动脉粥样硬化小鼠模型中主动脉弓及主动脉根部病变的分离与分析

本研究探讨了LDLR基因敲除小鼠主动脉弓和主动脉根部动脉粥样硬化病变的发展，提供了一种用于评估动脉粥样硬化严重程度及斑块成分的组织分离、染色和分析方案。除本研究中使用的组织学检查方法外，评估动脉粥样硬化的实用技术还包括生物化学标志物检测、分子生物学检测以及血管超声检查。在小鼠动脉粥样硬化模型中进行体内主动脉剥离时，解剖操作的精确性是最大的技术难点。

首先，将已处死的小鼠仰卧位放置在覆盖有一到两层吸水纸的泡沫板上。用针固定四肢以稳定身体。向小鼠腹部喷洒75%乙醇，以清洁并润湿毛发。

用镊子夹住小鼠的腹侧皮肤，然后使用精细剪刀从腹部基部向颈部顶端剪开皮肤。切开腹壁，并用镊子提起胸骨。

切开膈肌和肋骨以暴露胸腔。移除食管和气管，以便清理颈动脉。仔细移除肝脏、肺、脾脏、胃肠道和胰腺等器官，同时保留肾脏和腹主动脉。

解剖肠系膜动脉时，应抬起肠道，并远离主动脉进行切口，以避免损伤。现在将小鼠置于体视显微镜下，以提供清晰的观察视野，并将冷光源与解剖区域对齐。使用装有 PBS 的 10 毫升注射器，用针头缓慢注入左心室心尖部位，观察主动脉的扩张情况。

用纸巾轻轻擦去解剖区域的血液和液体，充分暴露视野。接着，用镊子夹住膈肌段的胸主动脉，使用弹簧剪剪开主动脉与胸壁肌肉之间的结缔组织。用镊子轻轻牵拉心脏，并提起胸主动脉。

观察主动脉弓的分支，沿胸主动脉向上解剖主动脉弓及其分支周围的外膜脂肪和结缔组织。沿胸主动脉向下解剖腹主动脉和髂总动脉。修剪心脏组织，沿与心房平行的平面切开心脏的下半部分，并将修剪后的心脏置于合适的保存介质中。

在解剖主动脉弓之前，将其下方放置一个颜色较深的小垫片以形成对比。拍摄主动脉弓区域的照片。在髂总动脉分叉下方1至2毫米处剪断，并修剪沿脊柱走行的主动脉小分支，以游离主动脉。

在靠近肾脏处离断肾动脉后，从远端切断颈部的三条分支血管。最后，在靠近心脏处切断升主动脉。预先在1.5毫升离心管中准备1毫升4%多聚甲醛溶液。

将主动脉放入已准备好的试管中，在室温下固定至少24小时。随后，将主动脉转移至含有PBS的培养皿中，以防止其干燥。在体视显微镜下，使用镊子和弹簧剪仔细去除残留的外膜脂肪组织，以减少对斑块定量分析的干扰。

使用弹簧剪沿主动脉内侧的纵轴小心剪开。随后，沿主动脉弓的外侧依次剪开其三个分支，直至主动脉弓弯曲处的水平，使其充分展开。此时，可立即进行油红O染色，或将来用于分析的样本将主动脉保存于4%多聚甲醛中。

将切开的主动脉放入六孔板中。每孔加入一毫升无菌双蒸水，在摇床上清洗五分钟。将六孔板置于通风橱中，晾干20分钟，直至无可见水渍残留。

向每个孔中加入一毫升 freshly prepared Oil Red O 工作液。将培养板震荡 20 分钟后，移除各孔中的 Oil Red O 溶液。向每个孔中加入两毫升无菌双蒸水，洗涤五分钟。

经过三次洗涤后，将主动脉置于双蒸水中。将主动脉转移至载玻片上，并在载玻片下方放置黑色橡胶垫以增强对比度。在体视显微镜下观察的同时将主动脉展开。

现在，将切片置于一张白纸上以进一步增强对比度。在切片旁放置一把直尺，并用相机拍摄照片。将处理过的主动脉保存在含有1毫升PBS的1.5毫升离心管中，以保持其湿润。

与喂食普通饲料的小鼠相比，喂食西方饮食的LDLR基因敲除小鼠体重显著增加。西方饮食组小鼠的血浆甘油三酯和总胆固醇水平显著高于对照组。主动脉油红O染色显示，与喂食普通饲料的小鼠相比，喂食西方饮食的LDLR基因敲除小鼠动脉中脂质积聚更为严重。

脂质沉积增加与更严重的动脉粥样硬化病变相关。与普通饲料喂养的小鼠相比，西方饮食喂养小鼠的主动脉根部病变面积和坏死核心区域显著增大。对主动脉根部病变面积和坏死区域的定量分析证实，西方饮食加剧了LDLR基因敲除小鼠的动脉粥样硬化斑块形成。