通过多色流式细胞术分析血小板亚群

我们的研究采用多色流式细胞术来鉴定和表征血小板亚群，旨在理解其在血栓形成、炎症及特定疾病背景下的作用、活化模式及临床相关性。已建立的多色流式细胞术检测方法能够观察到血小板激动剂可诱导出独特的活化模式，并且与胶原相关肽相比，可产生促凝血性的血小板亚群。该多色检测技术能够在单个试管中，对分离的人血小板群体中的单个血小板同时测量其活化、黏附、聚集以及凋亡潜能。

[Instructor] 首先，准备好实验所需的所有试剂。将10毫升10倍浓度的Tyrode缓冲液与90毫升蒸馏水混合。加入0.1克葡萄糖，并用hepes调节总体积的pH至7.4。首先将10毫升缓冲液的pH调至7.4，然后用1 N盐酸将剩余90毫升缓冲液的pH调节至6.5。采集血液样本时，为每位供体准备一支10毫升注射器，并加入2毫升ACD抗凝剂。让注射器在室温下平衡。用预热的含ACD抗凝剂的注射器采集供体血液后，缓慢将经ACD处理的血液转移至15毫升反应管中。在室温下以209×g离心20分钟（不使用刹车）。同时，在50毫升反应管中准备25毫升Tyrode's Hepes缓冲液（pH 6.5）。离心后，小心地将上层富血小板血浆层转移至含有Tyrode's Hepes缓冲液的试管中。为防止污染，在白细胞层和红细胞层上方保留约1毫升富血小板血浆。然后，在室温下以430×g离心10分钟，使血小板沉淀。弃去上清液，并用200至300微升pH调至7.4的Tyrode缓冲液小心重悬血小板沉淀。使用细胞计数仪测定血小板数量，并用pH 7.4的Tyrode's Hepes缓冲液调整至每微升20万个血小板。对于染色前无需激活的受体（包括CD61、CD42B、CD41、CXCR7和CXCR4），每种抗体分别准备一份未染色样本和一份染色样本。对于需要激活的受体或标志物（如PAC-1、CD63、CD62P、NXN5和zombie NIR），使用终浓度为10微克/毫升的CRPXL进行样本激活，并同时准备激活和未激活的样本。为激活血小板，将其与10微克/毫升的CRPXL在37℃孵育30分钟。然后，将分离的血小板与不同浓度的荧光素偶联抗体或染料在室温避光条件下孵育30分钟。随后，向每个样本中加入300微升annexin结合缓冲液进行稀释。使用流式细胞仪对每个样本检测10,000个事件。计算每种抗体的染色指数，以确定阳性与阴性群体之间的最佳分离度。绘制染色指数与抗体浓度的关系曲线，以确定每种抗体的最佳使用浓度。进行染色时，将hemin粉末溶于1.4 M氢氧化钠中，配制成3 M溶液。在450 rpm转速下于96℃加热5分钟。用蒸馏水稀释，得到3毫摩尔的储备溶液。将血小板数量调整为每样本100万个后，按照前述方法激活血小板。向每个样本中加入43.3微升抗体混合液，并在室温避光条件下孵育30分钟。孵育结束后，用300微升1× annexin结合缓冲液（含10毫摩尔hepes氢氧化钠，pH 7.4）稀释各样本。立即使用流式细胞仪检测每个染色样本。进行微球补偿时，为每种荧光染料准备150微升PBS，加入一滴微球和1微升荧光偶联抗体。为补偿annexin V，使用标记了与annexin V相同荧光染料的抗人CD62L的PECY7B七色微球。对于胺反应性染料，使用胺反应性补偿微球：在150微升PBS中加入两滴阳性微球、一滴阴性微球和1微升染料进行混合。确认阳性微球发生反应并显示信号，而阴性微球无信号。为每个标志物设置荧光减一对照（FMO）。散点图显示血小板群体出现明显偏移，其中hemin诱导产生低前向散射的血小板比例高于其他激动剂。ADP、凝血酶和CRPXL处理导致40%至60%的血小板CD42B呈阳性，而hemin显著减少了该群体的比例。所有血小板激动剂对CD41和CD61的表面表达均无影响。只有hemin显著增加了CXCR4和CXCR7的表面表达。此外，在hemin处理下，磷脂酰丝氨酸暴露也增强，导致annexin V阳性细胞比例上升。UMAP和phenograph分析定义了27个不同的血小板簇，其分布随激动剂类型而变化。hemin引起了最显著的簇模式改变。静息血小板亚群在ADP处理下保存最多，在hemin处理下保存最少。