黑腹果蝇基因座特异性核糖体 RNA 转录的单核苷酸多态性敏感 FISH 检测

我们的研究重点是了解细胞如何感知、监测和调节其基因组内的多个核糖体 DNA 位点。具体来说，我们旨在揭示区分哪些 rDNA 位点被主动转录以及这些位点如何单独调节的机制。我们最近发现，细胞中 rDNA 的量会随着时间的推移而变化，而这种变化会改变转录的 rDNA 位点。

我们现在了解到，细胞会根据它们拥有的 rDNA 量改变它们的 rDNA 转录。这一发现让我们想知道细胞如何知道它们有多少 RDA，以及它们如何确定它们更喜欢表达哪个 rDNA 位点。我们的实验室现在专注于了解细胞用来区分不同 rDNA 位点和感觉并调节其活性的机制。

在立体显微镜下，解剖果蝇以在无 RNase 的 PBS 中分离睾丸。首先，用一对镊子抓住腹部中间，用另一对镊子抓住腹部末端，轻轻地将动物拉开。使用镊子将分离的睾丸从解剖皿转移到含有 0.5 毫升不含 RNase 的 PBS 的 1.5 毫升微量离心管中。

吸出 PBS 并加入 1 毫升固定液。将样品放在章动摇床上，在室温下放置 30 分钟。孵育后，吸出固定液。

然后在章动摇床上用 1 毫升 PBS 洗涤样品 2 次，每次 5 分钟。吸出 PBS 后，加入 1 毫升不含 RNase 的 70% 乙醇，并在 4 摄氏度下在章动摇床上孵育样品过夜。接下来，吸出乙醇并向样品中加入 1 mL 洗涤缓冲液。

将样品在室温下放在章动摇床上孵育 3 分钟。之后，让管子直立放置两分钟。将探针和掩码与杂交缓冲液混合，以制备每个样品总体积为 100 μL，如图所示。

然后在吸出洗涤缓冲液后向样品中加入 100 μL 杂交溶液。涂上透明薄膜以密封管的边缘。用铝箔包裹试管以避光，并将样品在 37 摄氏度的水浴中孵育至少 24 小时。

在不吸出杂交溶液的情况下，向样品中加入 1 mL 洗涤缓冲液。将样品在 37 摄氏度的水浴中避光孵育 30 分钟。吸出洗涤缓冲液后，向样品中加入 1 mL 新鲜洗涤缓冲液并再次孵育。

孵育结束时，吸出洗涤缓冲液并向样品中加入 50 μL 封固剂。在解剖立体显微镜下，使用移液器将样品转移到显微镜载玻片上。使用镊子将睾丸在显微镜载玻片上排成一条线，以便于成像过程中的样品识别。

用盖玻片盖住样品，并用纸巾擦干盖玻片的边缘以去除多余的封固剂。用指甲油密封盖玻片的边缘，并在室温下避光放置 10 分钟，让指甲油干燥。在核仁中检测到 rRNA 信号，表现为细胞核内的 DAPI 孔区域，特别是在具有大细胞核和核仁的生殖细胞中。

在缺乏 rRNA 位点的样品的细胞质中观察到微弱的非特异性信号。在大多数细胞中，仅检测到 YrRNA 信号，表明 rRNA 转录来自 YrDNA 基因座。在生殖细胞中观察到 X 和 YrRNA 的共表达，信号要么合并成一个细胞核，要么分离成两个核仁。