陆生两栖动物皮肤细菌菌株的分离与鉴定

本研究旨在建立一种高效收集野生陆生两栖动物皮肤微生物群的方案，并确保微生物在储存和处理过程中的完整性。

主要挑战包括防止样本污染、在储存期间维持微生物的活性，以及培养生长缓慢的微生物以全面评估两栖动物皮肤微生物群的多样性。

已证实，甘油增强型生理盐水在储存和处理过程中可维持两栖动物皮肤微生物群落的完整性，有助于稳定的细菌培养，并改进生态学和生物技术研究中的微生物保护策略。

本方案解决了缺乏标准化采样方法的问题，可保存和处理可培养的两栖动物皮肤细菌，并确保菌群完整性。

[旁白] 首先，将培养基在121至134摄氏度下高压灭菌15至30分钟。灭菌后，使琼脂培养基冷却至约45至50摄氏度。在预先灭菌的超净工作台内，将冷却后的培养基倒入无菌培养皿中。待琼脂凝固后，用记号笔在培养皿上标注培养基类型及制备日期。将野外采集的样品与溶液混合，通过挤压试管并反复将拭子在试管内壁推擦，同时彻底旋转拭子，顺时针10次，逆时针10次。在处理前需充分混匀微生物样品。用生理盐水对皮肤样品进行系列稀释，稀释梯度从10⁻¹至10⁻⁶。取100 µL未稀释样品及各稀释梯度样品接种至已制备的琼脂平板上。使用无菌L型涂布棒，将样品均匀涂布于琼脂表面，确保分布均匀，避免施加过大压力。将接种后的平板倒置，置于20至25摄氏度的培养箱中培养3至5天，以促进两栖动物皮肤上嗜温菌和嗜冷菌的生长。培养结束后，挑选形态特征明显的细菌菌落进行进一步分析。确保所选菌落分离良好，并在颜色、大小、形状、边缘、表面或质地等方面表现出不同特征。对选定菌落进行划线纯化时，需在无菌条件下，用接种环从原始琼脂平板上挑取一个分离良好的菌落，转移至新的新鲜琼脂平板上。通过划线法分离菌落，随后进行适当培养。此处展示的是在野外环境下，使用无菌工具对意大利洞螈（Speleomantes italicus）个体进行协调采样的操作过程。采样由两名操作人员完成，佩戴无菌手套并使用无菌拭子，以尽量减少对两栖动物的应激，并确保操作过程的精确性。采样后，拭子立即转移至含20%甘油的生理盐水中，以在运输至实验室过程中保持微生物完整性。此处展示了添加与不添加甘油的生理盐水保存条件下微生物群落密度的比较结果。未添加甘油的生理盐水保存样品中细菌载量显著低于对照组及含甘油生理盐水组。在含甘油生理盐水中保存的微生物群落其细菌载量与对照组相似，表明微生物完整性得以保持。在4摄氏度下用含甘油生理盐水保存时，微生物群落的保存效果最佳，细菌载量在时间过程中最为稳定。室温下仅用生理盐水保存则导致细菌载量最高，提示可能存在微生物污染或某些细菌类群被选择性促进生长。在-20摄氏度下冷冻保存会降低细菌载量，表明低温对微生物存活产生负面影响。