基于 DNA 张力探针破裂和递送到细胞中的细胞机械型的高通量流式细胞术测量
2025年6月13日
该方法测量细胞破裂配体呈递固定化 DNA 双链体的倾向，以报告相对细胞牵引力。破裂的荧光寡核苷酸被输送到细胞中并通过流式细胞术进行分析，记录细胞的机械历史。这允许在细胞机械表型分析的背景下对细胞力的产生进行高通量测量。
我们的实验室通常研究细胞用来传递机械刺激的分子机制。最近，我们一直在开发高通量方法来测量细胞施加在周围环境中的力，从而将机械生物学带入组学时代。研究揭示了 T 细胞如何被正确的抗原激活以及干细胞如何分化成特殊细胞类型的机械力。
最近，靶向细胞力学失调背后的过程导致了机械治疗学作为治疗疾病的途径的发展。DNA 双链体和发夹传感器测量细胞外力，而基因编码传感器允许细胞内测量。几乎所有都需要高端显微镜。
牵引力显微镜可以测量细胞对其周围环境施加的力，但它也涉及高分辨率成像。在这项工作中，我们解决了该领域的三个挑战，一是使用流式细胞术进行力测量而不是成像，二是采用 HOH 标签技术将配体和抗体连接到 DNA 探针上，三是利用没有特殊表面处理的标准细胞培养板。细胞产生力的变化如何用作疾病状态的预后标志物，这些力是导致所述疾病状态的次要影响还是次要影响？
首先，以 1.1 比 1 的摩尔比组装双链体，锚链与淬灭剂与配体链与荧光团。在溶液中制备终浓度为 40 微摩尔配体链的双链体。要对组装好的双链体进行退火，请在 98 摄氏度下孵育 5 分钟。
然后，让混合物在室温下避光冷却 1 小时。使用退火步骤中丰度最低的链的浓度将退火的双链体与 HUH 反应，在本例中为配体链。将双链体与 HUH 以 1 比 2 的摩尔比混合，终浓度为 10 微摩尔双链体和 20 微摩尔 HUH。
将反应物在 37 摄氏度下在热循环仪或避光加热块中孵育 30 分钟。孵育后，将反应物从火上移开，并使用台式微型离心机将现在组装的张力计系绳 （TGT） 旋转下来。当 TGT 充分粘附时，用 PBS 用所需细胞洗涤孔 3 次。
随后使用无血清培养基进行两次洗涤，并在最后一次洗涤后将培养基留在孔中。向外周孔中加入 200 微升 PBS 以减轻边缘效应。将板转移到 37 摄氏度的培养箱中以预热板。
然后，以大约 80% 的汇合度检索感兴趣的细胞。吸出培养基，然后用 PBS 洗涤细胞，并在 37 摄氏度下用胰蛋白酶孵育细胞，直到细胞解离，这大约需要 5 到 10 分钟。解离细胞后，加入用于维持细胞的完整细胞培养基的原始体积。
使用血清移液管重悬细胞，并将细胞悬液转移到 15 mL 锥形管中。将细胞以 300 G 离心 4 分钟。吸出培养基并将沉淀重悬于 PBS 中。
重复离心后，将细胞重悬于 5 mL 无血清培养基中，然后再次离心。吸出细胞并重悬于大约 2 mL 的无血清培养基中。确定重悬细胞的密度以根据需要调整浓度。
或者，如果测试药物效应，则向细胞中加入适当浓度的药物，并将细胞放回培养箱中进行预孵育时间，然后再继续。现在，从培养箱中取出原始板，并去除实验孔中洗涤液中残留的培养基。用所需的培养基洗涤孔一次，然后将 100 微升重悬的细胞移液到所需的孔中。
将铺板的细胞转移至培养箱中 90 分钟。孵育后，从每个孔中取出大约 125 至 170 μL 的体积。如果需要，用 200 微升加热的 PBS 轻轻洗涤细胞。
然后，将每个孔中的细胞与 50 μL 胰蛋白酶一起孵育，直到细胞开始解离，这大约需要 5 到 10 分钟。接下来，向每个孔中加入 160 微升新鲜制备的流式缓冲液。轻轻上下移液以解离细胞。
将 196 μL 这种细胞悬液转移到 PCR 管中，加入 4 μL 碘化丙啶，然后轻轻混合。最后，将试管放入带盖的冰桶中，用盖子阻挡任何光线，并使用流式细胞仪测量荧光强度。流式细胞术设门证实了成功的活单细胞分离，确保了准确的机械型分析。
设置为 Cy5-A 荧光第 99 个百分位数的阴性对照设门为实验条件的比较提供了基线。用 Y27632 处理的 CHO-K1 细胞在剪切 TGT 上显示超过阴性对照门的细胞百分比显着降低，而解压缩 TGT 仅表现出适度且统计学上不显着的降低。与剪切 TGT 相比，解压缩 TGT 始终导致超过阴性对照的细胞百分比更高，证实了它们对力的要求较低。
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概述
本研究提出了一种测量细胞破裂配体呈递固定DNA双链的倾向性的方法，该方法能够报告相对细胞牵引力。该方法允许高通量测量细胞力的产生，为力学生物学领域做出了贡献。
关键研究组成部分
科学领域
- 力学生物学
- 细胞力学
- 高通量测量技术
背景
- 细胞通过各种分子机制传递机械刺激。
- 理解细胞力对于洞察T细胞激活和干细胞分化至关重要。
- 正在开发力学治疗法以解决与细胞力学失调相关的疾病。
- 这些测量通常需要高端显微镜。
研究目的
- 开发高通量测量细胞力的方法。
- 推进在组学背景下力学生物学的理解。
- 探索机械力在细胞过程中的影响。
使用的方法
- 使用DNA双链和发夹传感器测量细胞外力。
- 利用遗传编码传感器进行细胞内测量。
- 使用流式细胞术分析破裂的荧光寡核苷酸。
- 用于评估细胞牵引力的高通量技术。
主要结果
- 成功测量了细胞力的产生。
- 了解了细胞的机械历史。
- 展示了该方法在力学表型分析中的适用性。
- 有望推进力学治疗法的发展。
结论
- 该方法为研究细胞力学提供了新的方法。
- 它增强了对细胞如何与其环境相互作用的理解。
- 这项研究可能导致针对细胞力学的新治疗策略。
常见问题
Executive Industry Relevance
High-throughput flow cytometry measurement of cellular mechanotype using DNA tension probes enables scalable quantification of cell-generated forces, addressing a key bottleneck in mechanobiology-driven drug discovery. This approach supports predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking for diseases where cell mechanics are disrupted. Integrating force measurement into early discovery pipelines enhances portfolio triage and risk-adjusted advancement decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of cellular force generation as a functional biomarker.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing primary versus secondary effects in disease models.
- Facilitates target validation for mechanotherapeutic strategies by linking force phenotypes to molecular interventions.
Screening & Assay Development
- Provides a high-throughput, flow cytometry-based readout for scalable mechanotype screening.
- Standardizes force measurement across cell types and conditions using DNA tension probes.
- Enables reproducible, quantitative outputs suitable for compound evaluation and assay development.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mechanotype measurements with disease-relevant cellular phenotypes for translational biomarker development.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling force-based phenotypic screening.
- Improves predictive value for mechanotherapeutic candidate selection in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
This method positions cellular force quantification at the intersection of early discovery, lead identification, and preclinical research, enabling mechanotype-based triage and mechanistic insight throughout the pipeline.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on the role of mechanical forces in disease-relevant pathways.
- Screening: Delivers standardized, high-throughput force readouts for compound and genetic perturbation screens.
- Analytics: Provides quantitative, flow cytometry-based measurements for robust statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical phases by linking mechanotype to disease state and therapeutic response.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for force measurement across diverse cell types and experimental systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of mechanotype assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by integrating force phenotyping into early R&D.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of mechanotherapeutic programs based on quantitative force data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry and DNA probe design for assay setup and data interpretation.
- Needs access to standard flow cytometry instrumentation and analytical infrastructure.
- Demands cross-team standardization of gating strategies and negative control thresholds.
- Adaptable to various cell types and experimental conditions with appropriate probe and ligand selection.
- Dependent on robust statistical analysis to distinguish mechanotype shifts across experimental groups.
