Name: 基于 DNA 张力探针破裂和递送到细胞中的细胞机械型的高通量流式细胞术测量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-13T12:35:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: 了解利用DNA张力探针和流式细胞术测量细胞机械力的高通量方法。该技术通过分析荧光寡核苷酸破裂情况，为T细胞激活和干细胞分化等机制生物学研究提供新工具，有助于推动机械治疗学发展。

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W.R.G. 感谢美国国立卫生研究院（NIH）R35GM119483 项目提供的经费支持。图示示意图使用 Biorender 制作。

1. HUH 的表达与纯化
<ol>
	<li>将约 1.5 µL 浓度为 ~50 ng/µL 的 WDV（± 蛇毒抑素）质粒转化至大肠杆菌（Escherichia coli）中，并在含氨苄青霉素的琼脂平板上培养。</li>
	<li>挑取单菌落接种于 5 mL LB 培养基中，37 °C 过夜培养。</li>
	<li>将过夜培养物接种至 1 L LB 培养基中，培养至 OD600 达到约 0.8。</li>
	<li>将温度降至 18 °C，加入 500 µM 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达，并继续孵育过夜。</li>
	<li>在 3,750 × g 条件下离心 30 分钟收集菌体，用 40 mL 裂解缓冲液（300 mM NaCl，50 mM Tris pH 7.5，1 mM EDTA）重悬菌体沉淀。</li>
	<li>在冰上以 70% 占空比、功率 7 进行 3 次、每次 90 秒的超声破碎裂解细胞；在 4 °C 条件下于 24,000 × g 离心 30 分钟，将上清液转移至新的 50 mL 离心管中。</li>
	<li>取 Ni-NTA 树脂悬液加入 15 mL 圆锥形离心管中（每升培养物使用 1 mL 树脂悬液），在 700 × g 条件下离心 2 分钟后弃去上清液。</li>
	<li>向树脂中加入 6 mL 水，并重复步骤 1.7 的洗涤过程。</li>
	<li>改用洗涤缓冲液（300 mM NaCl，50 mM Tris [pH 7.5]，1 mM EDTA，20 mM 咪唑）重复洗涤两次，每次均弃去上清液；最后用 5 mL 洗涤缓冲液重悬树脂珠。</li>
	<li>将树脂悬液（步骤 1.9）加入已裂解的细胞样品（步骤 1.6）中，充分混匀；在 4 °C 条件下旋转孵育至少 1 小时。 
	注意：在本实验方案后续操作中，切勿让树脂干燥，并收集所有流穿液。</li>
	<li>将混合物倒入 20 mL 层析柱中，收集流穿液；用 4 × 25 mL 洗涤缓冲液洗涤层析柱。</li>
	<li>用 10 mL 洗脱缓冲液（300 mM NaCl，50 mM Tris [pH 7.5]，1 mM EDTA，250 mM 咪唑）洗脱，收集至新的 15 mL 离心管中，分别收集初段和末段洗脱液（初段洗脱液为前 1 mL，末段洗脱液为最后 1 mL）。</li>
	<li>通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析所有收集的组分，确认 HUH 蛋白在洗脱过程中被成功回收（参见补充图 S1）。为获得最佳结果，建议使用 4–20% 的凝胶，在 35 W 和 200 V 条件下电泳 45 分钟。</li>
	<li>将洗脱所得蛋白加入透析袋中，于 4 °C 在透析缓冲液（与裂解缓冲液相同）中透析过夜。若需去除 HIS 标签，则在将蛋白装入透析袋前，直接向洗脱蛋白中加入不含还原剂的 ULP1 酶。</li>
	<li>次日早晨，按照步骤 1.7–1.9 所述方法准备 Ni-NTA 树脂，并与透析后的蛋白孵育。将蛋白与 Ni-NTA 树脂的混合物倒入层析柱中，收集流穿液；用 10 mL 透析缓冲液洗涤层析柱，并收集所有流穿液。</li>
	<li>按照上述条件进行 SDS-PAGE 分析所收集的组分，确认目标蛋白的存在，并使用截留分子量为 10 kDa 的 15 mL 超滤离心管浓缩至所需浓度（参见补充图 S1）。 
	注意：理想的最终蛋白浓度应在 40 µM 至 100 µM 之间。</li>
</ol>
2. RAD-TGT 的制备
<ol>
	<li>以锚链（带淬灭基团）与配体链（带荧光基团）1.1:1 的摩尔比，在终浓度为 40 µM 配体链的溶液中配制双链，溶液组成为 10 mM Tris（pH 7.5）、50 mM NaCl 和 1 mM EDTA。</li>
	<li>在 98 °C 孵育 5 分钟后，于室温冷却 1 小时以完成退火；避光操作。 
	注意：低体积样品容易蒸发，且难以完全回收。建议制备比所需量更多的反应体系。</li>
	<li>将退火后的双链与 HUH 进行反应（退火时以丰度较低的链浓度为准，此处为配体链），双链与 HUH 按 1:2 的摩尔比混合，终浓度为 10 µM 双链和 20 µM HUH，反应缓冲液含 1 mM MnCl2、50 mM HEPES（pH 8）、50 mM NaCl。</li>
	<li>在热循环仪或避光加热块中于 37°C 孵育反应 30 分钟。孵育结束后，从加热设备中取出，使用台式小型离心机离心收集已组装完成的 TGTs。可立即进行后续板式实验，或避光保存于 4 °C。</li>
</ol>
3. 表面准备
<ol>
	<li>打开96孔玻璃底板后，立即用粘性PCR板密封膜覆盖所有孔，以保存未使用的孔供后续使用。使用剃刀刀片切去目标孔（建议选择非边缘孔）上方的密封膜，并向目标孔中加入100 µL冷PBS。 
	注意：一旦向孔中加入液体，切勿让孔干燥。若发生干燥，生物分子会非特异性吸附至表面，从而对数据产生负面影响。应始终保持孔内有100 µL的过量液体，以防止任何干燥。</li>
	<li>向孔中加入200 µL冷PBS，轻轻吹打混匀2–5次，然后移除200 µL PBS。重复此操作，共进行三次洗涤。 
	注意：向孔中加液或移液时，应将移液器吸头以45°角靠在孔壁边缘，避免扰动孔底表面。除接种细胞外，所有操作均应遵循此方法。</li>
	<li>对于实验孔，配制含0.1 mg/mL生物素化BSA的PBS溶液，并向目标孔中加入80 µL该溶液。对于对照孔，配制相同溶液并额外添加18.75 µg/mL纤连蛋白，同样向相应孔中加入80 µL。轻轻吹打混匀所有使用孔，盖上盖子后用密封膜包覆。室温孵育1小时。</li>
	<li>从孔中移除80 µL液体，并重复步骤3.2进行洗涤。随后以与步骤3.3相同的方式，向各孔加入80 µL含0.1 mg/mL中性亲和素（neutravidin）的PBS溶液。</li>
	<li>孵育结束后，从孔中移除80 µL液体，并重复步骤3.2。将组装好的TGTs（RAD-TGT制备步骤2）用PBS稀释至0.1 µM，并以与步骤3.3类似的方式向孔中加入80 µL溶液。可选择用粘性密封膜覆盖各孔，避光保存于4 °C，或在实验前避光室温孵育1小时。 
	注意：我们建议将步骤3.5作为暂停点，待次日再继续进行实验。</li>
</ol>
4. RAD-TGT 实验方案
<ol>
	<li>在TGT细胞充分贴壁后，用PBS洗涤孔板3次（参见步骤3.2），随后用无血清培养基洗涤两次。最后一次洗涤后保留培养基。在周边孔中加入200 µL PBS以减少边缘效应，并将板转移至37 °C培养箱中预热。</li>
	<li>取约80%融合度的目标细胞，吸除培养基，加入PBS洗涤一次后吸除。加入适量胰蛋白酶，将培养板置于37 °C细胞培养箱中孵育，直至细胞解离（约5–10分钟）。</li>
	<li>细胞解离后，向培养板中加入原先用于维持细胞生长的完全培养基体积，用血清移液管重悬细胞，并将细胞悬液转移至15 mL锥形管中。</li>
	<li>以300 × g 离心4分钟，吸除上清液，用PBS重悬沉淀。重复离心和吸除步骤，随后用5 mL无血清培养基重悬并再次离心和吸除。最后将细胞重悬于约2 mL无血清培养基中。</li>
	<li>测定重悬细胞的密度，并根据需要调整浓度。 
	注：我们目标为每孔接种约15,000个细胞，因此将细胞调整至150,000个细胞/mL的浓度，以便用100 µL细胞悬液实现每孔15,000个细胞的接种量。
	<ol>
		<li>可选：若需检测药物或其他药理学试剂的作用，可向细胞中加入适当浓度的药物，并将细胞放回培养箱。在进入下一步前，确保有足够的预孵育时间。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从培养箱中取出板（步骤4.1），移除预热板中实验孔内残留的洗涤培养基。用所需培养基洗涤一次。小心地将100 µL重悬细胞液加入目标孔中。将接种后的细胞板转移至培养箱孵育90分钟。 
	注：加样时应将细胞悬液轻柔地加入孔中央，尽量保持移液器垂直。</li>
	<li>孵育结束后，从各孔中移除约125–170 µL液体。如有需要，用200 µL预温的PBS轻柔洗涤细胞。每孔加入50 µL胰蛋白酶，将板放回培养箱，直至细胞开始解离（5–10分钟）。 
	注：确保孔内液体不干涸，避免过度消化。</li>
	<li>向各孔中加入160 µL新鲜配制的流式缓冲液（含1 mM EDTA、2% w/v牛血清白蛋白的冷PBS）。轻柔吹打数次以充分解离细胞，取196 µL该细胞悬液加入PCR管中，再加入4 µL碘化丙啶，轻柔混匀。另准备一份不含碘化丙啶的对照样品，用于活率门控分析。</li>
	<li>将PCR管置于装有冰的容器中，盖上盖子避光，立即使用流式细胞仪检测荧光强度。</li>
</ol>
5. 数据收集与分析
<ol>
	<li>使用流式细胞仪分析每个样本，目标是每份样本至少收集 2,000 个活的单细胞。 
	注意：尚未分析的样品应尽量减少光照，并置于冰上保存。</li>
	<li>所有数据收集完毕后，将文件转移至选定的软件并对细胞进行设门。
	<ol>
		<li>根据前向散射面积（FSC-A）与侧向散射面积（SSC-A）对细胞设门。</li>
		<li>通过FSC-A与前向散射高度（FSC-H）在细胞群体中设门以区分单细胞。</li>
		<li>根据第4.8步制备的无碘化丙啶对照样本，在碘化丙啶面积强度直方图的最高值处设置垂直门控，从单细胞群体中圈选活细胞。未超过该门控的所有事件均为活细胞。</li>
		<li>在单细胞群的Cy5面积（Cy5-A）强度直方图上设置一个垂直门，以去除由细胞碎片在Cy5-A通道中引起的任何非荧光事件。确保该垂直门的阈值高于0荧光强度，但低于未标记细胞的分析值。</li>
		<li>为分析细胞群体，将双分门设在99处th 各相应阴性对照的百分位数</li>
		<li>在与相应实验条件相同强度下设置门控，收集每种条件下超过阴性对照门控的细胞百分比。 
		注意：可通过适当的统计分析在生物学重复之间直接比较百分比；参见代表性数据。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用中位数Cy5荧光强度分析数据，将配体-WDV的中位荧光强度除以单独WDV的中位荧光强度，并比较各重复样本之间的这些数值。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

我们提供了关于如何建立并开展RAD-TGT实验的方案，旨在鼓励生命科学领域的科研人员将机械表型分析整合到其研究流程中。RAD-TGT的一项关键优势在于，特别是对于具备蛋白质生产能力的研究者而言，可利用HUH内切酶以高保真度将配体连接至DNA双链，且无需任何化学交联和/或纯化步骤。HUH内切酶是一类能够以位点特异性方式结合单链DNA的核酸酶家族。HUH酶尤其引人关注，因为在其结合后，可切割DNA骨架，并与新暴露的5'端形成共价加合物。这些反应迅速，可在数分钟内完成。由于其分子量小且作用机制简单，HUH可被连接至多种蛋白质的末端，且原始蛋白质与HUH部分均可保持功能。我们已利用这一特性，将目标配体快速连接至DNA双链，从而通过一步反应组装出张力传感器拴系结构。需要注意的是，由于HUH易于作为融合伴侣，研究者可尝试将其与其他配体构建融合蛋白，以研究RGD-整合素结合体系以外的力学作用。在表达和纯化本文所述构建体或其他HUH-配体融合蛋白时，可能会遇到挑战。尽管我们已成功纯化出HUH-配体融合蛋白，但仍必须通过SDS-PAGE对纯化过程的每一步进行分析，以确保目标蛋白得到正确表达与分离。
...

机械力调控着许多关键的细胞过程，从细胞迁移1到干细胞分化2，再到T细胞识别并被正确的抗原呈递细胞激活的能力3。在疾病状态下，机械相关变量会发生失调，导致细胞机械表型（即“机械型”，mechanotype）出现可测量的变化4,5。机械型是一个涵盖性术语，指细胞和组织的机械特性，可包括收缩性、迁移能力、黏附性和变形性等参数。其中，细胞或组织的刚度是最常被测量的机械型指标，因其适用于高通量检测。例如，癌细胞通常比正常细胞更刚硬，而转移性癌细胞则往往更具顺应性6,7。细胞产生的力是机械型中在疾病中常发生改变的重要方面，因为它反映了细胞与微环境之间的特定相互作用8。牵引力显微镜技术（traction force microscopy, TFM）是测量细胞发力最常用的方法，其原理是将细胞接种在嵌有荧光微球的可变形弹性基质上，或微柱阵列上，通过追踪微球位移或微柱偏转来计算细胞施加的力。分子张力传感器也可用于测量牵引力，其优势在于对微小力更敏感，并能检测特定配体-受体对所产生的力9,10。然而，传统TFM和分子张力传感器依赖高分辨率成像，限制了测量的通量。
我们最近将DNA双链张力探针改进为一种高通量检测细胞力学生成的方法，用于细胞力学表型分析的背景下11（图1）。简而言之，源自广泛使用的张力阈值拴系（TGT）探针12的DNA双链通过“锚定”链的生物素-中性亲和素化学作用固定在96孔板的孔中13。&#34;锚定&#34;链上生物素的位置可调节TGT双链所需的断裂力，从而改变双链的几何构型，形成低断裂力的解链构象（图2A）或高断裂力的剪切构象（图2B）。锚定链包含生物素和荧光淬灭剂，而DNA的“配体”链则包含荧光探针以及识别参与机械感应（如整合素）的细胞表面受体的配体。&#34;配体&#34;通过一种称为HUH标签的DNA连接融合标签共价连接至DNA（图3）14,15。HUH标签是一类小型HUH核酸内切酶结构域，参与病毒复制及其他过程，能够识别单链DNA上的9 bp序列/结构，将其切开，并在切口DNA的5'端形成共价的磷酸酪氨酸加合物。
细胞接种于这些探针表面后，会与配体结合，并破裂一定比例的探针，破裂程度与细胞产生的作用力成正比。随后，与受体结合的荧光配体链被递送至细胞内。因此，细胞的力学历史通过目标细胞的荧光强度被记录下来。荧光信号可通过流式细胞术进行定量分析。我们将该方法命名为“破裂与递送-张力探针”（Rupture and Deliver-Tension Gauge Tether），简称 RAD-TGTs。该方法不仅能同时测量数千个细胞的荧光信号，从而反映其相对作用力，而且流式细胞术的读数还可用于根据细胞的力学表型（mechanotype）对细胞进行分选，进而实现下游的组学分析，以及筛选可能影响细胞力学表型的基因（如通过CRISPR-KO）或药物。
在以下实验方案中，我们将演示如何制备并实施RAD-TGT实验。我们将重点介绍一种名为WDV（来自小麦矮化病毒）的HUH蛋白的表达与纯化：将其单独表达作为阴性对照，或将之与echistatin融合表达作为实验条件；echistatin是一种可紧密结合介导细胞与环境之间力学信号转导的黏附受体家族（即RGD结合型整合素）的配体。基于此，我们将演示如何制备可用于实验的RAD-TGT。我们将解释实验操作流程以及如何分析所得数据。我们还将通过测量ROCK抑制剂如何改变CHO-K1细胞中整合素介导的力学作用，展示RAD-TGT的一种应用实例（图4）。总之，我们希望本实验方案能为无论是否具备前期经验的研究者提供进入力学生物学领域的入门指导；该领域尚处于发展初期，各类研究背景的科研人员对于推动深入理解均至关重要。

<table><tbody><tr><td>15 mL 圆锥形离心管</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.205</td><td></td></tr><tr><td>96 孔玻璃底培养板</td><td>Cellvis</td><td>P96-1.5H-N</td><td></td></tr><tr><td>粘性 PCR 板封膜</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB-0626</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>Apex Bioresearch Products&amp;nbsp;</td><td>25-530</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad 20 mL 层析柱</td><td>Bio-Rad</td><td>7321010</td><td></td></tr><tr><td>生物素标记的牛血清白蛋白</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>29130</td><td></td></tr><tr><td>BL21 (DE3) 感受态 &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;</td><td>New England Biolabs</td><td>C2527H</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP9703100</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养孵箱</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51030284</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75009521</td><td></td></tr><tr><td>CHO-K1</td><td>ATCC</td><td>CCL-61</td><td></td></tr><tr><td>透析袋</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PI88242</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S311-100</td><td></td></tr><tr><td>流式细胞仪</td><td>BD</td><td>Accuri C6 Plus</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>FlowJo v10.10</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP310-1</td><td></td></tr><tr><td>咪唑</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>O3196-500</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>IBI Scientific</td><td>IB02125</td><td></td></tr><tr><td>LB 琼脂</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1425-500</td><td></td></tr><tr><td>配体链</td><td>Integrated DNA technologies</td><td>用户设计的寡核苷酸</td><td>GCT ATA AAC TCA CCG TAA TTT TTT GGC CCG CAG CGA CCA CCC TTT /3Cy5Sp/</td></tr><tr><td>溶菌肉汤 (LB)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1426-500</td><td></td></tr><tr><td>MnCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>M87-100</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>NeutrAvidin 蛋白</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>镍-NTA 树脂&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88222</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>VWR</td><td>25384-342</td><td></td></tr><tr><td>碘化丙啶溶液</td><td>Cayman Chemicals</td><td>10008351</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE 凝胶</td><td>Bio-Rad</td><td>4561096</td><td></td></tr><tr><td>无血清培养基</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A4124801</td><td>使用 Gibco Optimem，其他无血清培养基也可使用</td></tr><tr><td>剪切锚定链</td><td>Integrated DNA technologies</td><td>用户设计的寡核苷酸</td><td>/5IAbRQ//iBiodT/G GGT GGT CGC TGC GGG CC</td></tr><tr><td>超声破碎仪</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15-345-139</td><td></td></tr><tr><td>PCR 仪</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP152-500</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12605036</td><td></td></tr><tr><td>超滤离心管，10 kDa 截留分子量</td><td>Amikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>解链锚定链</td><td>Integrated DNA technologies</td><td>用户设计的寡核苷酸</td><td>/5IAbRQ/GG GTG GTC GCT GCG GGC C/3Bio/</td></tr><tr><td>WDV 质粒</td><td>AddGene</td><td>226983</td><td></td></tr><tr><td>WDV-Echistatin 质粒</td><td>AddGene</td><td>226985</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1049</td><td>用 DMSO 重悬</td></tr></tbody></table>

基于dna张力探针破裂及递送入细胞的高通量流式细胞术细胞机械表型检测

High-throughput Flow-cytometry Measurement of Cellular Mechanotype Based on Rupture and Delivery of DNA Tension Probes into Cells

机械力调控许多关键的细胞过程，而细胞的力学表型（即机械表型）在多种疾病中会发生异常。目前最广泛用于量化细胞力的方法是牵引力显微镜技术，该技术传统上通过高分辨率显微镜观察细胞对含有荧光微球的弹性基底施加形变、使微柱发生偏转，或改变固定化分子张力传感器构象，从而捕捉细胞对其周围环境施加的力。本文介绍一种基于已建立的DNA张力探针并结合流式细胞术进行定量的高通量方法，用于测量相对细胞牵引力。该方法包含以下五个主要步骤：第一，表达并纯化与DNA连接用HUH标签融合的高亲和力整合素配体——蛇毒解离素（echistatin）；第二，制备包含报告分子和配体的DNA双链探针；第三，表面处理及探针的固定化；第四，执行“破裂与递送”张力阈值拴系实验并获取流式信号读出结果；最后，我们将描述实验数据的分析与结果解读。

为了展示 RAD-TGT 的实用性和操作简便性，我们分析了 Rho 激酶（ROCK）抑制剂对 CHO-K1 细胞力学表型的影响。ROCK 信号通路参与肌动蛋白的组织和肌球蛋白的激活。以往使用 TGT 的研究表明，抑制 ROCK 会降低剪切型 TGT 的断裂频率16,17,18。剪切型或高力 TGT 可报告通过黏着斑施加的收缩力，而解旋型或低力 TGT 则对细胞初始黏附、铺展以及黏着斑形成初期所涉及的较弱细胞力更为敏感。因此，我们预期 Y-27632 处理会相对于溶剂对照组降低 RAD-TGT 在剪切构型中的荧光信号，而对解旋型 TGT 的影响较小，这与我们先前使用肌球蛋白 II 抑制剂 blebbistatin 所观察到的结果一致11。
在解旋和剪切两种TGT构型中均设置了RAD-TGT孔，并分别仅连接WDV（阴性对照）以及WDV-Echistati...

该方法通过检测细胞断裂固定化配体呈递DNA双链的倾向性，以报告细胞相对牵引力。断裂的荧光寡核苷酸被递送至细胞内，并通过流式细胞术进行分析，记录细胞的力学历史。该技术可实现细胞力生成的高通量测量，适用于细胞力学表型分析。

基于DNA张力探针破裂及递送入细胞的高通量流式细胞术细胞机械表型检测

机械力调控许多关键的细胞过程，而细胞的力学表型（mechanotype）在多种疾病中发生异常。最……

我们的实验室主要研究细胞传递机械刺激所使用的分子机制。近期，我们一直在开发高通量方法，用于测量细胞对其周围环境施加的力，以推动力学生物学进入组学时代。研究表明，机械力参与调控T细胞如何被正确抗原激活，以及干细胞如何分化为特定类型的细胞。近年来，针对细胞力学异常相关过程的干预已推动了机械治疗药物的发展，为疾病治疗提供了新途径。DNA双链和发夹结构传感器可用于测量细胞外力，而基因编码传感器则能够实现细胞内力学测量。这些方法几乎均需依赖高端显微镜设备。牵引力显微镜可测量细胞对其周围环境施加的力，但该方法同样需要高分辨率成像。本研究旨在解决该领域的三个挑战：第一，使用流式细胞术而非成像技术进行力学测量；第二，采用 HOH 标签技术将配体和抗体连接至 DNA 探针；第三，使用无需特殊表面处理的标准细胞培养板。细胞产生的力的变化如何可作为疾病状态的预后标志物？这些力是导致疾病状态的原因，还是疾病状态的继发效应？首先，将带有淬灭基团的锚定链与带有荧光基团的配体链按1.1:1的摩尔比配制双链。配制双链时，溶液中配体链的终浓度为40 µM。为使配制好的双链退火，需在98 °C下孵育5分钟。然后，将混合物在避光条件下于室温冷却一小时。使用退火步骤中丰度最低的链的浓度（在本例中为配体链）与 HUH 进行反应。将双链与 HUH 按 1:2 的摩尔比混合，双链的终浓度为 10 微摩尔，HUH 的终浓度为 20 微摩尔。将反应体系置于37摄氏度的热循环仪或避光加热块中孵育30分钟。孵育结束后，从加热设备中取出反应体系，使用台式小型离心机离心收集已组装完成的张力传感器锚定结构（tension gauge tethers, TGTs）。当TGTs充分黏附后，用PBS缓冲液对孔板中的目标细胞洗涤三次。随后用无血清培养基洗涤两次，最后一次洗涤后将培养基保留在孔中。在周边孔中加入 200 微升 PBS，以减少边缘效应。将培养板转移至 37 摄氏度培养箱中，预热培养板。然后，在细胞汇合度约为80%时收集目标细胞。吸除培养基，用PBS洗涤细胞，并在37摄氏度下用胰蛋白酶孵育细胞，直至细胞解离，此过程大约需要5至10分钟。细胞解离后，加入先前用于维持细胞培养的完全培养基的原始体积。使用刻度移液管重悬细胞，并将细胞悬液转移至15毫升锥形管中。在300 ×g离心4分钟。吸除上清液，并将沉淀重悬于磷酸盐缓冲液（PBS）中。重复离心后，将细胞重悬于 5 mL 无血清培养基中，再次离心。吸除上清后，将细胞重悬于约 2 mL 无血清培养基中。测定重悬细胞的密度，以调整至所需浓度。可选地，如果需要检测药物作用，可向细胞中加入适当浓度的药物，并将细胞放回培养箱中孵育预设时间后再进行后续操作。现在，从培养箱中取出原始培养板，移除实验孔中洗涤后残留的培养基。用所需的培养基将各孔洗涤一次，然后用移液器将100 µL重悬的细胞加入目标孔中。将接种细胞的培养板转移至培养箱中孵育90分钟。孵育结束后，从每个孔中移除约125至170微升的液体体积。如有需要，用200微升预热的PBS轻柔洗涤细胞。然后，每孔加入50微升胰蛋白酶，孵育细胞直至细胞开始解离，大约需要5到10分钟。接着，每孔加入160微升 freshly prepared flow buffer。轻轻吹打混匀，使细胞完全解离。将196微升该细胞悬液转移至PCR管中，加入4微升碘化丙啶，轻轻混匀。最后，将PCR管置于带盖的冰桶中避光，使用流式细胞仪检测荧光强度。通过流式细胞术设门确认成功分离活的单细胞，以确保机械表型分析的准确性。以Cy5-A荧光信号第99百分位数设定的阴性对照门控，为不同实验条件的比较提供了基线。经Y27632处理的CHO-K1细胞在剪切型TGT上超过阴性对照门控的细胞比例显著降低，而在解旋型TGT上仅表现出轻微且无统计学意义的下降。与剪切型TGT相比，解旋型TGT consistently 导致更高比例的细胞超过阴性对照门控，证实其所需作用力更低。

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基于 DNA 张力探针破裂和递送到细胞中的细胞机械型的高通量流式细胞术测量

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