线粒体膜电位的测定 在体实验 使用基因编码的电压指示剂

摘要

本方案描述了靶向线粒体的基因编码电压指示剂（GEVIs）的应用。与传统的线粒体膜电位染料相比，这些GEVIs能够实现特异性、活体（in vivo）和实时的线粒体膜电位监测，具有显著优势。

摘要

线粒体膜电位（MMP，ΔΨ_m）对线粒体功能至关重要，包括ATP合成、离子转运、活性氧（ROS）生成以及细胞核编码蛋白的导入。目前测量ΔΨ_m的方法通常使用亲脂性阳离子染料，如罗丹明800和四甲基罗丹明甲酯（TMRM），但这些方法存在特异性低的局限性，且不适用于体内应用。为克服这些局限，我们开发了一种利用基因编码电压指示剂（GEVIs）的新方法。基因编码电压指示剂（GEVIs）能够响应膜电位变化产生荧光信号，在监测质膜和神经元电位方面已展现出显著潜力。然而，其在线粒体膜上的应用尚未被探索。在此，我们开发了基于蛋白质的线粒体靶向GEVIs，可在活体动物的细胞和运动皮层中检测ΔΨm的波动。线粒体电位指示剂（MPI）提供了一种非侵入性方法，用于实时研究ΔΨ_m动态变化，从而为在正常和病理条件下探究线粒体功能提供了新途径。

引言

线粒体是真核细胞中至关重要的细胞器，主要通过三磷酸腺苷（ATP）的生成为细胞提供能量，同时还执行多种其他关键功能，如代谢物合成、钙离子缓冲、产热以及调控细胞存活¹。这些功能在脑和心脏等高代谢组织中尤为重要，有助于维持细胞稳态。线粒体膜电位（MMP, Ψ_m）在这些过程中居于核心地位，包括驱动通过氧化磷酸化合成ATP、促进代谢物和离子跨线粒体膜的转运，以及参与活性氧（ROS）的生成^2,3。MMP还影响线粒体的形态与动态变化⁴，包括线粒体自噬（线粒体的选择性降解）⁵和细胞凋亡（程序性细胞死亡）⁶。维持适当的Ψ_m对细胞功能至关重要；其失调与多种病理状态相关，包括神经退行性疾病、心力衰竭和癌症。目前测量Ψ_m的方法主要依赖于脂溶性阳离子染料，如TMRM（四甲基罗丹明甲酯）、TMRE（四甲基罗丹明乙酯）、罗丹明123、藏红O、罗丹明800、DiOC6、JC-1等⁷。然而，这些荧光分子存在若干局限性。这些染料缺乏细胞特异性，易受淬灭影响，部分还具有毒性。此外，它们会随时间发生扩散，当线粒体ΔΨ丧失时，染料会泄漏出去，导致无法指示去....

方案

所有动物护理和实验均按照郑州大学机构动物护理和使用委员会的指南进行。使用前对所有手术器械进行灭菌。遵循无菌技术以防止感染。在获取全部数据后，采用过量吸入麻醉剂使动物安乐死，随后进行断头处理。

1. 体外 应用

1. 质粒构建
   1. 从 Addgene 获取加速型动作电位传感器 1（ASAP1）和 ASAP3 基因，或根据序列进行合成。（ASAP1，NCBI 登录号：AHV90412.1，Addgene 编号：52519；ASAP3，Addgene 编号：132331）。
   2. 使用 表1 中列出的引物进行质粒构建。
   3. 为在细胞中表达，使用 EGFPN1 载体进行构建。
      1. 首先，合成 cox8 基因序列（NP_004065，氨基酸 1-29），在其两侧添加四个串联重复序列（4cox8），并以 NheI 和 XhoI 限制性酶切位点进行侧翼修饰。用 NheI 和 XhoI 分别对合成的 4cox8 片段和 EGFPN1 载体进行双酶切，随后连接，构建 4cox8-EGFP 载体。
      2. 随后，使用引物 1 和引物 2 对 ASAP1 序列进行 PCR 扩增。用 SalI 和 NotI 对 ASAP1 片段和 4cox8-EGFP 载体进行双酶切，连接后构建最终的 MPI-1 载体（....

结果

构建CMV-MPI-1质粒后，使用线粒体标记物Rhodamine 800对Hela细胞进行染色，检测其靶向线粒体的能力。共定位实验显示，MPI-1的荧光信号与Rhodamine 800的信号之间存在高度重叠，表明MPI-1成功定位于线粒体（图3）。

图3：MPI-1 在 Hela 细胞中与线粒体的共定位。 将 CMV-MPI-1 转染至 Hela 细胞，并使用对线粒体膜电位敏感的染料罗丹明 800（rhodamine 800）进行.......

讨论

在静息状态下，线粒体膜电位维持在 -120 至 -180 mV 之间，并随代谢状态的变化而波动。目前，线粒体膜电位的测量可通过电生理学方法和荧光染料方法实现。线粒体膜片钳技术需要分离线粒体并破坏细胞结构¹³，该方法可能导致测量结果偏离生理条件。荧光探针法是测量线粒体膜电位的常用方法。然而，这些荧光分子无法特异性地标记特定细胞，易发生淬灭，且部分染料具有毒性。此外，由于存在缺乏细胞特异性以及在较长时间尺度（约 30 分钟）内达到平衡等固有局限性，这些染料不适用于活体（in vivo）应用。

本方案提供了一种监测线粒体膜电位（MMP）的新方法，尤其适用于活体监测。in vivo。该方法的关键在于寻找一种合适的基因编码电压指示剂（GEVI），通过将其N端与线粒体靶向信号融合，实现其在线粒体上的靶向定位。先前研究表明，某些GEVI（如Arclight和SomArchon）无法在线粒体中正确定位¹²。然而，动作电位加速传感器（accelerated sensor.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BamHI	Thermo	FD0054
氯化钙	Sigma	C4901
CCCP	Sigma	C2759
离心机	eppendorf	5430R
细胞培养离心机	eppendorf	5810R
CO2 细胞培养箱	ESCO	170L IR Sensor
盖玻片	Glaswarenfabrik Karl Hecht GmbH & Co.KG	92100100030
牙科粘接树脂水泥	Sun medical company, LTD.	Super-Bond C&B Kit
D-葡萄糖	Sigma	G7021
DNA连接试剂盒 Ver. 2.1	Takara	6022
杜尔贝科改良伊格尔培养基	Gibco	11965092
电动钻	RWD Instruments	78001
胎牛血清	Gibco	A5670701
光纤套管	RWD Instruments	R-FOC-L200C-39NA
光纤光度检测仪	Thinker	QAXK_FPS-TC-MC-LED
荧光显微镜	Olympus	IX83
玻璃移液管（用于注射）	Drummond Scientific company	3.5" Drummond # 3-000-203-G/X
HEK293t	ATCC	Cat# CRL-3216
HeLa细胞	ATCC	Cat# CCL-2
HEPES	Sigma	H3375
注射泵	Drummond Scientific company	3-000-207
异氟烷	RWD Instruments	R510-22
激光扫描共聚焦显微镜	Zeiss	LSM980
MluI	Thermo	FD0564
NheI	Thermo	FD0974
光纤	RWD Instruments	R-FC-L-N3-200-L1
石蜡油	Sangon	B500301
PCR扩增仪	analytik jena	Biometra Tone 96G
戊巴比妥钠	Sinopharm Chemical Reagent Co.LTD	57-33-0
氯化钾	Sigma	P5405
PrimeSTAR HS DNA聚合酶	Takara	R010A
程序化微电极拉制仪	Sutter Instruments	P2000
快速自固化丙烯酸树脂	Yamahachi	V-PINK
实时荧光定量PCR扩增仪	analytik jena	qTOWER³ auto
罗丹明800	Sigma	83701
SalI	Thermo	FD0644
氯化钠	Sigma	S9888
磷酸氢二钠	Sigma	S9763
立体定位仪	RWD Instruments	E06354
兽用眼科软膏	Puralube	NA
XhoI	Thermo	FD0694