Name: 从瘦和肥胖小鼠中分离和培养原代小鼠脂肪细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-24T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 34 s
Description: 了解使用胶原酶和DNase从瘦和肥胖小鼠中分离原代成熟脂肪细胞的方法。该方案适用于不同饮食条件和性别的可扩展研究，支持体外培养、成像和功能分析，为肥胖及代谢疾病研究提供可靠模型。

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作者希望感谢5 For The Fight和Huntsman癌症研究所（KIH）、癌症研究V基金会（KIH）以及DK133455（KIH）提供的资助支持。本方案示意图使用Biorender绘制。此外，作者还要感谢Stephanie Giagnocavo和犹他大学细胞成像中心在成像方面的帮助，以及Mark Lee对稿件提出的反馈意见。

所有所述动物实验均经犹他大学动物使用与护理委员会批准。本方案已针对分离8至16周龄、体重在20至45克之间的C57BL/6雄性和雌性小鼠的成熟脂肪细胞进行了优化。本研究中所用试剂与设备的详细信息见于 材料表.
1. 溶液配制
<ol>
	<li>配制胶原酶缓冲液。加入100 mg胶原酶粉末、1 mL 1 M HEPES缓冲液、500 µL 100x P188、50 µL 1 M CaCl2、0.05 g BSA以及48.45 mL Medium 199。将溶液经无菌滤膜过滤，分装后于-20 °C保存。</li>
	<li>制备细胞培养基。将500 mL DMEM、50 mL FBS、5 mL 青霉素-链霉素溶液和5 mL L-谷氨酰胺补充剂混合均匀。</li>
</ol>
2. 小鼠白色脂肪组织库的采集
<ol>
	<li>根据不同的脂肪库和实验条件，为每组准备一个含 200 µL HBSS 的 1 x 10 cm 培养皿，并置于冰上。</li>
	<li>从动物房取出实验动物，按照机构动物护理与使用委员会的指南对小鼠实施安乐死。本实验中，在深度麻醉下通过颈椎脱位法处死动物。</li>
	<li>如需记录，称量并记录每只小鼠的体重。</li>
	<li>用 70% 乙醇喷洒小鼠体表进行消毒。</li>
	<li>从小鼠体内取出相应的脂肪垫18,19。 
	注意：在将组织放入培养皿前，应小心去除皮下脂肪库中的淋巴结。</li>
	<li>称量每一块脂肪组织，并记录其重量。</li>
	<li>将脂肪垫置于预先准备好的、放置在冰上的 10 cm 培养皿中。</li>
</ol>
3. 白色脂肪组织外植体的制备
注意：此步骤为可选步骤。
<ol>
	<li>开始解剖前至少 12 小时，将基底膜基质（Matrigel）在 4 °C 冰上解冻，并将一盒无菌 200 µL 吸头置于 4 °C 冷却。</li>
	<li>使用预冷的吸头，将 80 µL 基底膜基质加入 24 孔细胞培养板每孔的中央，形成穹顶状结构（图 1A）。将培养板放入培养箱（37 °C，5% CO2）中孵育 30 分钟，使基质部分凝固。</li>
	<li>准备组织：使用无菌解剖剪刀，从每个样品中称取 0.1 g 组织，置于冰上的 PBS 中。</li>
	<li>用无菌镊子将预先称重的组织嵌入部分凝固的&#160;基质穹顶中。在嵌入的组织上方再加入 30 µL 基底膜基质。将培养板放回培养箱孵育 30 分钟，使组织在基底膜基质中固定。 
	注意：将组织嵌入基底膜基质中至关重要，可确保组织保留在培养体系中而不发生漂浮，从而维持组织的健康状态和质量（图 1B）。</li>
	<li>向每孔加入 1 mL 生长培养基（含 10% FBS 的 DMEM），然后放回培养箱中继续培养。</li>
</ol>
4. 胶原酶处理
<ol>
	<li>计算所需胶原酶溶液的用量。参见表1。</li>
	<li>配制含有DNase的胶原酶溶液。每1 mL胶原酶溶液中加入0.00017 g DNase。涡旋混匀。</li>
	<li>使用剃刀将分离的脂肪组织切碎，直至组织呈现均一状态（图2A）。将切碎的组织转移至无菌的50 mL锥形管中。 
	注意：切勿过度切碎。当组织呈现均一且呈糊状时，切碎即已完成。切碎不足的组织呈现块状且不均一，而过度切碎会导致游离脂质释放（图2B）。</li>
	<li>根据步骤4.1计算的体积，将配制好的胶原酶和DNase溶液加入切碎的脂肪组织中。以最大速度涡旋震荡7-10秒，充分混匀。将50 mL锥形管水平放置于摇床中，设置转速为220 rpm，温度为37 °C。</li>
	<li>在摇床上孵育震荡10分钟，然后涡旋5秒并检查样品。完全消化的样品应呈现均一状态，无可见团块或组织碎片。若样品未完全消化，继续在摇床上进行消化，每2分钟检查一次（图2C）。 
	注意：切勿过度消化。在胶原酶溶液中孵育时间过长可能导致脂肪细胞破裂并释放脂质。</li>
	<li>使用血清移液管将消化后的组织经筛网转移至新的50 mL锥形管中。加入与组织体积加胶原酶溶液体积相等的FBS，通过筛网进入锥形管，以中和胶原酶。 
	注意：过滤后会有少量组织残留在筛网中。</li>
</ol>
5. 组织洗涤
注意：所有以下步骤均须在无菌组织培养罩内完成。
<ol>
	<li>为每种条件准备一个含有 10 mL 温热培养基的 15 mL 离心管。</li>
	<li>将步骤 4.6 中的离心管在 表 1 中指定的温度下以 300 × g 离心 3 分钟。 
	注意：离心温度需根据分离脂肪组织所用小鼠的性别进行调整；这些温度在 表 1 中提供。</li>
	<li>确保离心后组织分为四层（图 3A）。 
	注意：最上层为游离脂质，第二层为成熟脂肪细胞层，第三层为胶原酶和胎牛血清（FBS），第四层为基质血管组分（SVF），会沉淀至管底20,21。</li>
	<li>使用 200 µL 移液器小心弃去最上层的游离脂质。</li>
	<li>去除上层后，使用剪去底部的 p1000 移液器将成熟脂肪细胞转移至已准备好的含 10 mL 生长培养基的 15 mL 离心管中（图 3B）。
	<ol>
		<li>可选：如需分离原代脂肪细胞前体细胞（APCs），将离心管再次以 300 × g 离心 10 分钟。随后参照 Liu 等22、Cho 等23 或类似方法进行脂肪细胞前体细胞的分离。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>轻轻倒置含成熟脂肪细胞的 15 mL 离心管 3–5 次，直至白色层在培养基中均匀分散。</li>
	<li>将离心管直立静置 10 分钟，温度按 表 1 所示设定，以使脂肪细胞层与培养基层充分分离。</li>
	<li>静置 10 分钟后，在室温下以 100 × g 离心 1 分钟，进一步促进各层分离。离心后样品将再次分为四层，如 图 3A 所示。</li>
	<li>使用移液器移除并弃去最上层的游离脂质。</li>
	<li>将连接 5 mL 注射器的 21 G 针头沿管壁缓慢插入，直至&#160;针头底部完全脱离成熟脂肪细胞层（图 3C）。确保针头上端和注射器底部不扰动成熟脂肪细胞层。</li>
	<li>缓慢抽拉注射器，以移除培养基及任何细胞碎片。 
	注意：在移除培养基过程中，确保针尖始终不接触成熟脂肪细胞层。</li>
	<li>向每个离心管中轻柔加入 10 mL 培养基。</li>
	<li>重复步骤 5.6–5.11，不要额外添加更多培养基。</li>
	<li>使用加样枪头，将枪头沿管壁滑下，移除成熟脂肪细胞层下方残留的培养基。</li>
</ol>
6. 包装
<ol>
	<li>在 表1 所示温度下，以 100 x g 离心细胞 1 分钟。使用移液器去除游离脂质（细胞上层的透明油层）。使用加样枪头去除脂肪细胞下方的培养基。注意尽量减少对脂肪细胞层的扰动（图4）。</li>
	<li>重复步骤 6.1，直至完全去除所有培养基和游离脂质（通常需 3–5 次）。细胞沉淀应呈白色，细胞上方无可见游离脂质，细胞下方无培养基残留（图4）。</li>
</ol>
7. 铺板与功能检测
<ol>
	<li>将成熟脂肪细胞接种进行细胞培养
	<ol>
		<li>从组织培养处理过的24孔板中取出细胞培养小室，将其膜面朝上放置在生物安全柜表面。</li>
		<li>向板中交替的孔内加入1 mL预热的培养基。</li>
		<li>使用剪切过的p200移液枪头，从步骤6.2中取30 µL紧密聚集的成熟脂肪细胞，将其置于Transwell小室的顶部（图5A，B）。</li>
		<li>小心拿起并翻转Transwell小室，将其放入24孔板中已预加培养基的孔中（图5A）。将板小心放入设定为37 °C、5% CO2的培养箱中。 
		注：从上方观察时，正确聚集的脂肪细胞应形成一层不透明的细胞层，无可见的游离透明脂滴（图5C）。</li>
		<li>在最多14天内，每2–7天更换一次成熟脂肪细胞的培养基。
		<ol>
			<li>更换培养基时，固定住Transwell小室，使用p200移液器通过Transwell小室侧面的小孔小心吸出培养基（图5D）。</li>
			<li>吸出培养基后，在仍固定Transwell小室的情况下，缓慢沿孔壁加入1 mL新鲜培养基。 
			注：添加和移除培养基时务必缓慢操作。若更换培养基过快，脂肪细胞容易从膜上脱落。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脂解实验
	<ol>
		<li>按照步骤3.4所述接种脂肪组织外植体，或按照步骤7.1所述接种成熟脂肪细胞。 
		注：在进行脂解实验前，细胞或组织必须在不含酚红的培养基中培养至少24小时。</li>
		<li>溶液配制：通过将5 g BSA溶解于100 mL DMEM（不含酚红）中，配制5% BSA的DMEM溶液。轻轻颠倒混匀，直至BSA完全溶解。
		<ol>
			<li>配制对照组和刺激组的工作液。对照组培养基为5% BSA DMEM培养基加入等量溶剂；刺激组培养基为5% BSA DMEM培养基加入5 µM CL-316,243。使用前将对照组和刺激组培养基预热至37 °C。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>吸除各孔中的培养基，用1 mL预热的DPBS洗涤一次，然后每孔加入500 µL对照组或刺激组培养基。置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育。</li>
		<li>在脂解实验开始后1 h、2 h、4 h和24 h，分别从每孔中收集100 µL培养基至微量离心管中，并立即补充100 µL相应的对照组或刺激组培养基。 
		注：样品可在此时储存于-20 °C。</li>
		<li>使用市售的游离甘油检测试剂盒（见材料表）或类似产品进行甘油比色法检测。
		<ol>
			<li>按照试剂盒说明书配制所需试剂。</li>
			<li>将样品解冻，并通过移液轻轻混匀。</li>
			<li>使用甘油标准品溶液进行7点、2倍系列稀释，制备标准曲线。</li>
			<li>向透明底96孔板的每个孔中加入25 µL样品或标准品。</li>
			<li>向每孔含样品或标准品溶液的孔中加入100 µL游离甘油检测试剂。</li>
			<li>室温孵育15分钟，然后在540 nm波长下读取吸光度（图6A–D）。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>成像
	<ol>
		<li>准备成像载玻片。取下每个成像间隔垫的背衬纸层，将其粘贴到载玻片上。每张载玻片上可并排放置两个成像间隔垫。</li>
		<li>使用剪切过的200 µL移液枪头，从步骤6.2中取30 µL紧密聚集的脂肪细胞转移至微量离心管中。</li>
		<li>配制染色混合液。按每样本200 µL量，在PBS中配制含质膜染料（5 µg/mL）和Hoechst（4.5 µg/mL）的染色溶液。将染色液加入样本中并轻轻振荡混匀。</li>
		<li>室温避光染色30分钟。</li>
		<li>染色完成后，洗涤样本。向每个样本中加入500 µL PBS，轻轻振荡混匀，静置5分钟。以100 × g离心1分钟，然后用加样枪头从细胞下方吸除上清液。</li>
		<li>准备载玻片。揭去成像间隔垫顶部的透明塑料膜，暴露出粘性层。</li>
		<li>向含有染色后脂肪细胞的离心管中加入500 µL PBS，轻轻混匀。</li>
		<li>迅速操作，避免成熟脂肪细胞上浮至液面，使用剪切过的p200移液枪头将35 µL脂肪细胞悬液加入成像载玻片的间隔垫内。</li>
		<li>盖上盖玻片。</li>
		<li>立即进行成像（图6C）。延迟成像可能导致膜标记物扩散。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Culturing Murine Adipocytes and Explants for Functional and Imaging Studies

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

原代脂肪细胞因其容易破裂且体积较大，难以分离和培养，其尺寸也限制了流式细胞术等常用原代细胞分离工具的应用。本文所述方案可获得纯净且具有功能的成熟脂肪细胞，适用于多种下游实验。重要的是，该方案能够将成熟脂肪细胞与其他细胞碎片及游离脂质层有效分离，从而实现高效的成像、培养以及脂解活性检测。本方案可便捷地与已发表的基质血管组分及脂肪前体细胞（APCs）分离方案22,23联合使用。此外，本方案还详细描述了脂肪组织全组织外植体的制备与培养方法，可用于脂解活性检测及全脂肪组织分泌因子收集等下游应用。
关键步骤包括适当的组织切碎、消化以及游离脂质层的去除。为确保切碎充分，必须在整个过程中密切观察组织的外观。达到理想切碎程度所需的时间和操作强度会因脂肪组织来源、饮食干预（如高脂饮食）以及研究人员的不同而有所差异。如有必要，可采用其他切碎工具（如剪刀），但本文未对此进行探讨。值得注意的是，应避免过度切碎，因为这会导致脂肪细胞破裂，不仅会降低即刻得率，还会因游离脂质层对剩余脂肪细胞的有害影响，进而降低总得率和脂肪细胞质量。与切碎类似，适当的消化效果也取决于脂肪组织来源、饮食干预、小鼠年龄等因素。在胶原酶中添加DNase有助于防止细胞碎片引起的脂肪细胞聚集。因此，组织的消化时间具有高度可变性。文中提供的消化时间估计值仅作为参考，详见表1。然而，确保组织充分消化的最佳方法是在操作过程中以及按照实验方案所述，通过肉眼观察组织状态进行判断。根据性别建议的表1中所列不同离心和洗涤温度，对于将成熟脂肪细胞与游离脂质层以及其他细胞碎片和基质血管组分（SVF）有效分离至关重要；若使用其他温度，可能导致脂肪细胞因聚集或破裂而丢失。
每一步骤中彻底去除游离脂质层至关重要，若未能做到，将对后续的细胞接种、成像以及脂解实验造成不利影响。此外，若在整个操作过程中持续存在游离脂质层，将因脂毒性导致脂肪细胞大量死亡，显著降低最终细胞得率和质量。尽管通常希望最大限度地提高成熟脂肪细胞的分离效率，但即使以损失部分成熟脂肪细胞为代价，去除游离脂质层仍可在整个实验方案结束时显著提高成熟脂肪细胞的总体得率。
该实验步骤的局限性包括样本数量。由于更换培养基和去除游离脂质层的过程较为繁琐且耗时，通常每次处理的样本数量限制在六个以内。若处理显著更多的样本，会导致原代脂肪细胞暴露于游离脂质中的时间过长，从而降低总体细胞得率。然而，增加操作人员可能有助于提高可处理的样本数量。从组织剪切至功能检测之间的时间至关重要，因为培养基和游离脂质层去除过程中的过度延迟会导致更多成熟脂肪细胞破裂。此外，本方案在分离成熟脂肪细胞亚群方面的能力也存在局限。
目前研究成熟脂肪细胞的方法主要依赖于脂肪前体细胞（APCs）的分离以及后续的 离体 这些细胞的分化。其他方法，包括器官芯片模型和Transwell共培养，已开始被开发18,24。然而，这些 离体 已发现分化的脂肪细胞在转录水平和形态上均不同于脂肪组织中的成熟脂肪细胞17在形态学上， 离体 分化后的脂肪细胞为多房性，而 体内 分离的脂肪细胞为单泡性。本方案在既往报道的基础上进行了修改和优化17,25 与需要至少 5 g 脂肪组织的其他方案相比，仅需 0.5 g 脂肪组织即可成功分离和培养成熟的脂肪细胞25 最后，本研究旨在直观展示该实验方案中关键步骤的成功完成情况 取而代之 具体时间、离心温度和胶原酶用量，尽管文中已包含相关指南 表1这些参数需要根据脂肪组织库、动物性别和肥胖程度等因素进行调整，这些因素均可能影响本方案中成熟脂肪细胞消化和纯分离的效率。
整个操作过程需要3至4小时，具体时间取决于合并的小鼠数量以及单独的脂肪组织样本数量。预计对成熟脂肪细胞进行培养并评估其功能作用的能力，将为脂肪细胞生物学本身（例如代谢、营养利用和示踪）以及脂肪细胞与其他细胞类型（如抗原呈递细胞、癌细胞和免疫系统细胞）之间相互作用的研究带来多种后续应用。

预计到2030年，美国成年人肥胖率将达到50%1，因此迫切需要更深入地了解肥胖对细胞和生理功能的影响。肥胖的特征是能量摄入失衡，导致白色脂肪组织因脂肪储存增加而扩张。脂肪组织的扩张既可通过生成新的脂肪细胞（增生）实现，也可通过现有脂肪细胞体积增大（肥大）实现。尽管这两种过程均导致脂肪组织扩张，但以肥大方式扩张通常伴随着代谢健康状况恶化以及代谢性疾病发生率升高2,3。更深入理解脂肪组织的复杂性，将有助于揭示调控代谢紊乱及其他与肥胖相关的共病（如2型糖尿病和癌症）的分子机制。
脂肪组织长期以来因其在能量储存和体温调节中的作用而受到重视。然而，近年来，脂肪组织还被发现是一种重要的代谢信号组织，能够分泌代谢物、脂质和肽类4,5。这些由脂肪组织产生的分子被称为脂肪因子（adipokines），可在局部和全身发挥信号传导作用，调节能量稳态、免疫功能、血管动态等多种生理过程5,6,7。成熟脂肪细胞约占脂肪组织中细胞总数的50%，并构成了脂肪组织体积的绝大部分8。重要的是，研究发现脂肪细胞包含多个亚群9,10。因此，脂肪细胞前体细胞会根据性别和脂肪组织储存部位等因素，生成不同类型的成熟脂肪细胞。这些成熟脂肪细胞还可因饮食变化和肥胖状态而进一步发生改变，形成在转录水平上具有差异并表达不同旁分泌特征的脂肪细胞亚群9,11,12,13,14,15,16。尽管脂肪细胞具有复杂的异质性和重要的生理功能，但目前仍缺乏有效分离和培养成熟脂肪细胞的技术，这成为深入研究这类细胞的一大障碍。
目前用于分离成熟脂肪细胞的方法包括从脂肪细胞前体细胞（APCs）诱导分化、荧光激活细胞分选以及基于离心的技术，但这些方法均存在各自的局限性。体外或离体外将APCs分化为成熟脂肪细胞的方法被广泛用于获得成熟脂肪细胞。然而，这些人工诱导分化的细胞呈多房脂滴结构，含有多个小脂滴，而非体内成熟脂肪细胞典型的单房结构（即仅含一个大脂滴）17。此外，研究发现，体外分化的细胞在转录水平上与体内分离的成熟脂肪细胞存在显著差异17。尤为重要的是，体外分化无法反映瘦型与肥胖型脂肪细胞之间的差异。荧光激活细胞分选（FACS）常用于从组织中分离特定细胞群体；然而，由于成熟脂肪细胞体积较大且细胞膜脆弱，在FACS过程中容易破裂，因此该方法在分离成熟脂肪细胞方面效率较低。其他现有方案则会导致大量游离脂质的积累，这些脂质随时间推移可能对培养中的成熟脂肪细胞产生毒性作用。
本文介绍了一种从小鼠白色脂肪组织中分离成熟脂肪细胞的实验方案。该方案改编自Harms等人最初建立的成熟脂肪细胞聚集体培养方案17；然而，本文所述的基于离心的方法使用常规实验室设备，能够从小量（约0.5 g）脂肪组织中高效分离脂肪细胞。该系统易于调整，文中还包括了从小鼠（雄性和雌性）、内脏和皮下脂肪库以及不同饮食条件下分离成熟小鼠脂肪细胞的优化方法。

<table><tbody><tr><td>100倍浓度泊洛沙姆188溶液</td><td>Sigma</td><td>P5556-100mL</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 圆锥形离心管</td><td>Cellstar</td><td>188261</td><td></td></tr><tr><td>21 G 针头</td><td>BD</td><td>305165</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 注射器</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 圆锥形离心管</td><td>Cellstar</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>6.5 mm Transwell 小室，带 0.4 &amp;micro;m 孔径聚碳酸酯膜插入物</td><td>Corning</td><td>3413</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>C1016-500gm</td><td></td></tr><tr><td>CellMask 细胞膜染料</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10045</td><td></td></tr><tr><td>CL 316243 二钠盐</td><td>Tocris</td><td>1499</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶粉末</td><td>Sigma</td><td>C6885</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 培养基</td><td>Gibco</td><td>11995-040</td><td></td></tr><tr><td>无酚红 DMEM 培养基</td><td>Gibco</td><td>A14430-01</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Gibco</td><td>A56708-01</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 组织病理 Superfrost Plus 金涂层载玻片</td><td>Fisher scientific</td><td>1518848</td><td></td></tr><tr><td>凝胶上样移液吸头</td><td>Fisher scientific</td><td>02-707-181</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX 添加剂</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>甘油检测试剂盒</td><td>Abcam</td><td>AB133130</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' 平衡盐溶液（HBSS）</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 缓冲液</td><td>Sigma</td><td>83264-100ml-F</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Megafuge 16R 离心机</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td>75004271</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342 溶液</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>恒温小型摇床</td><td>VWR</td><td>12620-942</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199 培养基</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4530</td><td></td></tr><tr><td>显微镜盖玻片</td><td>VWR</td><td>16004-302</td><td></td></tr><tr><td>PBS 缓冲液</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素双抗溶液</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>SecureSeal 成像间隔垫片</td><td>Grace Biolabs</td><td>654006</td><td></td></tr><tr><td>筛网（不锈钢细网鸡尾酒滤网）</td><td>OXO</td><td>3112000</td><td>https://www.oxo.com/steel-fine-mesh-cocktail-strainer-660.html</td></tr></tbody></table>

从瘦型与肥胖型小鼠中分离和培养原代小鼠脂肪细胞

Isolation and Culturing of Primary Murine Adipocytes from Lean and Obese Mice

脂肪组织在体积上主要由成熟的富含脂质的脂肪细胞构成。这些终末分化的细胞在能量储存与动员、体温调节以及内分泌因子的分泌中发挥关键作用。由于热量失衡导致的白色脂肪组织扩张，会引起现有脂肪细胞的体积增大以及由脂肪细胞前体细胞生成新的脂肪细胞。肥胖引起的白色脂肪组织改变（包括对脂肪细胞的影响）与多种共病相关，例如2型糖尿病和13种癌症。研究脂肪细胞如何参与疾病的一大障碍在于难以有效分离并培养成熟的脂肪细胞。本文介绍了一种从雄性和雌性C57BL/6小鼠的皮下和内脏脂肪库中分离瘦型和肥胖型脂肪细胞的实验方案。该方案详细描述了如何将分离得到的原代脂肪细胞在膜状脂肪细胞聚集体系统中培养长达2周，从而支持其在共培养实验、脂解测定中进行功能分析，或通过收集含有脂肪细胞分泌因子的条件培养基进行后续研究。此外，该方案还概述了将脂肪组织外植体在基底膜基质穹顶中进行培养以及对原代分离的脂肪细胞进行成像的方法。重要的是，该方法可与现有的利用荧光激活细胞分选（FACS）技术分离脂肪组织驻留的脂肪细胞&#160;前体细胞的方案相结合。上述一系列方法为研究人员提供了功能研究瘦型与肥胖型、雄性与雌性小鼠脂肪细胞、脂肪细胞前体细胞以及完整脂肪组织的工具。

如图2所示，充分的剪切（图2B）和消化（图2C）对于完整成熟脂肪细胞的分离至关重要。剪切或消化不足会导致成熟脂肪细胞得率降低，原因是脂肪组织与结缔组织未能充分分离。从形态上可观察到，剪切后仍有条状组织残留，胶原酶溶液中可见明显的组织团块。此外，过度剪切或过度消化也会因成熟脂肪细胞破裂而导致得率降低。从形态上看，表现为白色不透明细胞层消失，并出现大量透明的游离脂质层。剪切或消化程度不当均会导致脂肪细胞分离效果不佳。
正确制备和消化脂肪组织将使组织分离为四个明显不同的层次，如图3所示。脂肪细胞破裂并释放游离脂质的情况难以完全避免；然而，充分的剪碎和消化可最大限度地减少脂肪细胞破裂。残留的游离脂质层和培养基将在脂肪细胞离心过程中被去除（图4）。正确地离心收集脂肪细胞对于成熟脂肪细胞的高效分离至关重要。任何残留的游离脂质或培养基都会导致分离效果不佳，并对后续的功能性实验（如细胞接种、脂解实验和细胞成像）产生不利影响。
本方案可获得高纯度的成熟脂肪细胞。可通过细胞成像和脂解活性检测来评估细胞功能，以证明成熟脂肪细胞在分离后以及培养长达两周后仍保持功能。脂解活性检测结果表明，成熟脂肪细胞在β-3肾上腺素能受体刺激后，能够通过释放游离甘油响应细胞信号传导（图6A，B）。该功能在体外培养两周后仍得以保留，且与培养24小时的脂肪组织外植体的脂解活性高度相似（图6C，D）。低质量的脂肪细胞则表现出减弱的脂解能力。分离所得脂肪细胞的成像结果显示，细胞呈圆形、结构完整，为单泡型成熟脂肪细胞，内含一个大的脂滴。低质量的脂肪细胞分离样本则主要显示大量细胞外油滴，提示脂肪细胞已破裂。
<img alt="显示凝胶包埋阶段的静态平衡示意图：最佳状态、部分包埋、脱落状态。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67846/67846fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：脂肪组织外植体的包埋。（A）组织包埋前部分固化的基底膜基质穹顶的图像。（B）组织包埋不当与正确包埋的代表性图像。包埋不当表现为组织部分或完全漂浮于穹顶之上。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67846/67846fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="胶原酶消化过程示意图；在不同酶活性和温度下组织状态的展示。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67846/67846fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：脂肪组织正确剪切与消化的示意图。 （A）组织剪切与消化步骤 4.2–4.6 的示意图。（B）剪切不足、剪切适度及剪切过度的组织代表性图像。剪切不足的组织含有较大块状物，保留了原始形态；剪切过度的组织则出现明显的游离脂质增多，围绕在组织周围，呈现透明油状。（C）消化不足、消化适度及消化过度的组织代表性图像。消化不足的组织在溶液中仍残留整块组织碎片；消化过度的组织则表现出大量游离脂质层，可迅速与溶液分离。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67846/67846fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="脂肪组织分离步骤；示意图、试管分层、注射器提取过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67846/67846fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：消化后脂肪组织各层的分离。（A）第5.3步完成后各层结构的示意图及代表性图像。（B）使用剪切过的移液器吸头从50 mL锥形管中移除成熟脂肪细胞层。（C）将针头和注射器正确放置于成熟脂肪细胞层下方以吸取培养基的技术示意图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67846/67846fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="脂肪细胞分离过程、离心步骤、脂质去除、脂肪细胞纯化示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67846/67846fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 4"> 
图4：成熟脂肪细胞的逐次沉淀过程。 成熟脂肪细胞逐次沉淀过程的连续图像。图中标注了游离脂质层、脂肪细胞层和培养基层。每次离心后，去除游离脂质和培养基。重复此过程，直至离心后不再有培养基或游离脂质与脂肪细胞分离。最后一张图像代表沉淀良好的成熟脂肪细胞。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67846/67846fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="脂滴制备、排列示意图；用于脂滴分析的显微镜装置及最佳排列结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67846/67846fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 5"> 
图 5：成熟脂肪细胞的铺板与培养。（A）成熟脂肪细胞铺板的示意图。使用剪切过的 p200 移液枪头，将紧密排列的脂肪细胞置于细胞培养小室的膜上。随后将小室倒置于预先加入培养基的孔中。（B）成熟脂肪细胞铺板过程的代表性图像，显示剪切的移液枪头将脂肪细胞沉积在 Transwell 小室上。（C）从孔上方观察，正确排列与排列不良的脂肪细胞在 Transwell 上的示意图及代表性图像。排列良好的脂肪细胞呈白色且不透明，而排列不良的脂肪细胞则形成透明的脂滴。（D）更换培养基的技术示意图。使用 p200 移液枪头通过 Transwell 小室侧壁的开口小心吸出培养基。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67846/67846fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="皮下和内脏脂肪细胞随时间释放甘油的图表，细胞膜显微图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67846/67846fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图6"> 
图6：成熟脂肪细胞的成像及脂解实验。（A,B）皮下（A）和内脏（B）成熟脂肪细胞的甘油释放。脂肪细胞从饲喂普通饲料的16周龄C57BL/6雄性小鼠中分离获得。按照步骤7.1所述方法接种30 µL脂肪细胞，并培养1天或10天。用5 µM CL-316,243处理脂肪细胞1小时、2小时和4小时后，收集上清液并检测游离甘油含量。（C,D）皮下（C）和内脏（D）脂肪组织外植体的甘油释放。脂肪组织从饲喂普通饲料的18周龄C57BL/6雌性小鼠中分离获得。按照步骤3.1–3.4所述方法接种0.1 g脂肪组织外植体，并培养24小时。用5 µM CL-316,243处理1小时、2小时和4小时后，收集上清液并检测游离甘油含量。A–D组为三次技术重复（N = 3）。所有数据均表示为均值±标准差。（E）分离获得的皮下和内脏成熟脂肪细胞的代表性图像。脂肪细胞从饲喂普通饲料的16周龄C57BL/6J雄性小鼠中分离获得。脂肪细胞经细胞膜染料（红色）和Hoechst细胞核染料（蓝色）染色。比例尺：50 µm；放大倍数：60倍。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67846/67846fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>性别</td>
			<td>饮食</td>
			<td>脂肪组织部位</td>
			<td>切碎难度</td>
			<td>胶原酶：组织比例</td>
			<td>建议消化时间（分钟）</td>
			<td>离心温度</td>
			<td>洗涤温度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">雌性</td>
			<td rowspan="2">普通饲料</td>
			<td>皮下</td>
			<td>难</td>
			<td>2:1</td>
			<td>12</td>
			<td>RT</td>
			<td>37 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>内脏</td>
			<td>中等</td>
			<td>1:1</td>
			<td>8</td>
			<td>RT</td>
			<td>37 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">高脂饮食</td>
			<td>皮下</td>
			<td>容易</td>
			<td>1:1</td>
			<td>8</td>
			<td>RT</td>
			<td>37 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>内脏</td>
			<td>容易</td>
			<td>1:1</td>
			<td>8</td>
			<td>RT</td>
			<td>37 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">雄性</td>
			<td rowspan="2">普通饲料</td>
			<td>皮下</td>
			<td>难</td>
			<td>2:1</td>
			<td>14</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>内脏</td>
			<td>中等</td>
			<td>1:1</td>
			<td>10</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">高脂饮食</td>
			<td>皮下</td>
			<td>容易</td>
			<td>1:1</td>
			<td>10</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>内脏</td>
			<td>容易</td>
			<td>1:1</td>
			<td>10</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：性别、组织部位及饮食特异性的调整参数。 各组织的剪切难度，相对于其他部位描述为“容易”、“中等”或“困难”。请注意，实际剪切时间会因研究人员和组织的不同而有所差异。胶原酶：组织比例列为第4.1步中配制的胶原酶+DNase溶液的体积（mL）与组织重量（g）之比。消化时间仅为大致估计值，实际消化时间会因剪切程度和组织类型而异。研究人员应根据实验方案中的描述评估消化程度。离心温度和洗涤温度在雄性与雌性小鼠之间有所不同。RT表示室温。

成熟脂肪细胞的尺寸和脆弱性限制了可用于其研究和分离的技术与工具。本文介绍了一种分离成熟小鼠脂肪细胞的方案，该方案可轻松适用于不同的脂肪组织库和小鼠饮食模型。

脂肪组织在体积上主要由成熟的富含脂质的脂肪细胞构成。这些终末分化的细胞在能量储存和……

我们的研究重点是探究来自不同脂肪组织部位和饮食条件下的成熟脂肪细胞的功能。我们特别关注成熟脂肪细胞如何与周围细胞进行通讯，以及这种细胞间相互作用如何影响疾病进展，并在肥胖状态下发生改变。成熟脂肪细胞体积较大且结构脆弱，这使得常用的细胞分离方法（如流式细胞分选）难以有效应用。此外，在脂肪组织中常发现高水平的游离脂质，这些游离脂质对成熟脂肪细胞具有毒性，使其维持培养变得复杂。与依赖前脂肪细胞体外分化的常用方法不同，本方案使我们能够研究在体外分离的脂肪细胞，这些细胞在功能和转录水平上均类似于体内脂肪细胞。这一点尤为重要，因为脂肪细胞在不同脂肪储存部位以及不同饮食条件下存在显著差异。该方案可高效分离出与成熟脂肪细胞相似的细胞，且易于扩大规模。本方案包含针对不同性别及不同饮食条件小鼠的脂肪细胞分离优化调整步骤。分离后的脂肪细胞可根据需要进行培养、成像或其他实验应用。首先，通过在每1毫升胶原酶溶液中加入0.00017克DNase来配制含有DNase的胶原酶溶液，并涡旋混合物以确保充分混匀。使用剃须刀片将分离的小鼠脂肪组织切碎，直至其呈现均一状态。然后将切碎的组织转移至无菌的50毫升锥形管中。将配制好的胶原酶和DNase溶液加入剪碎的脂肪组织中，最大速度涡旋振荡7至10秒，以充分混匀各组分。然后将50毫升锥形管水平置于摇床中，设置转速为220 RPM、温度为37°C，振荡消化10分钟。孵育结束后取出试管，涡旋振荡5秒，并检查样品状态。现在使用血清移液管将消化后的组织通过滤网转移至一个新的无菌50毫升锥形管中。加入与组织和胶原酶溶液体积相等的胎牛血清，通过滤网进入同一锥形管，以中和胶原酶。按照此处所示表格中指定的温度，在300 ×g条件下离心3分钟。然后使用200微升移液器小心弃去上层游离脂质。接着，用剪去尖端的P1000移液器将成熟脂肪细胞转移至预先准备好的含有10毫升培养基的15毫升离心管中。轻轻倒置含有成熟脂肪细胞的15毫升离心管3到5次，直至白色层在培养基中均匀分散。静置试管10分钟后，在先前确定的温度下离心，以进一步分离各层。随后，使用移液器弃去上层游离脂质。现在，将21号针头连接至5毫升注射器上，小心地将针头沿试管边缘滑入，直至针头底部低于成熟脂肪细胞层的位置。然后缓慢抽吸注射器，以移除培养基及任何细胞碎片。轻柔地向试管中加入 10 毫升培养基。使用加样枪的凝胶上样枪头，将枪头沿试管边缘滑下，从成熟脂肪细胞层下方移除残留的培养基。然后以 100 G 离心细胞 1 分钟。使用移液器去除游离脂质。使用加样枪头去除脂肪细胞下方的培养基。从经组织培养处理的24孔板中取出细胞培养小室，将其膜面朝上放置在生物安全柜表面。向板中交替的孔内加入温热的培养基。使用剪切过的P200移液枪头，将30微升浓缩的成熟脂肪细胞转移至Transwell小室的顶部。然后小心取出Transwell小室，将其倒置，并放入已预加培养基的24孔板孔中。为更换孔中的培养基，需固定住Transwell小室，使用P200移液器通过小室侧面的小孔吸取旧培养基。更换培养基时，在保持Transwell小室位置不变的同时，沿孔壁缓慢加入1毫升新鲜培养基。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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