Name: 临床前大型动物模型中的肾脏获取 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-02T13:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 36 s
Description: 学习在猪模型中进行肾脏获取的标准化手术流程，用于器官移植前保存技术研究。该方法采用正中开腹术获取肾脏，结合新型冷冻保护剂延长器官保存时间，为临床前移植研究提供可靠平台。

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作者谨向约翰斯·霍普金斯大学医学院的众多兽医技术人员致以诚挚谢意，感谢他们提供的技术支持。我们还要感谢杰西卡·伊齐博士、阿曼达·麦克斯韦尔博士，以及包括马洛里·布朗博士、杰西卡·普伦卡德博士和亚历克西斯·罗奇博士在内的众多兽医住院医师，感谢他们为实验动物提供了出色的临床护理和兽医监督。最后，我们谨向约翰斯·霍普金斯医学院血管化复合组织异体移植（VCA）实验室的全体成员表示感谢，他们在本实验室开展的肾脏获取或其他器官获取操作中，以各种方式提供了协助。本研究工作得到了美国国家糖尿病、消化与肾脏疾病研究所（NIDDK）R44DK136396 项目基金的资助。

所有实验程序均经美国农业部（USDA）许可、实验动物福利办公室（OLAW）认证并经实验动物护理与使用评估认证协会（AAALAC）认证的约翰斯·霍普金斯大学机构动物护理与使用委员会批准。动物的饲养和管理严格遵循美国农业部《动物福利法》、美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》以及美国公共卫生服务部《实验动物人道护理与使用政策》。
1. 动物与饲养
<ol>
	<li>本方案使用3至6月龄、临床健康的约克夏猪（Sus scrofa domesticus），体重20-40 kg，或可比动物。</li>
	<li>将动物饲养在带有格栅地板或其他符合物种需求的圈舍中的链式围栏内。</li>
</ol>
2. 术前准备与麻醉
<ol>
	<li>在麻醉前至少 12 小时开始禁食动物。</li>
	<li>在手术前至少 12 小时给予口服西咪替康（20 mg/kg），并在麻醉前至少 1 小时重复给药一次，以减少肠道扩张。</li>
	<li>将氯胺酮（20–30 mg/kg）和赛拉嗪（2–3 mg/kg）混合于同一注射器中，通过肌内注射给药，以避免多次注射。</li>
	<li>将猪转移至术前准备区，在耳缘静脉放置静脉导管。在整个手术过程中持续输注 0.9% 氯化钠溶液或乳酸林格液，剂量为 3–10 mL/kg/h。</li>
	<li>当猪达到充分镇静状态后，插入气管插管（20–30 kg 动物使用 6.0–6.5 mm 带套囊气管插管；30–40 kg 使用 6.5–7.0 mm 带套囊插管），用于吸入麻醉和机械通气。如有需要，可静脉给予丙泊酚（0.8–1.66 mg/kg）辅助插管，按需给药至起效。</li>
	<li>在将动物转移至手术室前，使用电动剪刀去除手术区域及其周围毛发，并对手术部位进行初步清洁擦洗。</li>
	<li>将动物转移至手术台。在手术开始前 10 分钟静脉给予头孢唑林（20–22 mg/kg），之后每 90 分钟术中重复给药一次。在手术开始时静脉给予泮托拉唑（0.5–1 mg/kg）。</li>
	<li>在切口前，于手术部位皮下注射利多卡因（最高剂量达 2 mg/kg）进行局部阻滞，以增强镇痛效果。</li>
	<li>以无菌方式准备手术区域，交替使用氯己定或碘伏与 70% 乙醇或生理盐水，至少消毒三次。</li>
	<li>持续监测液体输注量、心率、血压、脉搏血氧饱和度、二氧化碳波形图、心电图及直肠温度，每 10–15 分钟记录一次数值。使用加热垫和暖风毯以防止低体温。</li>
	<li>在开始手术前，结合下颌张力、眼睑反射以及前述步骤中列出的各项参数，确认动物已处于适当的外科麻醉深度。</li>
</ol>
3. 肾脏摘取操作步骤
<ol>
	<li>按照第2节所述步骤进行动物术前准备。</li>
	<li>对手术区域进行无菌消毒并铺巾后，行正中腹切口（25–30 cm），以充分暴露双侧肾脏。插入标准腹腔牵开器。</li>
	<li>用温盐水浸湿的纱布覆盖结肠和小肠，并将肠管向右侧牵开以暴露左肾，或向左侧牵开以暴露右肾。</li>
	<li>切开肾脏表面的腹膜，游离肾脏周围组织以清除任何粘连。继续游离输尿管，直至获得10–12 cm长度。</li>
	<li>游离肾静脉和肾动脉，分别至其起源于下腔静脉和腹主动脉的根部。</li>
	<li>完成肾脏完全游离后，使用2-0丝线在远端结扎输尿管，并在其近端结扎处上方切断。保留近端输尿管开放，以利于尿液引流（在存活手术中，用纱布收集尿液）。</li>
	<li>通过静脉注射肝素（100 IU/kg）进行肝素化，并等待2分钟，确保肾脏充分肝素化。每次切除肾脏前均应重复此步骤。</li>
	<li>分别用两把Satinsky血管钳夹闭肾动脉和肾静脉靠近腹主动脉及下腔静脉的根部。在靠近血管钳处切断肾动脉和肾静脉，摘除肾脏移植物。</li>
	<li>立即使用直径3 mm的钝头灌注导管插入肾动脉，用冰冻的威斯康星大学（UW）溶液或 Custodiol 组氨酸-色氨酸-酮戊二酸（HTK）器官保存液对肾脏进行灌洗。</li>
	<li>灌洗完成后，取出灌注导管，将肾脏置于无菌器官保存袋中，袋内充满与灌洗时相同的冰冻保存液。再将此袋放入第二个无菌器官保存袋中。随后可储存器官或启动机械灌注。</li>
	<li>使用2-0丝线结扎肾动脉残端。使用6-0聚丙烯缝线以两层连续缝合法闭合肾静脉残端。</li>
	<li>对于存活实验动物，在关腹前应用无菌生理盐水冲洗腹腔。</li>
</ol>
4. 血液采集步骤
<ol>
	<li>如果该操作为终末性操作，且所有其他外科干预均已完成后，可进行机器灌注用血液采集，并通过放血实施安乐死。</li>
	<li>将肠管向右侧牵开，辨认肾下腹主动脉。分离覆盖血管的任何大块粘连或组织。</li>
	<li>将采血袋针头直接插入主动脉，将血袋悬挂于动物下方以利于血液流入。当血袋充满后（约450 mL血液），拔出主动脉内的针头，并对穿刺部位施加压力止血。</li>
	<li>如需采集第二袋血，将新针头插入前一穿刺点近端1-2 cm处。根据需要重复此步骤，每次进针位置较前一次向近端移动1-2 cm。</li>
	<li>在完成所有必要血液采集后，静脉注射戊巴比妥钠/苯妥英钠，剂量至少为戊巴比妥成分78 mg/kg，以诱导心脏停搏。若担心戊巴比妥可能干扰后续肾脏检测，可在麻醉状态下的猪中使用氯化钾（KCl）（75–100 mg/kg，静脉注射）作为替代的化学安乐死方法。通过无心跳、角膜反射消失以及体温显著下降来确认动物死亡。 
	注意：安乐死后猪的其余器官和组织可在符合3R原则的前提下，用于其他科研或教学用途。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

猪肾移植模型对灌注技术的开发和优化至关重要。由于猪肾在解剖学、免疫学和病理生理学方面与人类肾脏具有高度相似性6,7,8，因此猪肾可更便捷地应用于临床试验与实践。

猪肾获取模型可用于多种临床前实验。在活体供体模型中，可获取并保存单个肾脏，随后进行自体移植并切除对侧肾脏18,19。在尸体供体模型中，可获取双侧肾脏，用于保存研究、机械灌注研究或同种异体移植。第4节中所述的采血操作对于使用含全血或血液制品灌注液的机械灌注研究至关重要，尤其适用于需要更换灌注液的延长机械灌注研究20,21,<sup...

肾移植是终末期肾病（ESRD）的最佳治疗方式，与透析相比，可显著改善患者的生活质量并提高长期预后1尽管器官保存技术已取得进展，但每天仍有数十名终末期肾病患者在等待肾移植期间死亡2机器灌注是一个不断发展的领域，可延长器官保存时间，从而扩大供体网络并提高器官分配效率。该技术还允许对器官进行 离体 器官监测与优化，从而最大限度地减少缺血-再灌注损伤（IRI）的影响。与静态冷保存（SCS）相比，机械灌注已被证明可显著降低移植肾功能延迟恢复的发生率3,4机器灌注还显示出可使边缘性移植物恢复活力，否则这些移植物将无法达到移植标准5.&#160;尽管技术不断进步，目前最常用的保存方法仍是冷静态保存（SCS）并置于冰上。进一步的临床前实验和数据积累有助于使机器灌注成为肾脏保存的常规手段。

猪作为肾脏移植的模型已得到广泛认可，并在肾脏保存技术（尤其是机械灌注）的发展中发挥了关键作用。与单叶结构的啮齿类动物肾脏不同，猪和人类的肾脏均为多叶结构，大小相似，且具有类似的动脉、静脉和泌尿系统解剖结构6,7。因此，猪肾脏能够直接转化为临床应用，尤其在医疗器械和药物治疗方面具有高度可比性。此外，猪肾脏在缺血-再灌注损伤（IRI）方面的病理生理学特征与人类肾脏相似8，使其成为肾脏保存研究的理想模型。

为确保移植物质量和数据的可重复性，应遵循标准化且具有临床转化价值的器官与组织获取外科技术。因此，本文介绍了一种在临床前猪模型中优化的肾脏获取方案。该方案可实现肾脏的获取，并可模拟活体（单侧肾脏）或尸体（双侧肾脏）供体环境。单侧肾脏获取的优势在于可进行后续自体移植。在双侧肾脏获取模型中，可在实施安乐死后通过将血袋针直接插入主动脉采集血液，从而放空动物体内血液并获取可用于后续实验的血液样本。 离体 机械灌注

<table><tbody><tr><td>70% 乙醇溶液</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-122</td><td></td></tr><tr><td>Adson 组织镊，4.75&quot;，1 × 2 齿</td><td>Wexler Surgical</td><td>FL0081.1</td><td></td></tr><tr><td>Bair Hugger 动物健康用全身保温毯</td><td>3M</td><td>53777</td><td></td></tr><tr><td>Bair Hugger 加温系统主机</td><td>3M</td><td>77500</td><td></td></tr><tr><td>Balfour 腹部拉钩（带固定侧叶片），4&quot; 深，最大张开 10&quot;</td><td>MPM 医疗用品公司</td><td>124-7017</td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘溶液（5%）</td><td>MWI 动物健康公司</td><td>NDC-67618-155-01</td><td></td></tr><tr><td>注射用头孢唑林钠，USP</td><td>MWI 动物健康公司</td><td>NDC-63323-237-10</td><td></td></tr><tr><td>氯己定溶液</td><td>MWI 动物健康公司</td><td>NDC-30798-624-31</td><td></td></tr><tr><td>Custodial&amp;nbsp;HTK 器官保存液</td><td>Essential Pharmaceuticals</td><td>25767073545</td><td></td></tr><tr><td>DeBakey 组织镊，7.75&quot;，2 mm 尖端</td><td>Wexler Surgical</td><td>FL0789.1</td><td></td></tr><tr><td>EUTHASOL（戊巴比妥钠和苯妥英钠）</td><td>Virbac</td><td>NDC-051311-050-01</td><td></td></tr><tr><td>肝素钠注射液，USP</td><td>MWI 动物健康公司</td><td>NDC-71288-402-10</td><td></td></tr><tr><td>Hot Dog 温度管理控制器</td><td>Augustine Surgical Inc.</td><td>WC71V</td><td></td></tr><tr><td>Hot Dog 兽用体下加温垫</td><td>Augustine Surgical Inc.</td><td>V106</td><td></td></tr><tr><td>Invisishield 隔离袋，20&quot; × 20&quot;</td><td>Medline</td><td>DYNJSD1003</td><td></td></tr><tr><td>Jacobson 微型持针器，直颚，圆柄，7.25&quot;</td><td>Wexler Surgical</td><td>NL0729.11</td><td></td></tr><tr><td>盐酸氯胺酮注射液</td><td>NexGen Pharmaceuticals</td><td>NC-0256</td><td></td></tr><tr><td>纱布垫，18&quot; × 18&quot;</td><td>Medline</td><td>MDS231318LF</td><td></td></tr><tr><td>Metzenbaum 解剖剪，7&quot; 弯头</td><td>Wexler Surgical</td><td>SL5011.1S</td><td></td></tr><tr><td>非导电吸引管（带扇形接头），1/4&quot; × 10'</td><td>Medline</td><td>DYND50251</td><td></td></tr><tr><td>注射用泮托拉唑钠</td><td>MWI 动物健康公司</td><td>NDC-55150-202-00</td><td></td></tr><tr><td>灌注导管，自由流动式，3 mm 钝头</td><td>MED Alliance Solutions</td><td>PER-3003S</td><td></td></tr><tr><td>刚性球头 Yankauer 吸引管</td><td>Medline</td><td>DYND50130</td><td></td></tr><tr><td>Satinsky 血管钳，30 mm 角形 DeBakey 无创颚，弯柄，10&quot;</td><td>Wexler Surgical</td><td>AL2150.1</td><td></td></tr><tr><td>3 号手术刀柄</td><td>World Precision Instruments</td><td>500236</td><td></td></tr><tr><td>Servator B UW（威斯康星大学）保存液</td><td>Global Transplant Solutions</td><td>JFISERB10A r2</td><td></td></tr><tr><td>单单位预充式 CPDA-1 采血袋，450 mL</td><td>Jorgensen Laboratories</td><td>JO520</td><td></td></tr><tr><td>Sofsilk 缝线结扎线，2-0，黑色，18&quot;</td><td>Covidien</td><td>S-195</td><td></td></tr><tr><td>10 号手术刀片</td><td>World Precision Instruments</td><td>500239</td><td></td></tr><tr><td>Surgipro II 缝线，6-0，蓝色，30&quot;，双针，CV-22 针</td><td>Covidien</td><td>VP-733-X</td><td></td></tr><tr><td>四分之三手术铺巾</td><td>Medline</td><td>DYNJP2414</td><td></td></tr><tr><td>Valleylab 电外科笔（带不锈钢电极）</td><td>Covidien</td><td>CVNE2516H</td><td></td></tr><tr><td>Valleylab Force FXc 电外科发生器</td><td>Covidien</td><td>MFI-MDT-FORCE-FXC</td><td></td></tr><tr><td>Valleylab Polyhesive 成人患者回路电极</td><td>Covidien</td><td>E7507-SD</td><td></td></tr><tr><td>盐酸赛拉嗪注射液</td><td>NexGen Pharmaceuticals</td><td>NC-0334</td><td></td></tr></tbody></table>

大型动物临床前模型中的肾脏获取

Kidney Procurement in a Preclinical Large Animal Model

机械灌注已发展成为一种可行的策略 离体 器官评估、监测、治疗、优化以及延长保存时间。大型动物模型对于这些技术的开发与优化至关重要。然而，为了确保移植物质量和数据的可重复性，应遵循标准化且具有临床可转化性的器官与组织获取手术技术。因此，本文描述了一种在临床前猪模型中优化的肾脏获取方案。肾脏获取采用杂交品种（约克夏杂交/混合）猪进行。简要而言，在对手术区域进行无菌消毒和铺巾后，行完整的正中切口，以充分暴露双侧肾脏。游离输尿管、肾静脉和肾动脉，直至其分别起源于下腔静脉和腹主动脉处。完成全肾游离后，远端结扎并切断输尿管。随后，按每公斤体重100 IU剂量对供体动物全身肝素化。接着，使用Satinsky血管钳在靠近腹主动脉处夹闭肾动脉，在靠近下腔静脉处夹闭肾静脉。切除肾脏移植物后，立即在修肾台上对肾动脉进行插管。随后用冰冻保存液冲洗肾脏，并将其置于冰上保存，直至进行机械灌注或移植。最后，使用2-0丝线结扎肾动脉残端，采用6-0聚丙烯缝线关闭下腔静脉。该技术可用于获取肾脏，模拟活体（单肾）或死亡（双肾）供体环境。单肾获取的优势在于可进行后续自体移植。在死亡供体模型中，可在实施安乐死前将血袋针直接插入腹主动脉采集血液，从而放空动物全身血液并获取供体血样 离体 机械灌注

我们的研究团队在猪的实体器官移植和血管化复合组织异体移植模型方面拥有近15年的广泛经验9,10,11,12,13,14,15,16,17。本文中，我们报告了猪肾脏获取实验的结果（n = 139）。我们已将获取的肾脏用于移植、机械灌注或原代细胞培养，迄今为止在该手术模型中未遇到任何并发症（图1）。我们将成功的肾脏获取定义为手术无技术性失败，且未出现与解剖结构或手术技术相关的不良结果。...

本文介绍了一种用于临床前猪模型中肾脏获取的手术方案，以进行后续的机械灌注或移植。

机械灌注已发展成为一种可行的策略，可用于器官的体外评估、监测、治疗和优化，并可延长器官保存时间……

我们的研究旨在开发具有变革性的新型组织和器官保存技术，例如采用受自然界启发的下一代冷冻保护剂，实现器官在零下温度下的无冰保存。我们利用创新的显微外科小型和大型动物模型作为转化研究平台，推动器官与组织冷藏、免疫调节及免疫监测技术的发展。当前，技术进步正在深刻改变移植领域。然而，在建立可用于体内测试这些技术的临床相关大型动物模型方面，仍存在一些挑战。通过将器官保存时间从数小时延长至数天，本研究有望缓解移植领域最严峻的挑战之一——器官储存时间极为有限的问题，同时还能增加可用于移植的器官数量。首先，在已做好手术准备并处于麻醉状态的动物身上进行正中腹切口，切口长度约为 25 至 30 厘米，以充分暴露双侧肾脏。插入标准腹部拉钩。用浸有温盐水的纱布覆盖结肠和小肠。将肠管向右牵开以暴露左肾，或向左牵开以暴露右肾。切开覆盖肾脏的腹膜，分离肾脏周围组织以松解可能存在的粘连。游离输尿管直至获得10至12厘米的长度。接着，解剖肾静脉直至其起源于下腔静脉的起始部暴露清楚。同样，解剖动脉直至其起源于主动脉的部位暴露出来。完全游离肾脏后，用2-0丝线在远端结扎输尿管。在结扎处近端剪断，使近端输尿管末端开放，以利于尿液引流。静脉注射每公斤体重100国际单位的肝素，等待两分钟，以确保肾脏充分肝素化。使用Satinsky血管钳在靠近主动脉处夹闭肾动脉。同样，在靠近下腔静脉处夹闭肾静脉。在靠近夹子处切断肾动脉和肾静脉，以切除肾脏移植物。用冰冻的威斯康星大学（UW）溶液或 Custodiol 组氨酸-色氨酸-酮戊二酸（HTK）保存液冲洗肾脏。移除灌注套管，将肾脏置于无菌器官袋中，并用与冲洗相同的冰冻保存液充满器官袋。将袋子放入第二个无菌器官袋中。使用2-0丝线结扎肾动脉残端，并用6-0聚丙烯线以两层连续缝合法关闭肾静脉残端。为获取机器灌注用血液，需辨认肾下腹主动脉。松开覆盖血管的任何大块粘连或组织。将采血袋针头直接插入主动脉。将采血袋悬挂在动物下方，以利于血液流入。肾脏已成功获取，用于移植、机器灌注和原代细胞培养实验。值得注意的是，所有实验组均成功获取了肾脏，表明该手术操作模型未出现并发症。肾脏移植物的大体外观在不同阶段有所不同，如本图所示。原生肾脏呈深红色且血管丰富。用冰冻保存液灌洗后，肾移植器官颜色变浅。机器再灌注后，肾移植器官恢复粉红色，可见血管内血流。移植后，肾脏呈现均匀灌注，类似于天然肾脏。64%的肾脏具有一条肾动脉和一条肾静脉的标准解剖结构。最常见的变异包括：一条动脉配两条静脉、一条动脉配三条静脉、两条动脉配一条静脉，以及两条动脉配两条静脉。46%的猪具有双侧典型解剖结构，而22%的猪左侧有一个异位肾，14%的猪右侧有一个异位肾，19%的猪双侧肾脏均异位。

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医学

临床前大型动物模型中的肾脏获取

在本视频中，我们展示了将人源前列腺癌组织移植物植入免疫缺陷小鼠肾包膜的技术。该技术可用于评估肿瘤进展并开发新的治疗策略。...

肾包膜肿瘤异种移植：一种用于评估前列腺癌发生的实验动物模型构建技术

本视频展示了肾切除术，即外科手术中切除一侧肾脏及其相连的输尿管节段。供应和引流肾脏的血管将被结扎并切断。切除的肾脏可用于移植手术。...

在猪模型中进行肾切除术：一种用于获取移植用猪肾移植物的外科手术程序

本视频介绍了在猪模型中进行的原位肾自体移植。该手术过程涉及将动物的肾脏移植物移植回其原始解剖位置。该模型可用于研究人类终末期肾病的新治疗方法。...

原位猪肾移植：一种在猪模型中移植肾移植物的技术

本文介绍了一种研究排斥反应免疫学机制的实验方案。所采用的手术模型具有手术时间短、操作步骤简洁的特点。根据供体与受体小鼠品系的组合不同，移植肾脏可能出现急性细胞排斥反应或慢性移植物损伤，后者以间质纤维化和肾小管萎缩为特征。...

小鼠肾移植：同种异体移植物排斥模型

本文的目的是描述在小鼠中进行肾移植手术所需的操作步骤，特别关注动脉吻合的细节。...

小鼠肾脏移植技术

猪的器官移植模型为研究器官保存机制提供了重要平台。本文描述了一种异位猪自体肾移植模型，可用于探索改善边缘性肾移植物移植效果的新方法。...

猪模型中的异位自体肾移植：逐步操作方案

大型动物模型在临床前移植研究中发挥着至关重要的作用。由于该模型与临床实际情况具有高度相似性，本文所述的猪同种原位肾自体移植模型为器官保存技术和治疗干预措施的体内测试提供了理想的实验平台。...

使用24小时器官保存和连续遥测技术在猪模型中进行原位肾自体移植

本研究介绍了一种高度可重复的猪肾缺血-再灌注损伤大动物模型，通过经皮双侧肾动脉球囊导管临时阻断60分钟，随后再灌注24小时建立。...

通过暂时性双侧肾动脉阻断建立急性肾损伤的大动物模型

本论文介绍了一种在大鼠模型中通过腹正中切口行锐性双极切除术进行5/6肾切除的标准化操作方案，旨在通过精确的方法学手段减少肾实质，从而诱导肾功能不全状态，并最大限度降低技术误差风险。...

通过中线剖腹术采用锐性双极切除法在大鼠中进行5/6肾切除术

用于移植的鼠肾常温机械灌注

学习在猪模型中进行肾脏获取的标准化手术流程，用于器官移植前保存技术研究。该方法采用正中开腹术获取肾脏，结合新型冷冻保护剂延长器官保存时间，为临床前移植研究提供可靠平台。

大型动物临床前模型中的肾脏获取

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