Name: 人肾小管上皮细胞原代培养物在单层和三维条件下的发育 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-13T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: 学习人肾小管上皮细胞原代培养技术，建立单层和三维培养模型，用于研究志贺毒素对肾脏细胞的毒性作用及溶血性尿毒综合征的病理机制。

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我们感谢阿根廷布宜诺斯艾利斯市“佩德罗·德·埃利萨尔德儿科医院小儿外科科儿科泌尿外科团队”提供肾组织样本。本研究获得了布宜诺斯艾利斯大学（UBACYT20020190100072BA）向 C. Silberstein 提供的资助，以及阿根廷国家科学技术研究理事会（CONICET：PUE 0041）向 C. Ibarra 和 C. Silberstein 提供的资助。本研究还部分得到了伊比利亚美洲科学技术发展计划（CYTED）（通过 STEC/SUH 网络 Nº 224RT0152）的支持。

儿童佩德罗·德·埃利萨尔德综合医院伦理委员会批准了使用人类肾组织建立原代细胞培养物用于科研目的。已从儿童的直系亲属或监护人处获得书面知情同意，授权将肾脏样本用于科研。
注意：人肾小管上皮细胞（HRTEC）的原代培养物来源于在阿根廷布宜诺斯艾利斯的佩德罗·德·埃利萨尔德儿科综合医院接受肾切除术的儿科患者，手术指征为泌尿系统疾病矫正或肿瘤切除。
1. 人肾小管上皮细胞（HRTEC）原代培养的建立
注意：皮质肾组织碎片取自在医院接受肾切除术的儿科患者所移除的肾脏。人肾小管上皮细胞（HRTEC）的原代培养按照先前描述的方法进行11。
该方案在以下步骤中进行描述：
<ol>
	<li>将肾组织碎片置于无菌的磷酸盐缓冲液（PBS）或汉克斯平衡盐溶液（Hanks）中冷藏，直至在实验室进行处理。</li>
	<li>用镊子剥离肾包膜，分离肾皮质与髓质，并将其切成约1 mm大小的小块。</li>
	<li>进行消化时，将肾组织碎片放入不含Ca2+和Mg2+的无菌Hanks溶液中，加入0.1% I型胶原酶。
	<ol>
		<li>在37 °C条件下振荡孵育肾组织碎片30分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为终止消化，加入等体积含10%胎牛血清（FBS）的PBS，并在4 °C预冷的离心机中以160 × g离心10分钟，共洗涤三次。每次离心后弃去上清液，并用相同溶液重悬沉淀。</li>
	<li>将消化产物通过孔径70 µm的滤网，以过滤出肾小管，弃去滞留在滤网上未通过的肾小球。</li>
	<li>将滤过的肾小管在4 °C条件下以160 × g离心10分钟，弃去上清液，将沉淀重悬于不含Ca2+和Mg2+的无菌Hanks溶液中，并加入0.2% I型胶原酶。
	<ol>
		<li>在37 °C条件下振荡孵育样品30分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为终止消化，加入等体积含10%胎牛血清（FBS）的PBS。
	<ol>
		<li>在4 °C预冷的离心机中以160 × g离心10分钟，共洗涤三次。每次离心后弃去上清液，并用相同溶液重悬沉淀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>最后一次离心后，将细胞沉淀重悬于5 mL完全培养基中（RPMI 1640培养基，添加5% FBS、L-谷氨酰胺[2 mmol/L]、青霉素[100 U/mL]、链霉素[100 µg/mL]以及内皮细胞生长补充物[ECGS, 1%]）。
	<ol>
		<li>将细胞悬液接种至带有通气盖的25 cm2培养瓶中。</li>
		<li>将细胞置于37 °C、湿润环境及5% CO2条件下孵育。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>次日，用PBS洗涤细胞培养物三次：每次弃去培养瓶中的液体，加入5 mL PBS，再更换为5 mL完全培养基。这些洗涤步骤可去除未完全消化的红细胞和肾小管碎片，以及未贴壁于培养瓶的成分。</li>
	<li>将上皮细胞置于细胞培养孵箱中，在37 °C条件下孵育，使其贴壁生长形成单层并达到汇合状态。</li>
	<li>每3天更换一次新鲜的完全培养基，并每天在倒置显微镜下观察细胞生长情况。</li>
</ol>
三维人视网膜色素上皮细胞培养模型的建立（3D-HRTEC）
注意：本部分提供建立三维培养物（3D-HRTEC）的步骤。3D-HRTEC 培养操作依据先前所述方法进行12。
<ol>
	<li>使用 Engelbreth-Holm-Swarm 小鼠肉瘤来源的基底膜基质（BM 基质）。该 BM 基质以冷冻状态提供，在此状态下保持固态。按照制造商说明，在 4 °C 冰箱中将 BM 基质溶液置于冰浴中过夜解冻。</li>
	<li>在加入 BM 基质前，将移液器吸头预先在冷冻室中冷却，并将多孔板置于冰上，以防止操作过程中基质过早凝固。</li>
	<li>取适量液态 BM 基质（150 mL/cm2），加入每孔中以覆盖孔底。将多孔板置于 37 °C 细胞培养箱中孵育 1 小时，使 BM 基质转化为凝胶状态。</li>
	<li>与此同时，为消化融合生长的 HRTEC 原代细胞，弃去培养瓶中的培养基，加入 1 mL 含 0.25% 胰蛋白酶和 0.02% EDTA 的溶液。
	<ol>
		<li>将液体均匀覆盖整个培养瓶表面，在 37 °C 细胞培养箱中孵育 5 分钟。</li>
		<li>在倒置显微镜下观察所有细胞是否已完全脱落。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用 10 mL 培养基或 PBS 重悬细胞，转移至 15 mL 离心管中，在 4 °C 条件下以 160 × g 离心 10 分钟。
	<ol>
		<li>弃去上清液，用含有与 HRTEC 原代培养相同补充成分的完全培养基重悬细胞沉淀。</li>
		<li>使用血细胞计数板（Neubauer 计数室）对细胞数量进行计数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>每孔接种 4 × 104&#160;个细胞（150 µL），接种于 BM 基质上。将细胞培养物置于 37 °C 细胞培养箱中，在湿润气氛和 5% CO2 条件下培养数天。</li>
	<li>每隔 2 天更换一次新鲜培养基。</li>
	<li>在倒置光学显微镜下观察细胞聚集情况及管状结构的形成。</li>
</ol>

<ol><li>Rivas, M., Chinen, I., Miliwebsky, E., Masana, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risk+factors+for+Shiga+toxin-producing+Escherichia+coli-associated+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Spectr%22%5BJournal%5D)">Risk factors for Shiga toxin-producing Escherichia coli-associated human diseases.</a> Microbiol Spectr. 2 (5), (2014).</li>
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</ol>

作者声明无利益冲突。

原代培养应在肾切除术当天进行。为确保细胞的形态发生稳定性，HRTEC 原代培养物可在第1至第5代次之间使用。第五代以后，细胞开始出现形态改变，呈现成纤维细胞样外观或空泡增多，并可能进入静止状态。
如果使用较大的肾组织片段，消化后细胞裂解所释放的DNA可能会干扰洗涤过程。此时，建议使用更大体积的消化液和洗涤液。此外，还可向消化液中添加0.04%的DNase IV6。
之前通过水通道蛋白1（AQP1）的免疫荧光染色对人肾小管上皮细胞（HRTEC）原代培养物进行了表征，结果显示超过90%的细胞AQP1呈阳性，表明HRTEC原代培养物具有肾近端小管来源13。此外，所有细胞均未被内皮细胞抗体PECAM CD31染色9。AQP1定位于人肾近端小管上皮细胞的顶膜和基底外侧膜。
使用已建立的细胞系可能替代原代培养；然而，已建立的细胞系可能会改变许...

在本研究团队中，采用单层培养和三维培养（3D-HRTEC）条件建立的人肾小管上皮细胞（HRTEC）原代培养模型，用于研究儿童肾脏中志贺毒素2型（Stx2）在感染产志贺毒素大肠杆菌后所引发的细胞毒性作用 大肠杆菌 (STEC)
Stx1 和 Stx2（Stxs）是产志贺毒素大肠杆菌（STEC）的主要毒力因子，可导致腹泻后溶血性尿毒综合征（HUS）1。HUS 是一种全身性并发症，约影响 5–10% 的 STEC 感染儿童，表现为溶血性贫血、血小板减少和儿童急性肾损伤（AKI），需进行支持性治疗2。在阿根廷，STEC-HUS 是一种地方性疾病，5 岁以下儿童的年发病率为每 10 万人中 6.52 例（全球最高），是急性肾损伤的主要病因之一3。尽管病死率低于 4%3，但约 50% 的患者会出现肾脏后遗症，是我国儿童肾移植的第二大常见原因4,5。
在志贺毒素2（Stx2）被细胞内化并发挥其细胞毒性作用之前，会特异性地结合于靶器官细胞表面表达的糖脂类 globotriaosylceramide（Gb3）受体6。由于肾脏中存在对Stx敏感的细胞，且肾上皮细胞和内皮细胞表达大量具有生物学活性的Gb3受体，因此肾脏是Stx最主要的受损器官7,8。
既往在单层培养的HRTEC中开展的研究表明，Stx2可抑制蛋白质合成，降低细胞活力和细胞增殖，并诱导细胞凋亡和坏死9,10,11,12。此外，3D-HRTEC暴露于Stx2后，细胞迁移以及具有肾近端小管特征的管状结构形成均受到抑制12,13。
通过检测5-溴-2-脱氧尿苷（BrdU）在细胞周期S期细胞DNA中的掺入情况，评估了雌二醇对HRTEC原代培养细胞及3D-HRTEC培养细胞增殖的影响14。
为了分离上皮细胞，我们从因需矫正泌尿系统疾病而进行的小儿肾切除术所获取的肾组织碎片开始。

<table><tbody><tr><td>Ⅰ型胶原酶</td><td>Sigma Merck, St Louis, MO, USA</td><td>637958</td><td></td></tr><tr><td>内皮细胞生长补充剂</td><td>Sigma Merck, St Louis, MO, USA</td><td>E2759</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel 基底膜基质</td><td>BD Biosciences, USA; Sigma Merck, St Louis, MO, USA</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m 孔径筛网滤器</td><td>BD Bioscience, MA, USA</td><td>css010070</td><td></td></tr><tr><td>含 L-谷氨酰胺的 RPMI 1640 培养基&amp;nbsp;</td><td>Sigma Merck, St Louis, MO, USA</td><td>R8758-500ml</td><td></td></tr><tr><td>不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的 Hanks&amp;rsquo; 平衡盐溶液&amp;nbsp;</td><td>Gibco Invitrogen, NY, USA</td><td>14175046</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA 溶液</td><td>Sigma Merck, St Louis, MO, USA</td><td>T4049</td><td></td></tr></tbody></table>

单层及三维条件下人肾小管上皮细胞原代培养体系的建立

Development of Human Renal Tubular Epithelial Cell Primary Cultures in Monolayers and Three-Dimensional Conditions

人肾小管上皮细胞（HRTEC）原代培养物来源于阿根廷布宜诺斯艾利斯市佩德罗·德·埃利萨尔德儿科综合医院小儿肾脏病科因临床指征接受肾切除术的儿科患者所切除的肾脏组织。在肉眼观察下，将外观正常的肾皮质从肾髓质中分离，并切割成小块。皮质组织块随后在添加了0.1% I型胶原酶的Hank's溶液中进行消化，并通过孔径为70 µm的滤网过滤，以分离肾小管与肾小球。肾小管再经胶原酶二次消化以获得上皮细胞。最后终止酶消化过程，并将上皮细胞接种于含补充成分的RPMI 1640培养基中，在37 °C、5% CO2条件下培养至细胞融合。HRTEC细胞可在96孔板、置于24孔板中的玻璃盖玻片或胶原蛋白包被的细胞培养插件上以单层形式培养。此外，将HRTEC细胞接种于基底膜（BM）基质上可获得三维人肾小管上皮细胞（3D-HRTEC）培养模型。在此过程中可观察细胞聚集及管状结构的形成。多年来，我们一直使用HRTEC原代培养模型研究志贺毒素在儿童肾脏中引起的细胞毒性作用，该毒性可导致溶血性尿毒综合征（HUS）相关的病理生理改变。HRTEC和3D-HRTEC培养模型均可用于评估不同毒素、合成药物、生物因子、激素等对人肾近端小管上皮的特异性影响。

汇合的HRTEC原代培养细胞在光学显微镜下显示出相似的形态（图1）。如我们先前发表的研究所述，通过免疫荧光使用针对水通道蛋白1（AQP1）和血小板内皮细胞黏附分子CD31（PECAM CD31）的抗体对细胞进行表征9,12,13。免疫荧光结果显示，超过90%的HRTEC对AQP1呈阳性反应，表明其来源于人肾近端小管。此外，所有细胞均不表达内皮细胞标志物抗体PECAM CD319。
如图2所示，HRTEC可形成管状结构（成管作用），其形态与人类肾脏中的原始肾小管具有相似性。在基底膜基质上接种后约4-10小时，HRTEC发生迁移并形成多细胞索状结构；接种后1天左右，出现细胞聚集体，并逐渐发育为管状结构。培养3-8天后，这些三维管状结构持...

本文介绍了从肾皮质获取人肾小管上皮细胞（HRTEC）原代培养物的实验方案，用于在细胞外基质上建立单层和三维培养体系（3D-HRTEC）。

人肾小管上皮细胞（HRTEC）原代培养物取自因需行肾切除术而切除肾脏的儿科患者，其手术指征包括……

建立人肾小管上皮细胞的原代培养和三维培养模型，用于研究志贺毒素的细胞毒性作用，该毒素可引发病理生理改变，最终导致溶血性尿毒综合征。目前尚无针对溶血性尿毒综合征的特异性治疗方法，因此，当前的研究挑战在于利用人肾小管上皮细胞（HRTEC）原代培养体系评估药物对志贺毒素在人肾脏中作用的抑制效果。志贺毒素已被证明可抑制细胞活力和增殖，诱导原代HRTEC培养物中的细胞凋亡，并抑制三维HRTEC培养中管状结构的形成。该方案的优势在于能够研究上皮细胞在保留人肾近端小管原始特性的细胞培养体系中的功能机制。首先，使用镊子解剖肾包膜。分离肾皮质与髓质，将皮质切成约1毫米大小的小片段。将肾组织片段置于不含钙和镁的无菌Hanks溶液中，该溶液需添加0.1% I型胶原酶以进行消化。在37摄氏度条件下，于振荡器中孵育肾组织片段30分钟。为终止消化，加入一倍体积的磷酸盐缓冲液（PBS），其中含有10%胎牛血清（FBS）。将样品在4°C预冷的离心机中，以160×g离心10分钟，洗涤三次；每次离心后弃去上清液，并将沉淀重新悬浮于相同溶液中。将消化产物通过70微米孔径的细胞筛过滤，以分离肾小管，弃去滞留在滤器中的肾小球。将过滤后的肾小管在4°C条件下以160 × g离心10分钟。弃去上清液后，用不含钙和镁的无菌Hanks溶液重悬沉淀，该溶液中添加0.2% I型胶原酶。将样品在37°C下振荡孵育30分钟。为终止消化，在样品中加入等体积含10%胎牛血清（FBS）的磷酸盐缓冲液（PBS），然后按前述方法通过离心洗涤样品。最后一次离心后，将细胞沉淀重悬于5毫升完全培养基中，转移至25平方厘米带透气盖的培养瓶中。盖紧培养瓶盖，于37摄氏度、含5%二氧化碳的湿润环境中孵育细胞。加入培养基并在37摄氏度再次孵育后，在倒置显微镜下观察细胞。取液态基底膜基质，按每平方厘米150微升的体积，分装至多孔板的每个孔中，使其覆盖孔底。将多孔板置于细胞培养孵箱中，在37摄氏度孵育1小时，使基质凝固形成凝胶。弃去培养瓶中的培养基后，加入1毫升含0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶溶液，以分离汇合的原代HRTEC细胞。将溶液均匀覆盖培养瓶表面，于37摄氏度孵育5分钟。在倒置显微镜下观察细胞，以确认细胞完全脱落。将脱离的细胞在10毫升PBS或培养基中重悬后，在4摄氏度下以160×g离心10分钟。弃去上清液，将沉淀用与原代HRTEC培养相同的完全培养基（含相同补充物）重悬，并使用血细胞计数板对重悬的细胞进行计数。每孔加入150微升培养基，接种40,000个细胞至已固化的基底膜基质上，将细胞培养物置于37摄氏度、含5%二氧化碳的湿润 atmosphere 中培养数天。定期使用倒置光学显微镜观察培养物，以监测细胞聚集及管状结构的形成。接种于基底膜基质上的HRTEC在培养最初4至10小时内即通过迁移并排列成多细胞索状结构，启动管状形成过程。接种后约一天，细胞聚集体从索状结构中出现，并开始形成早期管状结构。三维管状结构在培养3天和8天后持续伸长并逐渐成熟。对三维HRTEC结构进行苏木精-伊红染色显示，中央管腔周围环绕着上皮细胞。免疫荧光证实，在三维HRTEC上皮细胞的顶膜和基底外侧膜均表达水通道蛋白1，其表达模式与人肾近端小管中的表达模式一致。

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