胰腺导管细胞系中pH改变条件下的癌基因表达分析

在 AIG 医院，我们研究了胰腺导管分泌减少和 pH 值降低如何影响胰腺导管细胞中的基因表达，尤其关注癌基因，以探索细胞对酸性微环境适应的可能性。这一研究面临的挑战在于胰腺肿瘤的异质性，这使得治疗和实验方法均变得复杂。因此，我们在降低的 pH 条件下对胰腺导管细胞进行了 RNAC 分析，发现三种癌基因的表达增加，凸显了酸性环境与胰腺导管细胞中癌基因表达之间的潜在关联。

本研究揭示了在低pH条件下癌基因的表达情况，该体系有助于推动我们在炎症条件下对胰腺导管腺癌的研究。因此，本研究的未来方向是评估在慢性胰腺炎等炎症条件下，癌基因表达升高在肿瘤发生中的作用。首先，获取人正常胰腺导管细胞系。

将细胞在37摄氏度的水浴中解冻。使用注射器滤器过滤新配制的完全培养基。向一个新的15毫升锥形管中加入6毫升完全培养基。

然后将解冻的细胞悬液转移至离心管中并充分混匀。在1,800 G条件下离心6分钟。弃去上清液，向沉淀中加入1毫升培养基，轻轻混匀。

接下来，向一个60毫米的培养皿中加入4毫升完全培养基。然后将细胞悬液逐滴吹打加入培养瓶中。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养细胞。

为调节培养基的pH值，首先配制100毫升0.5摩尔的磷酸钠缓冲液储备液，其pH值分别为6.0、6.5和7.0。使用pH计检测pH值，并用1摩尔盐酸或1摩尔氢氧化钠进行调节。随后，在超净工作台中使用0.45微米注射器滤器对缓冲液进行过滤除菌。

接下来，将20毫升无菌的0.5摩尔磷酸钠缓冲液（对应pH值）加入80毫升培养基中，以制备不同pH值的培养基。将pH值调整后的培养基加入至汇合度为85%至90%的人胰腺导管细胞中。在亮场显微镜下每间隔1小时观察一次细胞形态变化，持续观察6小时。

为了从培养物中分离RNA，首先吸除培养基，并用一毫升PBS冲洗细胞。将60毫米培养皿置于冰上，然后向60毫米培养皿中加入一毫升PBS，用细胞刮棒刮取细胞。接着将悬液转移至新的离心管中。

在8,000 G下离心10分钟，弃去上清液。接着，向沉淀中加入600微升含有β-巯基乙醇的裂解缓冲液。在冰上反复吹打悬浮液5至10分钟。

向裂解液中加入等体积的70%乙醇，用移液器吹打悬浮液以充分混匀。将溶液转移至硅胶膜离心柱中。然后在8,000 G以上离心30秒，弃去滤过液。

接下来，向样品中加入 500 µL 洗涤缓冲液，再次离心。将空管在超过 8,000 G 的条件下离心一分钟。最后，向吸附柱中加入 30 至 50 µL 无核酸酶的水。室温孵育五分钟后，以高于 8,000 G 的转速再次离心吸附柱五分钟。

与在正常培养基中维持的细胞相比，在酸性培养基中观察到细胞大小显著减小以及可延伸细胞的收缩。细胞死亡的最显著变化发生在孵育6小时后，22小时时细胞数量进一步减少，并出现细胞应激迹象。在pH 6.5时上调基因数量最多，达148个基因，其次为pH 7时的109个基因和pH 6时的90个基因。

在pH 6时，下调基因较少，为20个；在pH 6.5时为14个；在pH 7时为23个。三个癌基因LCK、FGR和ASAP3在所有测试的pH水平下均上调，提示其在酸性条件下细胞增殖中可能发挥作用。