从瘦型与肥胖型小鼠中分离和培养原代小鼠脂肪细胞

我们的研究重点是探究来自不同脂肪组织部位和饮食条件下的成熟脂肪细胞的功能。我们特别关注成熟脂肪细胞如何与周围细胞进行通讯，以及这种细胞间相互作用如何影响疾病进展，并在肥胖状态下发生改变。成熟脂肪细胞体积较大且结构脆弱，这使得常用的细胞分离方法（如流式细胞分选）难以有效应用。

此外，在脂肪组织中常发现高水平的游离脂质，这些游离脂质对成熟脂肪细胞具有毒性，使其维持培养变得复杂。与依赖前脂肪细胞体外分化的常用方法不同，本方案使我们能够研究在体外分离的脂肪细胞，这些细胞在功能和转录水平上均类似于体内脂肪细胞。这一点尤为重要，因为脂肪细胞在不同脂肪储存部位以及不同饮食条件下存在显著差异。

该方案可高效分离出与成熟脂肪细胞相似的细胞，且易于扩大规模。本方案包含针对不同性别及不同饮食条件小鼠的脂肪细胞分离优化调整步骤。分离后的脂肪细胞可根据需要进行培养、成像或其他实验应用。

首先，通过在每1毫升胶原酶溶液中加入0.00017克DNase来配制含有DNase的胶原酶溶液，并涡旋混合物以确保充分混匀。使用剃须刀片将分离的小鼠脂肪组织切碎，直至其呈现均一状态。然后将切碎的组织转移至无菌的50毫升锥形管中。

将配制好的胶原酶和DNase溶液加入剪碎的脂肪组织中，最大速度涡旋振荡7至10秒，以充分混匀各组分。然后将50毫升锥形管水平置于摇床中，设置转速为220 RPM、温度为37°C，振荡消化10分钟。孵育结束后取出试管，涡旋振荡5秒，并检查样品状态。

现在使用血清移液管将消化后的组织通过滤网转移至一个新的无菌50毫升锥形管中。加入与组织和胶原酶溶液体积相等的胎牛血清，通过滤网进入同一锥形管，以中和胶原酶。按照此处所示表格中指定的温度，在300 ×g条件下离心3分钟。

然后使用200微升移液器小心弃去上层游离脂质。接着，用剪去尖端的P1000移液器将成熟脂肪细胞转移至预先准备好的含有10毫升培养基的15毫升离心管中。轻轻倒置含有成熟脂肪细胞的15毫升离心管3到5次，直至白色层在培养基中均匀分散。

静置试管10分钟后，在先前确定的温度下离心，以进一步分离各层。随后，使用移液器弃去上层游离脂质。现在，将21号针头连接至5毫升注射器上，小心地将针头沿试管边缘滑入，直至针头底部低于成熟脂肪细胞层的位置。

然后缓慢抽吸注射器，以移除培养基及任何细胞碎片。轻柔地向试管中加入 10 毫升培养基。使用加样枪的凝胶上样枪头，将枪头沿试管边缘滑下，从成熟脂肪细胞层下方移除残留的培养基。

然后以 100 G 离心细胞 1 分钟。使用移液器去除游离脂质。使用加样枪头去除脂肪细胞下方的培养基。

从经组织培养处理的24孔板中取出细胞培养小室，将其膜面朝上放置在生物安全柜表面。向板中交替的孔内加入温热的培养基。使用剪切过的P200移液枪头，将30微升浓缩的成熟脂肪细胞转移至Transwell小室的顶部。

然后小心取出Transwell小室，将其倒置，并放入已预加培养基的24孔板孔中。为更换孔中的培养基，需固定住Transwell小室，使用P200移液器通过小室侧面的小孔吸取旧培养基。更换培养基时，在保持Transwell小室位置不变的同时，沿孔壁缓慢加入1毫升新鲜培养基。