黑腹果蝇基因座特异性核糖体 RNA 转录的单核苷酸多态性敏感 FISH 检测
March 28th, 2025
该方案描述了单核苷酸多态性敏感荧光 原位 杂交 （SNP-FISH） 方法，用于区分源自 黑腹果蝇中 X 或 Y 染色体核糖体 DNA 基因座的核糖体 RNA 转录物。
我们的研究重点是了解细胞如何感知、监测和调节其基因组内的多个核糖体 DNA 位点。具体来说，我们旨在揭示区分哪些 rDNA 位点被主动转录以及这些位点如何单独调节的机制。我们最近发现，细胞中 rDNA 的量会随着时间的推移而变化，而这种变化会改变转录的 rDNA 位点。
我们现在了解到，细胞会根据它们拥有的 rDNA 量改变它们的 rDNA 转录。这一发现让我们想知道细胞如何知道它们有多少 RDA，以及它们如何确定它们更喜欢表达哪个 rDNA 位点。我们的实验室现在专注于了解细胞用来区分不同 rDNA 位点和感觉并调节其活性的机制。
在立体显微镜下，解剖果蝇以在无 RNase 的 PBS 中分离睾丸。首先，用一对镊子抓住腹部中间，用另一对镊子抓住腹部末端，轻轻地将动物拉开。使用镊子将分离的睾丸从解剖皿转移到含有 0.5 毫升不含 RNase 的 PBS 的 1.5 毫升微量离心管中。
吸出 PBS 并加入 1 毫升固定液。将样品放在章动摇床上，在室温下放置 30 分钟。孵育后，吸出固定液。
然后在章动摇床上用 1 毫升 PBS 洗涤样品 2 次，每次 5 分钟。吸出 PBS 后，加入 1 毫升不含 RNase 的 70% 乙醇，并在 4 摄氏度下在章动摇床上孵育样品过夜。接下来，吸出乙醇并向样品中加入 1 mL 洗涤缓冲液。
将样品在室温下放在章动摇床上孵育 3 分钟。之后，让管子直立放置两分钟。将探针和掩码与杂交缓冲液混合，以制备每个样品总体积为 100 μL，如图所示。
然后在吸出洗涤缓冲液后向样品中加入 100 μL 杂交溶液。涂上透明薄膜以密封管的边缘。用铝箔包裹试管以避光，并将样品在 37 摄氏度的水浴中孵育至少 24 小时。
在不吸出杂交溶液的情况下，向样品中加入 1 mL 洗涤缓冲液。将样品在 37 摄氏度的水浴中避光孵育 30 分钟。吸出洗涤缓冲液后，向样品中加入 1 mL 新鲜洗涤缓冲液并再次孵育。
孵育结束时，吸出洗涤缓冲液并向样品中加入 50 μL 封固剂。在解剖立体显微镜下，使用移液器将样品转移到显微镜载玻片上。使用镊子将睾丸在显微镜载玻片上排成一条线，以便于成像过程中的样品识别。
用盖玻片盖住样品，并用纸巾擦干盖玻片的边缘以去除多余的封固剂。用指甲油密封盖玻片的边缘，并在室温下避光放置 10 分钟，让指甲油干燥。在核仁中检测到 rRNA 信号，表现为细胞核内的 DAPI 孔区域，特别是在具有大细胞核和核仁的生殖细胞中。
在缺乏 rRNA 位点的样品的细胞质中观察到微弱的非特异性信号。在大多数细胞中，仅检测到 YrRNA 信号，表明 rRNA 转录来自 YrDNA 基因座。在生殖细胞中观察到 X 和 YrRNA 的共表达，信号要么合并成一个细胞核，要么分离成两个核仁。
概述
本研究提出了一种用于单核苷酸多态性敏感荧光原位杂交（SNP-FISH）的协议，以区分果蝇中X和Y染色体核糖体DNA位点的核糖体RNA转录本。该研究旨在阐明细胞如何调控和转录不同的核糖体DNA位点。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 遗传学
- 细胞生物学
背景
- 细胞监控并调节其基因组内的核糖体DNA位点。
- 理解rDNA位点的转录调控至关重要。
- 最新发现表明，rDNA数量可以随时间变化。
- 细胞根据所含rDNA数量调整其rDNA转录。
研究目的
- 研究细胞如何区分不同的rDNA位点。
- 理解rDNA转录在细胞条件响应中的调控。
- 探索转录过程中rDNA位点偏好的机制。
所用方法
- 解剖果蝇以分离睾丸。
- 使用无RNase的PBS进行样品制备。
- 应用固定和杂交溶液。
- 使用荧光显微镜检测rRNA信号。
主要结果
- 在生殖细胞的核仁中检测到rRNA信号。
- 在某些细胞中观察到X和YrRNA的共同表达。
- 根据rDNA位点注意到不同的转录模式。
- 在缺乏rRNA位点的样品中发现微弱信号。
结论
- SNP-FISH方法有效区分rRNA转录本。
- 细胞根据rDNA位点活性表现出选择性转录。
- 本研究增强了对果蝇rDNA调控的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Discriminating locus-specific ribosomal RNA transcription is critical for understanding cellular adaptation and ribosomal biogenesis in disease-relevant systems. SNP-sensitive FISH enables direct visualization of rRNA transcriptional activity from distinct genomic loci, supporting mechanistic de-risking and target validation in early discovery. This capability enhances predictive confidence for translational research and portfolio triage in complex genetic backgrounds.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of locus-specific rRNA transcriptional regulation in single cells.
- Supports functional validation of regulatory mechanisms controlling ribosomal biogenesis.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing transcriptional sources in heterogeneous systems.
- Improves predictive confidence for prioritizing genetic targets affecting ribosome function.
Screening & Assay Development
- Provides a validated assay for quantifying locus-specific rRNA output in diverse cell types.
- Enables standardization of readouts for rRNA transcriptional activity across experimental conditions.
- Supports reproducible detection of transcriptional shifts in response to genetic or environmental perturbations.
- Prepares biological systems for downstream screening of modulators affecting rDNA locus activity.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models where ribosomal stress or locus switching is implicated.
- Enables continuity from discovery to preclinical validation by tracking locus-specific transcriptional changes.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing quantitative, locus-resolved transcriptional data.
- Facilitates biomarker development for ribosomal dysfunction in translational studies.
Pipeline & Workflow Integration
This SNP-FISH method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling locus-specific transcriptional analysis, supporting both hypothesis testing and quantitative assay development.
- Discovery Biology: Provides direct evidence for locus-specific transcriptional regulation and pathway clarification.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible readouts for rRNA transcription from individual loci.
- Analytics: Enables statistical comparison of transcriptional activity between rDNA loci under different conditions.
- Translational Research: Connects locus-specific transcriptional changes to disease models and biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly adaptable platform for locus-resolved transcriptional analysis across systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in ribosomal biology.
- Operational Value: Standardizes locus-specific transcriptional assays for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by clarifying regulatory mechanisms and transcriptional sources.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets and models with locus-specific transcriptional phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence in situ hybridization and single-cell analysis.
- Needs access to advanced fluorescence microscopy and image analysis infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization of probe design and hybridization protocols.
- Adaptation to other model systems may require locus-specific probe optimization.
- Interpretation is limited to systems with distinguishable rRNA sequence variants.
