °C、5% CO₂条件下使用完全培养基培养2. 以 300 x g 离心 g 5 分钟。</li>
		<li>接种 3 × 106 在100 mm培养皿中加入10 mL完全培养基接种RAW264.7细胞。置于37 °C、5% CO₂的细胞培养箱中孵育12 h。2 使细胞汇合度保持在50%–60%之间。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>体外 细胞内感染
	<ol>
		<li>取10 µL细胞悬液，加入细胞计数仪中以计算细胞浓度。计数后接种2 x 105 RAW264.7 细胞接种于 24 孔板中（参见 材料表使用完全培养基，每孔1 mL，置于细胞培养箱中孵育10–12小时。</li>
		<li>吸除上清液，加入1 mL含有2 × 10⁶个细胞的完全培养基6 将CFU细菌溶液（步骤1.6）加入各孔中，置于细胞培养孵箱中孵育2小时。MRSA252感染的感染复数 
		感染复数（MOI）为10。（为验证不同感染复数（MOI）值与细胞吞噬细菌之间的相关性，我们设立了MOI值分别为20、30、40和50的实验组。） 
		注意：感染细胞时使用的完全培养基中不含青霉素和链霉素。</li>
		<li>移除上清液，并用 PBS 洗涤细胞 2 次（参见 材料表）。每孔加入 800 µL 含 100 µg/mL 庆大霉素的 DMEM（参见 材料表）并置于含5% CO₂的细胞培养箱中，37 °C培养2 2小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>评估 体外 细胞内感染模型
	<ol>
		<li>细胞内 S. aureus 杀伤实验
		<ol>
			<li>分别将 RAW264.7 细胞（步骤 2.2.2 和 2.2.3）收集至离心管中。用 PBS 洗涤细胞 2 次，加入 0.1% Triton X-100（见 材料表将溶液加入各管中，孵育5分钟，收集裂解液至离心管中。</li>
			<li>使用 PBS 对裂解液进行连续稀释。取 20 µL 裂解液加入含有 180 µL PBS 的微量离心管中，通过移液充分混匀。按照此步骤逐步进行稀释。将每种稀释度的裂解液接种至 TSA 平板，于 37 °C 培养过夜。计数 TSA 平板上裂解液的菌落（图1A). 
			注意：此外，我们研究了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌252（MRSA252）在腹腔巨噬细胞内感染的最佳实验条件。经不同浓度庆大霉素处理后，感染MRSA252的腹腔巨噬细胞内的细菌载量如图所示 图1B，而经 100 µg/mL 庆大霉素处理不同时间后的细菌载量如图所示 图1C.</li>
			<li>按照第2.3.1.2节所述，用PBS对上清液和裂解液进行连续稀释，并观察上清液和裂解液在TSA平板上的菌落情况图2A).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）
		<ol>
			<li>将 RAW264.7 细胞（步骤 2.2）稀释至 2 x 105 每毫升细胞数置于共聚焦培养皿中（参见 材料表）并置于含5% CO₂的37 °C细胞培养箱中过夜，以促进细胞贴壁。2加入1 mL含有2 × 10⁶个细胞的完全培养基6 CFU 和 4 × 106 将细菌溶液（步骤1.6）分别加入各共聚焦培养皿中，置于细胞培养箱中孵育2小时，使感染复数（MOI）分别为10和20。</li>
			<li>移去上清液，用 PBS 洗涤细胞 3 次，加入含 100 µg/mL 庆大霉素的 DMEM 培养基孵育 2 小时，以去除胞外细菌。随后移去上清液，用 PBS 洗涤细胞 2 次，加入 DIL 工作液（见 材料表），在37 °C避光孵育5分钟。</li>
			<li>去除DIL工作液，用PBS洗涤3次，然后用4%多聚甲醛溶液固定（参见 材料表20分钟</li>
			<li>去除多聚甲醛溶液，用 PBS 洗涤 3 次，加入 DAPI 染液（见 材料表）避光孵育5分钟。移除DAPI染液，用PBS洗涤5次。使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察细胞（图2B). 
			注意：本研究使用了经绿色荧光蛋白（GFP）改造的MRSA252，该菌株通过同源重组方法构建而成29.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 建立 体内 细胞内感染模型
<ol>
	<li>小鼠腹腔巨噬细胞的获取
	<ol>
		<li>配制6%淀粉肉汤。按照3:10:5（w/w）的质量比，加入三种赋形剂（牛肉浸膏粉、胰蛋白胨、氯化钠；参见 材料表）依次加入玻璃容器中。加入1 L的ddH₂O。2O至玻璃容器中，搅拌至溶解，并用微波炉加热。加入可溶性淀粉（见 材料表以6的质量比混合，搅拌至溶解，并将玻璃容器在121 °C下高压灭菌30分钟。储存于4 °C冰箱中，直至形成糊状。</li>
		<li>按照下述步骤收集小鼠腹腔巨噬细胞。
		<ol>
			<li>选取两只 Balb/c 小鼠。用左手抓住小鼠的颈部并控制其尾巴。将小鼠翻转，使其头部朝下、腹部朝上（图3A）。每只小鼠腹腔注射6%淀粉肉汤3 mL（图3B). 
			注意：由于重力作用，腹腔内的器官会向后移至胸腔，从而防止注射器损伤其他器官。</li>
			<li>72 小时后，使用 3% 异氟烷麻醉小鼠，随后通过颈椎脱位法处死。用 75% 乙醇对小鼠进行消毒。使用眼科剪剪开小鼠腹部，充分暴露其腹膜（图4A- C).</li>
			<li>通过腹腔注射将10 mL DMEM培养基注入小鼠体内，以灌洗腹腔图 4D）。将DMEM注入小鼠腹腔后，轻轻揉搓小鼠腹部约1分钟，以更充分地灌洗腹腔。用注射器将灌洗液收集至50 mL离心管中（图4E).</li>
			<li>以 300 x g 离心洗涤液 g 5 分钟后弃去上清液。</li>
			<li>使用10 mL DMEM，添加10%胎牛血清、青霉素（100单位/mL）和链霉素（100 µg/mL；完全培养基）吹打并重悬收集的细胞，计数后将细胞浓度调整至2 × 106/mL，并接种至6孔板（参见 材料表），每孔1 mL。</li>
			<li>将6孔板置于37 °C、5% CO₂培养箱中2，孵育4小时，然后移除上清液。用无菌PBS洗涤细胞2次，每孔加入1 mL DMEM，于37 °C、5% CO₂条件下培养过夜2.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞内细菌的制备
	<ol>
		<li>将腹腔巨噬细胞（步骤 3.1.2）与 MRSA252 共同孵育 2 小时。移除上清液，用 PBS 洗涤细胞 2 次。加入含 100 µg/mL 庆大霉素的完全 DMEM 培养基（每孔 1 mL），于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 2 小时2.</li>
		<li>移去上清液，用 PBS 洗涤细胞 3 次。使用细胞刮刀将小鼠腹腔巨噬细胞收集至 50 mL 离心管中，在 300 x g 5 分钟。已成功在腹腔巨噬细胞中制备出 MRSA252 的胞内细菌。</li>
		<li>用于计算细胞内细菌时，向感染了细胞内MRSA252的腹腔巨噬细胞加入溶菌酶（10 µg/mL，参见 材料表在37 °C下孵育10分钟，然后用PBS洗涤2次。接着加入1 mL PBS重悬细胞。加入0.1% Triton X-100裂解细胞，作用5分钟。</li>
		<li>将裂解液进行系列稀释后滴加到TSA平板上，37 °C过夜培养。计算MRSA252在腹腔巨噬细胞内的细菌数量，为1.8 x 106 每只小鼠的菌落形成单位（CFU），通过计数细菌菌落获得。 
		注意：使用细胞刮刀收集细胞时动作应轻柔。应沿单一方向刮取细胞，避免细胞破裂，以免影响后续实验。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>小鼠细胞内细菌感染
	<ol>
		<li>将20只Balb/c小鼠随机分为四组（n=5）， 图 5A).</li>
		<li>对于第一组，注射 3 x 106 通过静脉注射每只小鼠注入CFU浮游态MRSA252。对于II组，注射3 x 106 CFU 浮游 MRSA252 和万古霉素（110 mg/kg；参见 材料表通过静脉注射，每只小鼠注射相应试剂。对于第III组，通过静脉注射注入细胞内细菌（按3.2步骤制备）。对于第IV组，通过静脉注射每只小鼠注入细胞内细菌（按3.2步骤制备）和万古霉素（110 mg/kg）。</li>
		<li>将小鼠置于红外理疗灯下，直至其尾静脉扩张。</li>
		<li>经静脉注射 3 x 106 每只小鼠静脉注射浮游CFU形式的MRSA252，分别对应第I组和第II组。每只小鼠静脉注射步骤3.2中制备的胞内菌，分别对应第III组和第IV组。 
		注意：使用注射器收集含有胞内细菌的液体时，建议先用移液器轻轻将液体充分混匀，以确保各小鼠间的感染水平一致。</li>
		<li>30分钟后，对II组和IV组每只小鼠静脉注射万古霉素。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>评估 体内 细胞内感染模型
	<ol>
		<li>通过计数肾脏中细菌的定植情况，评估小鼠的胞内感染模型。注射后24小时，使用3%异氟烷麻醉小鼠，并通过颈椎脱位处死。将小鼠置于75%乙醇中消毒。</li>
		<li>固定小鼠，一手用镊子提起腹部皮肤，另一手用眼科剪剪开小鼠腹部皮肤，暴露腹腔，找到肾脏，完整剥离肾脏，并将其置于PBS中。</li>
		<li>向组织研磨管中加入1 mL PBS。将每只小鼠的肾脏分别转移至不同的研磨管中，研磨至无固体组织残留。将匀浆后的组织液倒入各自的EP管中，并用相应的小鼠编号标记每根EP管。</li>
		<li>使用 PBS 对组织匀浆进行系列稀释。将每个稀释度分别点样于不同的 TSA 平板上，37 °C 过夜培养。计数菌落并分析数据（图5B).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Optimized In Vivo Models for Intracellular S. aureus Infection Studies

<ol><li>Sutton, J. A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+cell+wall+structure+and+dynamics+during+host-pathogen+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus cell wall structure and dynamics during host-pathogen interaction.</a> PLoS Pathog. 17 (3), e1009468(2021).</li>
<li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+flow+assay+of+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+using+bacteriophage+cellular+wall-binding+domain+as+recognition+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Lateral flow assay of methicillin-resistant Staphylococcus aureus using bacteriophage cellular wall-binding domain as recognition agent.</a> Biosens Bioelectron. 182, 113189(2021).</li>
<li>Howden, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+host+interactions+and+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus host interactions and adaptation.</a> Nat Rev Microbiol. 21 (6), 380-395 (2023).</li>
<li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+and+small+colony+variants-an+update+on+Staphylococcus+aureus+strategies+toward+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Biofilm and small colony variants-an update on Staphylococcus aureus strategies toward drug resistance.</a> Int J Mol Sci. 23 (3), 1241(2022).</li>
<li>Huitema, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+escape+strategies+of+Staphylococcus+aureus+in+persistent+cutaneous+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Intracellular escape strategies of Staphylococcus aureus in persistent cutaneous infections.</a> Exp Dermatol. 30 (10), 1428-1439 (2021).</li>
<li>Pidwill, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+population+expansion+of+Staphylococcus+aureus+occurs+due+to+escape+from+a+finite+number+of+intraphagocyte+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Clonal population expansion of Staphylococcus aureus occurs due to escape from a finite number of intraphagocyte niches.</a> Sci Rep. 13 (1), 1188(2023).</li>
<li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+Staphylococcus+aureus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Autophagy in Staphylococcus aureus infection.</a> Front Cell Infect Microbiol. 11, 750222(2021).</li>
<li>Arya, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+antivirulence+agent+targeting+the+master+regulator+of+virulence+genes+in+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of an antivirulence agent targeting the master regulator of virulence genes in Staphylococcus aureus.</a> Front Cell Infect Microbiol. 13, 1268044(2023).</li>
<li>Münzenmayer, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+sae-regulated+and+agr-regulated+factors+on+the+escape+of+Staphylococcus+aureus+from+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Influence of sae-regulated and agr-regulated factors on the escape of Staphylococcus aureus from human macrophages.</a> Cell Microbiol. 18 (8), 1172-1183 (2016).</li>
<li>Chin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+lugdunensis+uses+the+agr+regulatory+system+to+resist+killing+by+host+innate+immune+effectors%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus lugdunensis uses the agr regulatory system to resist killing by host innate immune effectors.</a> Infect Immun. 90 (10), e0009922(2022).</li>
<li>Podkowik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quorum-sensing+agr+system+of+Staphylococcus+aureus+primes+gene+expression+for+protection+from+lethal+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Quorum-sensing agr system of Staphylococcus aureus primes gene expression for protection from lethal oxidative stress.</a> Elife. 12, RP89098(2024).</li>
<li>Purves, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Air+pollution+induces+Staphylococcus+aureus+usa300+respiratory+tract+colonization+mediated+by+specific+bacterial+genetic+responses+involving+the+global+virulence+gene+regulators+agr+and+sae%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Air pollution induces Staphylococcus aureus usa300 respiratory tract colonization mediated by specific bacterial genetic responses involving the global virulence gene regulators agr and sae.</a> Environ Microbiol. 24 (9), 4449-4465 (2022).</li>
<li>Wittekind, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+novel+protein+scra+acts+through+the+saers+two-component+system+to+regulate+virulence+gene+expression+in+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The novel protein scra acts through the saers two-component system to regulate virulence gene expression in Staphylococcus aureus.</a> Mol Microbiol. 117 (5), 1196-1212 (2022).</li>
<li>Pidwill, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+macrophages+in+Staphylococcus+aureus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">The role of macrophages in Staphylococcus aureus infection.</a> Front Immunol. 11, 620339(2020).</li>
<li>Lang, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photoconvertible+reporter+system+for+bacterial+metabolic+activity+reveals+that+Staphylococcus+aureus+enters+a+dormant-like+state+to+persist+within+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">A photoconvertible reporter system for bacterial metabolic activity reveals that Staphylococcus aureus enters a dormant-like state to persist within macrophages.</a> mBio. 13 (5), e0231622(2022).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+macrophages+and+biofilm+during+Staphylococcus+aureus-associated+implant+infection%3A+Difficulties+and+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Innate+Immun%22%5BJournal%5D)">Interactions between macrophages and biofilm during Staphylococcus aureus-associated implant infection: Difficulties and solutions.</a> J Innate Immun. 15 (1), 499-515 (2023).</li>
<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcal+virulence+factor+hlgb+targets+the+endoplasmic-reticulum-resident+e3+ubiquitin+ligase+amfr+to+promote+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Staphylococcal virulence factor hlgb targets the endoplasmic-reticulum-resident e3 ubiquitin ligase amfr to promote pneumonia.</a> Nat Microbiol. 8 (1), 107-120 (2023).</li>
<li>Mulcahy, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+autophagy+and+apoptosis+facilitates+intracellular+survival+of+Staphylococcus+aureus+in+human+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Manipulation of autophagy and apoptosis facilitates intracellular survival of Staphylococcus aureus in human neutrophils.</a> Front Immunol. 11, 565545(2020).</li>
<li>Cai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+facilitates+its+survival+in+bovine+macrophages+by+blocking+autophagic+flux%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus facilitates its survival in bovine macrophages by blocking autophagic flux.</a> J Cell Mol Med. 24 (6), 3460-3468 (2020).</li>
<li>Ahmad-Mansour, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+toxins%3A+An+update+on+their+pathogenic+properties+and+potential+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus toxins: An update on their pathogenic properties and potential treatments.</a> Toxins. 13 (10), 677(2021).</li>
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<li>Pollitt, E. J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+infection+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus infection dynamics.</a> PLoS Pathog. 14 (6), e1007112(2018).</li>
<li>Sanders, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aseptic+laboratory+techniques%3A+plating+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Aseptic laboratory techniques: plating methods.</a> J Vis Exp. 11 (63), e3064(2012).</li>
<li>Qin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-antibiotic+conjugate+targeted+therapy+for+orthopedic+implant-associated+intracellular+S.+aureus+infections%5BTitle%5D)+AND+%22J+Adv+Res%22%5BJournal%5D)">Antibody-antibiotic conjugate targeted therapy for orthopedic implant-associated intracellular S. aureus infections.</a> J Adv Res. 65, 239-255 (2024).</li>
<li>Andie, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Dis+Primers%22%5BJournal%5D)">Methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> Nat Rev Dis Primers. 31 (4), 18034(2018).</li>
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作者声明不存在任何竞争利益。

S. aureus 作为一种兼性胞内病原体，能够侵入并在多种细胞类型中存活，利用这一能力在感染过程中逃避抗生素和免疫反应30。本研究建立了一种 S. aureus 的体内胞内感染模型，为深入探究该病原体的胞内感染机制提供了基础。通过考察不同感染复数（MOI）对巨噬细胞吞噬 S. aureus 的影响，以及不同抗生素浓度和处理时间的清除效果，确定了建立胞内感染模型的最佳条件（图1）。
当构建时 体外 模型 S. aureus 细胞内感染，调整 S. aureus 对数生长期的病原体稀释至所需浓度后加入细胞培养板中。确保培养基中不含抗生素，因为抗生素的存在可能抑制病原体侵入细胞的能力。感染2小时后，加入含有100 µg/mL浓度庆大霉素的培养基处理感染的细胞。细胞定植实验 (图2A)</strong...

S. aureus 是一种高度传染性的病原体，可引起多种感染，包括皮肤和软组织感染、败血症、脑膜炎、肺炎和心内膜炎1抗生素的临床滥用已导致耐药性增强 S. aureus 以及耐甲氧西林的出现 金黄色葡萄球菌 （耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，MRSA），在许多国家构成重大的公共卫生威胁2.
尽管S. aureus传统上未被归类为胞内病原体，但越来越多的证据表明，它在侵入宿主细胞后能够持续定植于宿主细胞内3。人们日益认识到，S. aureus在宿主吞噬细胞内胞内存活的能力是促进其转移性感染及在宿主体内播散的重要机制4,5,6。S. aureus分泌多种毒力因子，这些因子可营造有利于其自身存活的免疫环境，并阻碍宿主彻底清除该细菌7。辅助基因调节子（agr）和金黄色葡萄球菌辅助元件（Sae）是两个与Staphylococcus aureus在吞噬细胞内存活密切相关的重要毒力调控系统8,9。agr系统是一种群体感应机制，可调控S. aureus中多种毒力因子的表达，控制毒素及其他促进细菌存活与播散因子的产生。在胞内感染过程中，agr系统在调控毒力因子方面发挥关键作用，这些毒力因子对细菌逃避宿主免疫应答及在宿主细胞内存活至关重要。研究表明，agr系统影响细菌从吞噬体中逃逸并在巨噬细胞中持续存在的能力。agr缺失可导致细菌在宿主细胞内的存活能力下降以及毒力减弱10,11。Sae系统是一种双组分调控系统，可调控S. aureus中多种毒力因子的表达，参与调控毒素和酶的产生，从而增强细菌侵袭和破坏宿主组织的能力。Sae系统在S. aureus的胞内存活中也发挥着关键作用，可影响细菌抵抗宿主吞噬细胞杀伤以及逃避自噬降解的能力12,13。
当病原体入侵时，巨噬细胞具有吞噬功能，能够吞噬并杀灭外来病原体，同时激活适应性免疫反应14。大多数入侵的细菌会被巨噬细胞吞噬，随后巨噬细胞启动多种杀伤机制以清除这些细菌。然而，部分S. aureus细菌可在巨噬细胞内存活，导致宿主发生持续性感染。除了细菌蛋白外，宿主还可通过分泌细胞因子影响S. aureus在巨噬细胞内的存活与增殖15,16,17。一些研究表明，S. aureus可通过驻留在自噬体中以逃避降解，从而建立有利于其扩散的细胞内生态位18。S. aureus在侵入巨噬细胞后，通过阻断自噬流（如LC3-II、p62）以及提高自噬溶酶体内的pH值，从而逃逸自噬性降解19。这种免疫逃逸机制依赖于对S. aureus毒力因子和自噬过程的调控，导致持续且隐匿的感染。
清除细胞内 S. aureus 感染对于临床实践中控制持续性和潜伏性感染至关重要。目前，抗生素是治疗 S. aureus 感染的主要手段，其中万古霉素是治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）感染的最后一道防线20,21。然而，大量研究表明，现有抗生素在体内（in vivo）和体外（in vitro）均无法有效清除细胞内的 S. aureus22,23,24。
目前尚无统一标准用于各种细胞内感染模型 S. aureus25,26,27，因为各个模型的条件差异显著，因此无法采用相同的标准来评估这些模型的有效性。在本研究中，我们建立了一种通用的细胞内感染模型 金黄色葡萄球菌 通过优化实验条件，该模型比其他模型更具便利性，因为它允许细菌对细胞进行初始感染。 体外，随后将这些感染的细胞递送至体内。
为了更好地理解细胞内机制 S. aureus 感染并开发相关药物，我们建立了两种 体外 和 在体 模型。已成功建立稳定的细胞内感染模型 体外 通过用抗生素感染RAW264.7细胞并进行共培养，随后提取腹腔巨噬细胞并建立细胞内感染模型。通过将这些腹腔巨噬细胞注射入小鼠体内，建立小鼠体内的细胞内感染模型。

<table><tbody><tr><td>24孔板</td><td>Corning Incorporated, USA</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>4% 多聚甲醛溶液</td><td>BBI, UK</td><td>E672002-0500</td><td></td></tr><tr><td>6孔板</td><td>Corning Incorporated, USA</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>牛肉提取物粉末</td><td>BBI, UK</td><td>A600114-0500</td><td></td></tr><tr><td>生物危害安全设备</td><td>Heal force, 中国</td><td>VS-1300L-u</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养箱</td><td>ESCO, 新加坡</td><td>CCL-170B-8</td><td></td></tr><tr><td>细胞刮刀</td><td>Nest</td><td>710001</td><td></td></tr><tr><td>离心机 M1416R</td><td>RWD, 中国</td><td>M1416R</td><td></td></tr><tr><td>离心管</td><td>广厚 Labselect, 中国</td><td>CT-002-50A</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）</td><td>Zeiss, 德国</td><td>880</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦培养皿</td><td>Biosharp, 中国</td><td>BS-20-GJM</td><td></td></tr><tr><td>DAPI 染料</td><td>上海碧云天, 中国&amp;nbsp;</td><td>C1006</td><td></td></tr><tr><td>DIL 工作液</td><td>上海碧云天, 中国&amp;nbsp;</td><td>C1991S</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 改良伊格尔培养基</td><td>Thermo Gibco, USA</td><td>C11995500BT</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Hyclone</td><td>SV30208.02</td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td>上海生工, 中国</td><td>B540724-0010</td><td></td></tr><tr><td>培养箱</td><td>上海恒子, 中国</td><td>HDPF-150</td><td></td></tr><tr><td>溶菌酶</td><td>北京索莱宝, 中国</td><td>L9070</td><td></td></tr><tr><td>MRSA252</td><td>第三军医大学, 中国</td><td>null</td><td></td></tr><tr><td>MRSA252(GPF)</td><td>第三军医大学, 中国</td><td>null</td><td></td></tr><tr><td>青霉素和链霉素</td><td>上海碧云天, 中国&amp;nbsp;</td><td>C0222</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>上海碧云天, 中国&amp;nbsp;</td><td>ST476</td><td></td></tr><tr><td>生理盐水</td><td>四川科伦, 中国</td><td>null</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>上海麦克林, 中国</td><td>S805275</td><td></td></tr><tr><td>可溶性淀粉</td><td>上海生工, 中国</td><td>A500904-0500</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>上海碧云天, 中国&amp;nbsp;</td><td>P0096-100ml</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）平板</td><td>北京奥博兴生物科技有限公司, 中国</td><td>02-130</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）培养基</td><td>北京奥博兴生物科技有限公司, 中国</td><td>02-102K</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>OXOID, UK</td><td>LP0042B</td><td></td></tr><tr><td>万古霉素</td><td>上海碧云天, 中国&amp;nbsp;</td><td>ST2807-250mg</td><td></td></tr><tr><td>RAW264.7 细胞</td><td>美国, ATCC</td><td>null</td><td></td></tr></tbody></table>

细胞内感染模型的建立与评估：针对staphylococcus aureus

Development and Assessment of Intracellular Infection Models for Staphylococcus aureus

S. aureus 可侵入并在宿主细胞（包括免疫细胞）内存活，从而逃避免疫系统的识别与清除。这种胞内持续存在特性导致慢性和反复感染，使治疗复杂化并延长病程。因此，迫切需要建立一种胞内感染模型，以更好地理解、预防和治疗由其引起的感染。 S. aureus本研究结果表明，抗生素能有效清除细胞外细菌，但无法根除已进入细胞内的细菌，因此形成了稳定的胞内感染。 体外 由感染RAW264.7细胞建立 S. aureus 并与抗生素共培养。随后，通过注射含有胞内感染的腹腔巨噬细胞，建立小鼠胞内感染模型。万古霉素可有效清除浮游细菌攻毒小鼠体内的细菌载量 S. aureus；然而，对于腹腔巨噬细胞内细菌载量相等或更低的小鼠，该方法无效。这表明腹腔巨噬细胞内感染模型 S. aureus 成功建立，为细胞内感染的预防和治疗提供了潜在的见解。

细胞内感染模型 S. aureus 均成功建立 体外 和 体内通过优化吞噬作用的实验条件，并延长抗生素处理的浓度和持续时间，一些 S. aureus 在巨噬细胞内存活（图1）。为进一步评估抗生素耐药性 S. aureus，用MRSA252感染的巨噬细胞经抗生素处理2小时，直至细胞上清液中不再含有 S. aureus，而一些细菌在巨噬细胞内存活图2A）。共聚焦激光扫描显微镜显示，抗生素无法杀死 S. aureus 细胞内（图2B）。此外，小鼠细菌定植实验表明，万古霉素能够清除浮游状态的 S. aureus，但对细胞内寄生的细菌无效（图5B）。因此，细胞内感染模型的 S. aureus</e...

Staphylococcus aureus（S. aureus）具有在体内扩散的能力，可导致持续性和反复性感染。为了更好地理解这些过程，本研究建立了一种S. aureus的胞内感染模型。该模型将为研究胞内感染的机制提供重要的基础。

细胞内感染模型的建立与评估：针对Staphylococcus aureus

金黄色葡萄球菌（S. aureus）可侵入并在宿主细胞（包括免疫细胞）内存活，从而逃避免疫系统的识别与清除。这种胞内...

我们的研究聚焦于金黄色葡萄球菌感染，旨在建立一种胞内感染模型。该模型将有助于深入理解胞内感染的机制，并为预防和治疗此类感染提供严格的依据。目前金黄色葡萄球菌胞内感染的最新研究进展主要集中于探究其感染机制，以调控细菌在细胞内的存活与扩散，并进一步优化药物设计及结构修饰，从而提高治疗效果。该研究领域采用细胞培养、新兴的细胞测序技术、高通量筛选技术、基因编辑技术以及其他相关技术，研究细胞内的细菌感染。与传统感染模型相比，我们优化了针对细胞内感染的实验条件。在单独用金黄色葡萄球菌感染细胞后，将感染细菌的细胞接种至小鼠体内，以建立细胞内感染模型。该方法通过最大限度减少游离细菌的干扰，提高了效率，确保更准确地保留细胞内感染过程。我们的方法将致力于抗体药物的开发，并为进一步预防和治疗细菌感染奠定基础。配制6%淀粉肉汤时，按3:10:5的质量比，依次将牛肉浸膏粉、蛋白胨和氯化钠加入玻璃容器中。加入100毫升双蒸水，搅拌至各组分溶解。将溶液放入微波炉中加热。然后按质量比6加入可溶性淀粉，搅拌混合物直至完全溶解。在 121 摄氏度下高压灭菌培养基 30 分钟。灭菌后，将培养基于 4 摄氏度保存，直至形成糊状。为收集小鼠腹腔巨噬细胞，用左手抓住小鼠颈部并控制其尾巴。然后将小鼠翻转，使其头部朝下，腹部朝上。向小鼠腹腔注射3毫升6%淀粉肉汤。注射72小时后，处死麻醉的小鼠，并用75%乙醇进行消毒。使用眼科剪剪开小鼠腹部，充分暴露腹膜。通过腹腔注射将 10 毫升 DMEM 注入腹腔。轻轻揉搓腹部一分钟，以冲洗腹腔。然后，使用注射器将灌洗液收集到一个 50 毫升离心管中。将灌洗液在 300 ×g 条件下离心 5 分钟，弃去上清液。用 10 毫升添加了 10% FBS、青霉素和链霉素的 DMEM 重新悬浮细胞沉淀。取10微升细胞悬液，加入细胞计数仪中进行细胞计数。用DMEM FBS将细胞稀释至浓度为2 × 10⁶ 个细胞/毫升。每孔加入1毫升细胞悬液，接种于6孔板中。将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育4小时。孵育结束后，移除上清液。用无菌PBS洗涤细胞两次，每孔加入1毫升DMEM，于相同条件下过夜培养。将腹腔巨噬细胞与金黄色葡萄球菌 MRSA-252 共同孵育 2 小时。移除上清液，并用 PBS 洗涤细胞两次。每孔加入 1 毫升含 100 微克/毫升庆大霉素的完全 DMEM 培养基，在 37°C、5% CO₂ 条件下孵育 2 小时。孵育后，用 PBS 洗涤细胞三次。使用细胞刮刀将腹腔巨噬细胞收集到 50 毫升离心管中。以 1000 ×g 离心五分钟。向感染了胞内 MRSA-252 的巨噬细胞中加入终浓度为 10 微克/毫升的溶菌酶，37°C 孵育 10 分钟。用 PBS 洗涤细胞两次后，将细胞重悬于 1 毫升 PBS 中。随后取出约 20 微升分装样品，加入 0.1% Triton X-100 处理 5 分钟以裂解细胞。用 PBS 对裂解的细胞悬液进行系列稀释，并将稀释液滴加到胰蛋白胨大豆琼脂平板上。在 37 摄氏度下培养过夜。次日，计数细菌菌落，以计算腹腔巨噬细胞内的 MRSA-252 细菌数量。将小鼠置于红外线理疗灯下，直至尾静脉扩张。将小鼠随机分为四组。通过尾静脉向小鼠体内静脉注射3 × 10⁶ CFU 浮游态MRSA-252。24小时后，处死麻醉的小鼠，并用75%乙醇彻底消毒。一手用镊子提起腹部皮肤，另一手用眼科剪剪开皮肤。在腹腔内找到肾脏，并小心将其完全剥离。将肾脏转移至含有1毫升PBS的研磨管中，研磨至无固体组织残留。将匀浆后的组织倒入离心管中。使用PBS对组织匀浆液进行系列稀释。将每种稀释液分别点样于不同的三联大豆琼脂平板上，于37摄氏度培养过夜。次日计数细菌菌落并分析数据。在优化的吞噬条件下，结合延长的抗生素处理，成功建立了金黄色葡萄球菌（S.aureus）的胞内感染模型，部分细菌可在巨噬细胞内存活。感染耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的巨噬细胞在抗生素治疗两小时后仍保留胞内细菌，而此时上清液中已无细菌存在。在体内实验中，小鼠细菌定植检测显示，万古霉素可清除胞外金黄色葡萄球菌，但无法清除胞内细菌。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

金黄色葡萄球菌细胞内感染模型的开发与评价

小鼠皮肤和软组织感染模型用于评估耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的毒力功能及宿主免疫应答。本文介绍了一种用于皮肤和软组织感染的皮下感染模型。...

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的皮下感染

大鼠耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）实验性心内膜炎模型

来源： Zhang, C. 等 细胞内感染模型的建立与评估 金黄色葡萄球菌. J. Vis. Exp.

评估细菌病原体在小鼠腹腔巨噬细胞中的存活情况

来源： Zhang, C., 等，细胞内感染模型的建立与评估 Staphylococcus aureus. J. Vis. Exp. (2025)该视频展示了分离含有金黄色葡萄球菌（Staphylococcus...

评估小鼠模型中细胞内细菌的持续存在与抗生素耐药性

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一种用于活体可视化及活体分析生物材料相关反应的斑马鱼胚胎模型 金黄色葡萄球菌 感染

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