Name: β 淀粉样蛋白 1-40 包被的金胶体的 pH 依赖性可逆自组装的表征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-21T14:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: 了解β淀粉样蛋白1-40包被的金纳米粒子在pH变化下的可逆自组装过程。本研究利用表面增强拉曼散射光谱技术检测蛋白质构象变化，揭示Aβ 1-40聚集动态的关键信息，为阿尔茨海默病治疗策略开发提供重要基础。

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K.Y. 获得美国国家科学基金会 MRI 项目资助（项目编号：2117780）。该研究项目的初期阶段得到了杰内肖基金会的支持。A. I. 感谢纽约州立大学杰内肖分校化学系校友暑期科研奖学金（2019 年罗德斯奖和 2020 年利普科维茨奖）以及德雷福斯基金会本科生暑期科研奖学金对本研究的支持。

1. 准备 Aβ1-40 包被的金纳米颗粒
<ol>
	<li>使用注射器针头将1 mL去离子蒸馏水加入1 mg冻干的Aβ1-40（分子量：4.2 kDa，HPLC纯度98%）中。在室温（RT；~20 °C）下用涡旋混合器混合溶液约30秒，确保溶液中无可见固体颗粒。
	<ol>
		<li>所有储备液均应使用去离子蒸馏水（~18 MΩ·cm）配制。</li>
		<li>通过275 nm处酪氨酸的吸收光谱测定浓度32，其摩尔消光系数ε275为1390 cm-1·M-1。</li>
		<li>Aβ1-40储备液应储存于-80 °C。（有关Aβ1-40商品化产品的信息，请参见材料表。）</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在数据采集前约5分钟将肽储备液解冻。取8 μL肽溶液与800 μL胶体金颗粒加入15 mL离心管中。再加入4.2 mL去离子蒸馏水，随后涡旋混合10秒30,31,33,34。</li>
	<li>固定Aβ1-40肽的浓度为1.8 nmol，并调节Aβ1-40肽的比例。胶体金颗粒的数量比例范围为~500:1至~2000:125。</li>
</ol>
2. 迭代改变pH值并监测相应的表面等离子体共振（SPR）带偏移
<ol>
	<li>将溶液温度设定为确定值（例如， 25 °C使用紫外-可见-近红外（UV-Vis-NIR）分光光度计的温度控制单元。</li>
	<li>使用pH计监测样品溶液的初始pH值，并将其调节至略低于pH 7。采集400 nm至1000 nm范围内的吸收光谱。</li>
	<li>将样品的 pH 值调节至约 pH 4（即 pH 4.0 ± 0.3），通过添加 10 μL 0.1 M HCl 的体积，并收集 400 nm 至 1000 nm 之间的吸收光谱。</li>
	<li>将样品的 pH 值调节至约 pH 10（即 pH 10 ± 0.3），通过添加 10 μL 0.1 M NaOH 的体积，并收集 400 nm 至 1000 nm 之间的吸收光谱。</li>
	<li>用 HCl 和 NaOH 将 pH 在 pH 4 至 pH 10 范围内反复调节 10 次，并在 25 ± 条件下连续采集吸收光谱 0.2 °C29,30. 
	注意：所有样品溶液中，表面等离子体共振（SPR）吸收峰的光密度均维持在约0.2。由于溶液中残留的缓冲液可能产生缓冲效应，因此在确认体系达到平衡后测定最终pH值。使用精度为±0.005 pH的微电极pH电极，在样品比色皿中直接测量pH值。</li>
	<li>获取吸收度随波长变化的美国信息交换标准代码（ASCII）数据集。使用以下方法提取谱带峰的平均位置： 峰拟合 程序
	<ol>
		<li>将数据集绘制成图，以显示光密度随波长（nm）的变化关系 绘图 功能</li>
		<li>标记初始峰波长 λ1，λ2，和 λ3 通过在绘制的数据中选择其大致位置，并使用以下方法对数据进行拟合 RUN 功能</li>
		<li>获取包含每个（λ）中心峰的图谱i），XCi，每个条带的面积（Ai).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将提取的峰位置和峰面积导出至电子表格程序，并计算在特定pH值下的平均峰位置。
	<ol>
		<li>确定权重因子 ai 各峰中心 λi 通过比较条带的面积（Ai）与整条条带总区域面积的比值如下： <img alt="平衡计算公式，\( a_i = A_i/\Sigma_j A_j \)，统计分析方程。" src="/files/ftp_upload/67856/67856eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 1">.</li>
		<li>提取平均峰值位置， <img alt="λ_peak 符号；用于光学峰值波长识别的示意图，与光谱学研究相关。" src="/files/ftp_upload/67856/67856eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 2"> (pH) 使用公式 (1) 计算。 
		<img alt="光谱学公式 λ_peak(pH) = Σa_i(pH)λ_i(pH)，用于pH依赖性光谱分析。" src="/files/ftp_upload/67856/67856eq03.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 3">   (1)</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用以下步骤生成可逆性曲线：
	<ol>
		<li>记录平均峰位， <img alt="λ_peak 符号；用于光学峰值波长识别的示意图，与光谱学研究相关。" src="/files/ftp_upload/67856/67856eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 2">，作为每次“操作”次数 n 的函数 <img alt="λ_peak 符号；用于光学峰值波长识别的示意图，与光谱学研究相关。" src="/files/ftp_upload/67856/67856eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 2"> 与n相对。将加酸前pH约为7的样品的操作编号n设为1。每次操作后，使用HCl将pH调节至约pH 4，或使用NaOH将pH调节至约pH 10，并将操作编号依次增加1。在酸性条件（即约pH 4）下，使n为偶数；在碱性条件（即约pH 10）下，使n为奇数。</li>
		<li>分析每个 n 处的峰位 <img alt="λ_peak 符号；用于光学峰值波长识别的示意图，与光谱学研究相关。" src="/files/ftp_upload/67856/67856eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 2"> (n) = λ(n)，使用公式30 
		<img alt="数学公式，λ(n)=A+B(n-1)^C+De^(n-1)^E cos(nπ)，方程，数学建模" src="/files/ftp_upload/67856/67856eq04.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="方程 4">    (2) 
		注意：用 A 表示 n = 1 时的初始平均峰值位置。将参数 B 和 C 表示为随 n 变化的峰值位置偏移量。将参数 D 设为重复阻尼因子 E 的振幅。使用 正弦 用于展示峰位随 n 变化的波动情况。</li>
		<li>将（x，y）数据集传输至 Origin 软件并绘图。</li>
		<li>形成 定制化 公式（2）中给出的函数 非线性曲线拟合分析函数输入初始的 A、B、C、D 和 E 值，然后单击 RUN 以完成拟合。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>透射电子显微镜成像
	<ol>
		<li>制备 Aβ 的透射电子显微镜样品1-40使用Formvar包被的铜网吸附20 nm金胶体。在80 kV电压下用透射电子显微镜观察样品。</li>
		<li>在型号为 XR-40 的 400 万像素 CCD 数字相机（AMT）上以 28,000 倍或 71,000 倍的标称放大倍数采集图像。采集 Aβ 的透射电子显微镜（TEM）图像1-40每次操作分别在 pH 7（n = 1）、pH 4（n = 2、4、6、8 和 10）以及 pH 10（n = 3、5、7 和 9）条件下使用包被的 20 nm 金颗粒。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 拉曼成像及可逆聚集行为的研究
<ol>
	<li>在操作编号为 n 的每个样品中，取 100 μL 溶液置于云母片（直径 1 cm）上。测量前将样品干燥过夜。</li>
	<li>在每个操作编号 n 下采集白光图像。在云母片上制备独立样品，使 pH 在每个操作编号 n 下持续改变，范围约为 pH 4 至 pH 10（图3）。</li>
	<li>在每个操作编号 n 下采集拉曼图像，使用波长为 λ = 633 nm 的激光，功率为 0.5 ± 0.05 mW，空间分辨率为约 0.43 μm，成像区域网格为 100 × 100 像素，积分时间为 500 ms/光谱，光谱范围为约 200 cm-1 至约 2,800 cm-1（图4）。</li>
	<li>绘制每个 n 的代表性光谱，并将其按 n 的函数对齐，构建 Aβ1-40 包被的 20 nm 金颗粒的三维表面增强拉曼光谱（SERS）随 n 变化的图像（图5A）。利用该三维 SERS 光谱的俯视图作为等高线图（图5B），以提取与特定 pH 条件（即约 pH 4 和约 pH 10）相关的特征峰。提取仅在 neven 或仅在 nodd 增强的任何光谱特征。</li>
</ol>

作者声明，他们在此项工作中没有需要披露的利益冲突。

在肽构象研究中，一个关键的考虑因素是样品的保存，因为如果储存不当，样品会降解。肽样品以冻干形式收到，一旦用去离子蒸馏水复溶后即开始发生变性，即使储存在 -80 °C 条件下也是如此。金胶体的纯度已通过质量控制分析验证。为保持胶体的稳定性，将其储存在 4 °C 环境中，避免冷冻。每次实验均需新鲜配制金胶体溶液，因为盐缓冲液会导致金胶体失稳。盐酸（HCl）和氢氧化钠（NaOH）溶液也需每次实验前新鲜配制。
在 pH 4 至 10 之间调节溶液 pH 值的同时，使用精密仪器手动读取并记录 pH 值，这一过程存在技术上的挑战，限制了我们报告结果的精确性。因此，我们未观察到表面增强拉曼散射（SERS）信号强度的一致性结果。这可能对用于绘制等高线图的信号幅度引入了误差。未来的研究若要验证与 neven 或 nodd 相关的振动模式，可引入突变，替换我们所报告的参与 Aβ1-40 蛋白构象变化的氨基酸残基，例如单个酪氨酸（Tyrosine）或天冬酰胺（Asparagine）残基。
Aβ之间的相互作用1-40 单体与金表面之间的相互作用被考虑在内&#160;偶极相互作用，以及其水平&#160;氢键作用在以下研究人员的工作中被假设：&#160;H. Schmidbauer 等55在另一项研究中，我们探究了SERS光谱随Aβ含量变化的情况1-40 在酸性条件下，它提取了与纳米尺寸相关的吸附形成56对于20 nm金颗粒，推测组氨酸（His）的C=C键或-C-N键引发吸附；而对于80 nm金颗粒，苯丙氨酸（Phe）或酪氨酸（Tyr）的苯环呼吸振动模式则到达金表面，从而启动吸附过程。Aβ的吸附过程1-40 在中性或碱性条件（pH ~10）下置于金表面被认为可维持 Aβ1-40 由于在水相条件下未形成沉淀，表明包被的金胶体具有亲水性。然而，在pH为4时观察到沉淀，说明聚集体具有疏水性。
透射电子显微镜（TEM）图像和白光图像仅能间接显示聚集现象的证据。我们曾尝试进行圆二色光谱（CD）分析，以将可逆聚集过程中观察到的形态与二级结构相关联。然而，散射导致的基线干扰使我们无法获得可重复的CD信号。因此，我们转而采用拉曼光谱，重点关注在pH约4条件下发生聚集（Aβ1-40的非折叠构象）或在pH约10条件下发生解聚（Aβ1-40的非折叠构象）时增强的振动模式。因此，本研究中对二级结构的最合理推断仅限于监测与二级结构相关的特征峰。这一点在pH 4条件下于1628 cm-1处观察到β-折叠结构时得到了验证。
本研究仅观察了直径为20 nm的金胶体对肽构象变化的影响，且仅研究了n值最高至10的情况。Aβ1-40肽的构象和聚集特性可能因吸附颗粒的尺寸不同而发生改变56。因此，仍需进一步研究以明确基于单体间网络连接的肽类性质，以及受吸附表面物理特性影响的肽类行为。在本研究测试的条件下，仅直径为20 nm的金胶体表现出聚集形态的可逆性，而胶体直径如何影响该性质可逆性的机制尚不清楚。将n值提高至20可能有助于更深入理解聚集形态可逆性的模式依赖程度。这些关于金胶体尺寸如何影响淀粉样β肽聚集行为的研究，将为揭示阿尔茨海默病病理的分子机制提供重要见解。

淀粉样蛋白β 1-40（Aβ1-40）或1-42（Aβ1-42）肽的纤维形成过程已被广泛研究，因其是阿尔茨海默病致病因素之一——淀粉样斑块形成的关键环节1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11。纤维形成的关键机制是Aβ1-40或Aβ1-42肽发生寡聚化，形成具有神经毒性的蛋白质聚集体；目前已有大量研究致力于阐明单体如何形成寡聚体的机制12,13,14。我们采用了一种研究方法，即观察淀粉样蛋白原性肽在纳米金表面形成聚集体的过程，并鉴定出介导远离金表面肽段之间网络连接的关键因素15,16,17,18,19,20,21,22。
Aβ1-40 在酸性条件（pH ~4）下呈现伸展构象（A），在碱性条件（pH ~10）下呈现折叠构象（B）。我们观察到分散的 Aβ1-40在 pH 约为 10 的条件下，包被的金胶体颗粒与大量 Aβ1-40在 pH~4 条件下涂覆的金胶体聚集体图1)23,24Aβ的非折叠构象1-40在酸性条件下，有利于Aβ之间的肽链网络形成1-40 金纳米颗粒表面的单体，导致形成金胶体聚集体（见A） 图1）。当 Aβ1-40 单体在碱性或中性pH条件下保持折叠构象，Aβ1-40，单体不会交联形成聚集体，而包被的金纳米颗粒则保持为单独分散的颗粒（见图B） 图1因此，我们可以探究Aβ的形成过程1-40 通过测量在不同pH条件下SPR谱带位移，检测肽段发生构象变化并形成网络结构和聚集体的过程25,26,27,28,29,30,31.
我们测试了多种不同尺寸的金纳米颗粒，发现20 nm的金溶胶在外界pH值变化时，对Aβ1-40单体表现出最显著的可逆自组装过程（图2）。这明确表明肽构象发生了可逆变化：酸性条件（A）诱导肽链呈去折叠构象，增强其网络化作用，导致金溶胶聚集；而碱性条件（B）则诱导单体形成折叠构象26,27,28,29,30,31。

<table><tbody><tr><td>淀粉样蛋白β肽1-40（A&amp;beta;&lt;sub&gt;1&amp;ndash;40&lt;/sub&gt;肽）</td><td>r-Peptide (Bogart, GA, USA)</td><td>A-1156-2</td><td></td></tr><tr><td>CCD数码相机</td><td>AMT</td><td>XR-40 4百万像素CCD&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q水系统制备的去离子蒸馏水</td><td>Millipore Sigma (Burlington, MA, USA)</td><td>Milli-Q IQ 7000</td><td></td></tr><tr><td>–86 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C超低温冰箱</td><td>Thermo Scientific</td><td>Revco Chilly Willy&amp;nbsp; RLE系列设备编号187004，生产编号40.04</td><td></td></tr><tr><td>金胶体（10 nm）</td><td>Ted Pella, Inc. (Redding, California, USA)</td><td>15703-20</td><td></td></tr><tr><td>金胶体（100 nm）</td><td>Ted Pella, Inc. (Redding, California, USA)</td><td>15711-22</td><td></td></tr><tr><td>金胶体（15 nm）</td><td>Ted Pella, Inc. (Redding, California, USA)</td><td>15704-20</td><td></td></tr><tr><td>金胶体（20 nm）</td><td>Ted Pella, Inc. (Redding, California, USA)</td><td>15705-20</td><td></td></tr><tr><td>金胶体（30 nm）</td><td>Ted Pella, Inc. (Redding, California, USA)</td><td>15706-21</td><td></td></tr><tr><td>金胶体（40 nm）</td><td>Ted Pella, Inc. (Redding, California, USA)</td><td>15707-21</td><td></td></tr><tr><td>金胶体（50 nm）</td><td>Ted Pella, Inc. (Redding, California, USA)</td><td>15708-21</td><td></td></tr><tr><td>金胶体（60 nm）</td><td>Ted Pella, Inc. (Redding, California, USA)</td><td>15709-22</td><td></td></tr><tr><td>金胶体（80 nm）</td><td>Ted Pella, Inc. (Redding, California, USA)</td><td>15710-22</td><td></td></tr><tr><td>最高级V1AFM云母圆片 10 mm</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>#50</td><td></td></tr><tr><td>盐酸标准溶液，1.0 N</td><td>Fluka</td><td>批号 SHBB4705V&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 318949-2L</td><td></td></tr><tr><td>石英比色皿，光程10 mm</td><td>Fire Fly Science&amp;nbsp;</td><td>型号1-MC-光程10mm</td><td></td></tr><tr><td>微型pH电极</td><td>HORIBA</td><td>型号 9618S (生产编号 9Y8E0050)</td><td></td></tr><tr><td>Peak Fit程序</td><td>Origin (Northampton, MA, USA)</td><td>OriginPro2018b (64位) b9.5.5.409 (学术版)</td><td></td></tr><tr><td>pH 4.00缓冲溶液&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>货号 34170-127</td><td></td></tr><tr><td>pH 7.00缓冲溶液&amp;nbsp;</td><td>Fisher Chemical</td><td>批号 SB107-4 191041</td><td></td></tr><tr><td>pH计</td><td>HORIBA</td><td>型号 F-72G (生产编号 B27M0017)</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头 &amp;nbsp;Maxi吸头 1&amp;ndash;5 mL</td><td>Fisher&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>02-707-467</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头 10 mL</td><td>Fisher</td><td>02-717-135</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头 1000 mL</td><td>Fisher</td><td>02-717-156</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头 1&amp;ndash;200 mL</td><td>Fisher</td><td>02-717-143</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Brand Elite移液器 0.5&amp;ndash;5 mL</td><td>Fisher</td><td>QU05317</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Brand Elite移液器 100&amp;ndash;1000 mL</td><td>Fisher</td><td>QU01672</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Brand Elite移液器 10&amp;ndash;100 mL</td><td>Fisher</td><td>MU10985</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Brand Elite移液器 1&amp;ndash;10 mL</td><td>Fisher</td><td>MU08178</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠溶液 1.0 M</td><td>Fluka</td><td>批号 05096BPV&amp;nbsp;&amp;nbsp; 319511-2L</td><td></td></tr><tr><td>透射电子显微镜（TEM）</td><td>FEI Co</td><td>Morgagni model 268&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>TempAssure PCR管，平盖，无色&amp;nbsp;</td><td>USA Scientific</td><td></td><td>聚丙烯材质，0.2 mL独立薄壁管，带磨砂平盖</td></tr><tr><td>紫外-可见-近红外分光光度计（UV-Vis-NIR Spectrophotometer）</td><td>Varian</td><td>CARY 5000 UV1106M074</td><td></td></tr><tr><td>WI Tec alpha300R共聚焦拉曼显微镜</td><td>WITec-Oxford Instrument</td><td>XMB3000-3001</td><td></td></tr></tbody></table>

表征ph依赖性可逆自组装的aβ 1-40包被金胶体

Characterization of pH-Dependent Reversible Self-Assembly of Amyloid Beta 1-40-Coated Gold Colloids

采用表面等离子体共振（SPR）光谱法和透射电子显微镜（TEM）对包被在纳米金胶体颗粒表面的Aβ1-40进行了表征。在TEM图像中观察到Aβ1-40包被的20 nm金颗粒的SPR吸收带随pH变化的位移，与聚集和解聚状态的交替现象相关。当pH约为4&#160;时，Aβ1-40在金表面呈现展开构象；而当pH约为10&#160;时，则呈现折叠构象。通过拉曼成像观察到，随着pH从4逐渐变化至10，该聚集过程具有可逆性。我们观察到Aβ1-40在金表面上的形貌随pH变化而改变，在pH为4时可清晰看到明显的聚集体。然而，在pH 4与pH 10条件下，表面增强拉曼光谱（SERS）谱图之间的差异非常细微，最显著的区别出现在250 cm-1至1750 cm-1区域的谱峰密度。具体而言，对可逆聚集过程的模式分析表明，聚集体是由Aβ1-40的展开构象形成的，涉及酪氨酸（Tyrosine）和苯丙氨酸（Phenylalanine）的苯环结构部分；相反，聚集体的解离则与Aβ1-40蛋白折叠过程中的构象变化相关，涉及组氨酸（Histidine）、谷氨酰胺（Glutamine）、甲硫氨酸（Methionine）和天冬氨酸（Aspartic acid）。

当Aβ1-40结合到金纳米胶体颗粒表面时，在溶液酸性增强（pH 4）的条件下，原本位于约530 nm吸收峰处的表面等离子体共振（SPR）带显著红移至约650 nm的峰位35。结合透射电子显微镜（TEM）图像，我们确定在pH 4条件下观察到的光谱特征对应于金胶体聚集体的形成，这些聚集体可能呈现去折叠构象，并与吸附在金表面周围的去折叠Aβ1-40单体相互交联成网络结构30。我们观察到，在碱性条件（pH 10）下，Aβ1-40单体会逆转回折叠构象，从而以准可逆的方式导致聚集体解聚。这种准可逆过程体现在平均吸收峰波长（<img alt="λ_peak 符号；用于光谱学研究中光学峰波长识别的示意图" src="/files/ftp_upload/67856/67856eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Equation 2">(n)）在较短与较长波长之间的交替变化，以及在碱性（pH = 10）与酸性（pH = 4）条件下TEM图像中分散态与聚集体形态的交替出现。先前已有研究观察到，即使溶液恢复至碱性条件，仍有部分Aβ1-40单体保持去折叠状态36。视频 1展示了Aβ1-40与20 nm裸金胶体溶液随pH变化的颜色改变。
作为对比，对20 nm的裸金胶体进行了pH跃迁实验（图5C 和 D）。随着pH变化操作的进行，金胶体在表面等离子体共振（SPR）吸收带偏移、透射电子显微镜（TEM）图像以及白光图像中均表现出聚集程度的增加。有趣的是，拉曼增强光谱（SERS）中出现了若干依赖于nodd和neven的谱线。例如，在neven（pH ~4）条件下，275 cm-1处的谱线显著增强，该谱线被指认为与Aun（n = 5, 6, 12, 16, 20, 58）37相关的振动模式，或Au-Cl-配体的振动模式38。另一方面，在neven条件下，1008 cm-1处观察到C-N伸缩振动39，而1291 cm-1处则广泛观察到CH2摇摆振动39和CH2变形振动40。
与白光成像观察到的明显pH依赖性且可逆的聚集形态相比，nodd与neven在SERS光谱中的谱图特征差异相对较小。作为初步近似，nodd在250 cm-1至1750 cm-1范围内的谱线密度高于neven。在指纹区1250 cm-1至1750 cm-1范围内（酰胺I、II和III谱带），nodd的谱线显示出分辨度较低的光谱特征，表明可能存在谱带展宽或谱密度增加。在图6中，基于图5B（图6B）提供的等高线图，以761 cm-1（红色）和1395 cm-1（蓝色）处的SERS信号分别代表nodd和neven的特征进行组织（图6C）。作为nodd和neven的代表性SERS光谱，n = 7（红色）和n = 4（蓝色）的SERS光谱显示在顶部（图6A）。为展示其与Aβ1-40包被的20 nm金颗粒的SPR谱带位移的对应关系，将图3中的谱带位移图显示在侧边（图6D）。
尽管我们已获得观测到的SERS谱图完整归属的初步数据，但此处需指出几个显著的拉曼位移特征。在nodd条件下增强的谱线及其（可能的归属）主要出现在1000 cm-1以下的区域：394 cm-1（Trp）41,42,43、761 cm-1（His, Ala）39,44,45,46,47、875 cm-1（吲哚NH位移，Met的C-C伸缩振动）39、974 cm-1（Glu，Asp的C-COO-伸缩振动，与柠檬酸相关的振动模式）39,48,49。在neven条件下增强的拉曼位移在指纹区（酰胺I、II和III）表现出显著的光谱特征：1166 cm-1（Tyr的N-H+变形振动）39,41、1227 cm-1（Ala-Pro-Gly，酰胺III）39,50,51、1395 cm-1（Glu的COO-对称伸缩振动或CH2-CH3-剪式振动）39,48、1585 cm-1（Phe的苯环CC伸缩振动，羧酸根不对称伸缩振动-Au，柠檬酸的COO-伸缩振动，苯环变形振动）39,41,45,46,47,49,52、1592 cm-1（Phe, Tyr，Tyr的C=C伸缩振动，Phe中环的CC伸缩振动，Phe和Tyr中苯环伸缩及COO-伸缩振动，以及OH的不对称伸缩振动）39,41,48,50,51，以及1628 cm-1（对应于分子间β-折叠结构的酰胺I子峰53，来源于平行β-折叠结构的蛋白质主链C=O以及耦合的CN/NH振动模式，聚集态Aβ的积累54，无规卷曲，β-转角，β-发夹结构48。nodd或neven对应的序列如图7所示。总体而言，在对应Aβ1-40可逆聚集或去折叠构象的neven条件下，含有苯环的Phe/Tyr、COO-的对称伸缩振动、Glu的CH2-CH3-剪式振动模式以及Tyr的-NH+变形振动在肽链构象变化中起重要作用。而在肽链折叠构象（对应nodd显著模式）下的聚集体解组装过程中，Glu、Asp、Met、His和Ala似乎参与其中。
<img alt="显示吸收光谱（500-800 nm）和显微镜图像的蛋白质折叠示意图，用于结构分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67856/67856fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：pH依赖性的吸光度与形态学特征。 显示了Aβ1-40包被的金纳米颗粒（20 nm）在pH 4（A）和pH 10（B）条件下的吸收光谱，以及相应的透射电子显微镜（TEM）图像、聚集体/分散颗粒的示意图和样品瓶中溶液的照片。A代表在酸性条件下Aβ1-40单体的去折叠构象，B代表在碱性条件下的折叠构象。每种构象下Aβ1-40单体的示意图及聚集/分散形态均显示在TEM图像旁。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67856/67856fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="pH依赖性光谱位移图；Δλ_peak 与循环次数(n)的关系；纳米颗粒分析；实验结果" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67856/67856fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：纳米尺寸依赖的自组装可逆性。所有测试尺寸的金胶体颗粒在不同操作次数 n 下，表面等离子体共振（SPR）带的平均峰位移变化 <img alt="λ_peak 符号；用于光谱学研究中光学峰值波长识别的示意图。" src="/files/ftp_upload/67856/67856eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="方程2">。图中同时标出了对应聚集体在 图1 中所示阶段的大致pH值。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67856/67856fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="pH依赖性颗粒聚集的光谱分析图；显微镜图像，不同操作次数n下的λpeak与n关系。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67856/67856fig03v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：<img alt="λ_peak符号；光谱分析；光学测量概念示意图" src="/files/ftp_upload/67856/67856eq05.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式5"> 以及每次操作时的透射电子显微镜（TEM）/白光图像。 Aβ1-40包被的20 nm金颗粒（实心圆）和未包被的20 nm金胶体（空心圆）的<img alt="λ_peak符号；用于光学峰值波长识别的示意图，与光谱学研究相关。" src="/files/ftp_upload/67856/67856eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式2">随操作次数n的变化关系被绘制在同一图中，并附有在选定操作次数（n = 1、2、3、7和8，由解码箭头标出）下的代表性TEM图像（A 和 C）及白光图像（B 和 D），分别对应Aβ1-40包被的20 nm金颗粒（A 和 B）和未包被的20 nm金胶体（C 和 D）。黑色字体表示pH 7，蓝色字体表示pH 4，红色字体表示pH 10。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67856/67856fig03largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显微镜与表面增强拉曼光谱分析示意图；显示 n=2 和 n=3 粒子分布及光谱结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67856/67856fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：典型的白光与拉曼图像。 白光图像、拉曼图像以及表面增强拉曼光谱（SERS）结果分别对应于（A）n = 2 和（B）n = 3；i）宽视野下的白光图像，ii）采集拉曼图像区域的白光图像（在 i 中以红色方框标示），iii）两个组分合并后的拉曼图像，iv）组分 1 的拉曼图像及其 v）iv 的 SERS 光谱，vi）组分 2 的拉曼图像，以及 vii）vi 的 SERS 光谱。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67856/67856fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="三维光谱图与拉曼位移数据可视化的拉曼光谱分析" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67856/67856fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图5"> 
图5SERS光谱的n轮廓图奇数，n即使，以及 n全部. (A) 250 cm⁻¹ 谱区的表面增强拉曼光谱三维图谱-1 和 1750 cm-1 作为 Aβ 的 n 的函数1-40 涂覆的20 nm金颗粒，其轮廓图如（B）位于上方。C) 250 cm⁻¹ 区域内 SERS 谱图的三维图谱-1 和 1750 cm-1 作为金颗粒尺寸为20 nm时n的函数，其等高线图如(D）位于上方。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67856/67856fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="拉曼光谱分析；包括表面增强拉曼散射信号、拉曼位移图谱、光谱拟合过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67856/67856fig06v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图6"> 
图6：表面增强拉曼散射（SERS）光谱的等高线图。 表面增强拉曼散射（SERS）光谱随 n（1–10）变化的等高线图。（A）1395 cm-1（蓝色）和 761 cm-1（红色）处的吸收强度。（B–D）下方面板显示表面增强拉曼散射（SERS）光谱，右侧面板显示在每个 n 值处表面增强拉曼散射（SERS）信号强度变化的幅度。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67856/67856fig06largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="蛋白质序列分析示意图；氨基酸，折叠/非折叠状态增强箭头。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67856/67856fig07v3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 7"> 
图7：Aβ1-40 的显著序列特征。 被指定在 nodd 时具有显著作用（对应于折叠构象的形成）的序列以向下的红色箭头表示，而在 neven 时具有显著作用（对应于非折叠构象的形成）的序列以蓝色箭头表示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67856/67856fig07largev3.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
视频 1：Aβ1-40 与 20 nm 裸金胶体的 pH 依赖性颜色变化。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67856/Movie%20Abeta-Gold%20Color%20Change.wmv" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>

本文介绍了一种系统性方法，用于描述淀粉样蛋白β 1-40（Aβ1-40）包被的20 nm金颗粒聚集体的准可逆自组装过程。肽段之间依赖纳米尺寸的准可逆网络化行为与Aβ1-40单体中的特定氨基酸或区域相关联。

表征pH依赖性可逆自组装的Aβ 1-40包被金胶体

采用表面等离子体共振（SPR）光谱法对包被在纳米金胶体颗粒表面的Aβ1-40进行了表征……

我的研究重点是获取淀粉样蛋白β 1-40在吸附于金纳米颗粒表面并发生可逆聚集过程时的关键构象确认信息。本研究领域面临的挑战在于，如何获得该逆向聚集过程的热力学、化学及动力学信息。本项目的重要发现是，我们能够识别出当淀粉样蛋白β 1-40吸附于金纳米颗粒表面时，对其折叠或去折叠构象起贡献的特定运动或振动模式。使用SERS（表面增强拉曼散射光谱）的最大优势在于能够检测到非常微弱的散射信号，从而识别出导致蛋白质折叠与去折叠的关键模式。同时，我们能够精确定位聚集体的形态。本项目所获得的研究发现揭示了蛋白质-蛋白质相互作用的关键机制，这种相互作用对于寡聚体的形成至关重要，并将最终导致纤维生成。首先，使用微量移液器将一毫升去离子蒸馏水加入一毫克冻干的淀粉样蛋白 β（Aβ 1-40）中。用涡旋混合器混合溶液约 30 秒。确保在室温（约 20 °C）下溶液中无任何固体颗粒残留。接下来，使用去离子蒸馏水配制肽段储备液。通过分光光度法在275纳米处测定酪氨酸的吸收值来确定肽段浓度。将Aβ 1-40储备液于-80°C保存。在数据采集前约五分钟解冻肽段储备液。在15毫升离心管中，将8微升肽段溶液与800微升金胶体颗粒混合。加入4.2毫升去离子蒸馏水，然后涡旋震荡样品10秒。将 Aβ 1-40 肽的浓度固定在 1.8 纳摩尔，并在特定范围内调节肽与胶体金颗粒的比例。利用紫外-可见分光光度计的温度控制单元，将溶液温度设定为室温，约 22 摄氏度。使用 pH 计监测样品溶液的初始 pH 值，并将其调节至略低于 pH 7。在400至800纳米范围内采集吸收光谱。然后，通过逐次加入1.0 µL的1.0 M盐酸，将样品的pH值调节至约pH 4。再次在相同的400至800纳米范围内采集吸收光谱。接下来，通过逐次加入约1.5微升的1.0摩尔氢氧化钠溶液，将样品的pH值调节至约pH 10。在相同的400至800纳米波长范围内采集吸收光谱。随后，通过加入盐酸或氢氧化钠，将pH值在pH 4至pH 10之间反复调节10次。在 25 摄氏度下连续采集吸收光谱。获取以吸光度为函数的波长 ASCII 数据集。使用 PeakFit 程序提取谱带峰的平均位置。使用绘图函数绘制数据集，以可视化光密度随波长的变化关系。通过在绘制的图谱中选择其大致位置，确定并标记初始峰波长 λ₁ 和 λ₂。使用 Origin 软件的峰拟合功能对数据进行拟合。获取显示每个标记为 XCI 的拉曼位移（lambda）对应的中心峰位置的图谱，以及相应的谱带面积，记为 AI。将提取的峰位置及对应的面积导出至电子表格程序进行分析。通过使用显示的公式，将每个谱带的面积与所有谱带总面积进行比较，计算每个峰中心的权重因子 AI。然后，使用屏幕上显示的公式计算平均峰位置。为了生成可逆性曲线图，将平均峰位作为操作次数 N 的函数进行列表。根据屏幕上显示的编号分配操作次数 N。使用显示的公式分析 N 次操作时的峰位。将计算得到的数据集导入 Origin 软件并绘图。选择非线性曲线拟合分析，输入参数 A、B、C、D 和 E 的初始值，然后点击运行以完成曲线拟合过程。进行拉曼成像时，对操作编号为 N 的每个样品，取 100 µL 溶液滴加到直径为 1 cm 的云母圆片上。样品在测量前需静置过夜使其自然干燥。接下来，针对每个操作编号 N，采集白光图像。在新的云母片上制备独立样品，并持续改变 pH 值，范围介于 4 至 10 之间。针对每个操作编号采集拉曼图像，并使用波长为 633 纳米的激光，按照前述参数设置进行。以 100 × 100 像素的网格采集图像，设定特定的积分时间，聚焦于目标光谱区域。将每个操作次数 N 对应的代表性光谱按 N 的函数关系进行对齐绘制。针对 Aβ1-40 包被的 20 纳米金颗粒，构建随操作次数 N 变化的三维表面增强拉曼光谱（SERS）。利用光谱的俯视图作为等高线图，提取与特定 pH 条件相关的特征振动模式。识别仅在偶数或奇数操作次数下特异性增强的光谱特征。Aβ 1-40包被的金纳米颗粒的表面等离子体共振（SPR）吸收带在溶液酸性增强时从530纳米红移至约650纳米。这对应于在透射电子显微镜（TEM）下观察到的、由去折叠的Aβ 1-40单体介导形成的金胶体聚集体。Aβ 1-40包被金纳米颗粒的pH依赖性颜色变化也十分明显。平均吸收带在较短和较长波长之间的可逆pH依赖性位移，以及透射电子显微镜（TEM）中观察到的交替分散与聚集形态，证实了该过程的准可逆特性。白光成像显示了与pH变化相对应的清晰且可逆的聚集模式，而表面增强拉曼光谱（SERS）在指纹区则呈现出细微的pH依赖性变化。

characterization-ph-dependent-reversible-self-assembly-amyloid-beta-1

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

β 淀粉样蛋白 1-40 包被的金胶体的 pH 依赖性可逆自组装的表征

光诱导未修饰蛋白质交联（PICUP）技术可用于表征亚稳态蛋白质混合物中寡聚体的大小分布。我们展示了将PICUP应用于三种典型的淀粉样肽：淀粉样β蛋白的40和42个残基形式、降钙素，以及一种对照肽生长激素释放因子。...

未修饰蛋白质的光诱导交联技术（PICUP）在淀粉样肽中的应用

适配体是通过筛选获得的短链核糖/脱氧核糖寡核苷酸 体外...

阿尔茨海默病致病因子淀粉样β蛋白的适配体筛选

一种大规模纯化APP胞内域（AICD）的方法。我们还描述了诱导该蛋白表达的方法 体外...

淀粉样前体蛋白胞内段的纯化与聚集

蛋白质可折叠成天然结构，也可错误折叠形成不溶性淀粉样蛋白。有利于错误折叠途径的条件可导致不同类型的淀粉样纤维形成。本文所述方法可实现天然蛋白质向淀粉样蛋白的快速转化 体外.

天然蛋白质快速生成淀粉样蛋白 体外

本文报道了一种定制的高效液相色谱（HPLC）纯化方案，可获得高纯度的淀粉样蛋白β42（Aβ42）和淀粉样蛋白β40（Aβ40）肽段，这些肽段具有形成寡聚体的能力。淀粉样蛋白β是一种极易聚集的疏水性肽段，与阿尔茨海默病密切相关。由于该肽段具有淀粉样蛋白生成特性，其纯化过程具有挑战性。...

一种定制的高效液相色谱纯化方案，可获得高纯度的淀粉样蛋白β42与淀粉样蛋白β40多肽，并支持寡聚体形成

本方案描述了如何从合成肽制备Aβ寡聚体 体外...

A11阳性β-淀粉样蛋白寡聚体的制备及点印迹分析鉴定

一种1,2-二硫杂环戊烷修饰肽的合成方案及其自组装形成的超分子结构的表征。...

1,2-二硫杂环戊烷修饰的自组装肽的合成与表征

本文介绍了两种可单独或联合使用的方法，用于分析β-淀粉样蛋白对纤维蛋白凝块结构的影响。其中包括一种制备凝块的方案 体外...

通过光谱学与扫描电子显微镜分析β-淀粉样蛋白诱导的纤维蛋白凝块结构异常

这种结合质谱法蛋白质组学分析的生化纯化方法有助于对淀粉样纤维核心进行稳健表征，可能加速阿尔茨海默病防治靶点的发现。...

脑源性淀粉样纤维核心的生化纯化与蛋白质组学表征

许多蛋白质可形成淀粉样纤维，这些纤维具有共同的"交叉β-折叠"结构。本文介绍了如何制备用于X射线纤维衍射的淀粉样纤维样品，以及如何分析所得衍射图谱。...

淀粉样蛋白与交叉β结构

了解β淀粉样蛋白1-40包被的金纳米粒子在pH变化下的可逆自组装过程。本研究利用表面增强拉曼散射光谱技术检测蛋白质构象变化，揭示Aβ 1-40聚集动态的关键信息，为阿尔茨海默病治疗策略开发提供重要基础。

表征pH依赖性可逆自组装的Aβ 1-40包被金胶体

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