Name: 通过扩增显微镜对 奇异变形杆菌 生物膜进行超分辨率成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: 学习使用PmbExM扩增显微镜技术对奇异变形杆菌生物膜进行超分辨率成像。该方法通过各向同性扩增样品4.3倍，利用常规显微镜实现纳米级结构可视化，无需复杂数据处理即可解析生物膜细胞及亚细胞空间组织。

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作者感谢 Juan Eduardo Rodríguez 博士和 Ulrich Kubitschek 教授（波恩大学）为 SCIAN-Lab 扩展技术的实施所做出的贡献。本研究由以下项目资助：ANID 项目 ICM P09-015-F（SH、DC、KP、JJW）、FONDECYT 1211988（SH、DC、KP）、FONDECYT 3220832（JJW）、FONDEQUIP EQM210020（DC、KP、JJW、JT、NCH、PS、SH）；Núcleo SELFO NCN2024_068（SH、KP、JJW），&#160;CORFO 16CTTS- 66,390，MINEDUC 拨款 RED 21994（SH），BASAL FB210005（SH），DAAD 57519605（SH、NC），&#160;Centro CTI230006（SH），&#160;FONDEF ID 23I10337（SH），以及区域双边合作项目 Cooperación SUR-SUR AUCI / AGCID BIL-URY-2019-661（SH、NCH、PS、MJG）。

PmbExM 整体流程概述如下 图1请参阅 补充文件 1 以查找本研究中使用的所有已命名溶液（即单体溶液、蛋白酶K消化液等）的组成成分。同样，请参考 补充文件2，补充文件3，以及 补充文件 4 为简化数据处理与分析流程，使缺乏图像处理经验的研究人员也能顺利操作。该实验方案可在2.5至3周内顺利完成：第一周用于盖玻片的清洗与灭菌、生物膜培养及样品固定；第二周进行样品染色及PmbExM实验操作；第三周用于样品封片与图像采集。此外，建议预留1周时间准备所需的材料与溶液。本研究中所用试剂、材料、设备及软件的详细信息列于下文 材料表.
<img alt="PmbExM 实验流程图，详细展示聚合物消化、H2O透析及用于生物膜分析的显微观察步骤。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67932/67932fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：PmbExM 实验流程中的固定、聚合、消化与透析步骤，用于成功扩增、观察和分析 P. mirabilis 生物膜。 左侧列展示了样品在扩增流程中选定步骤的六个状态，起始于经过固定、通透化和染色的生物膜样品，经历四个中间状态，最终达到凝胶化并扩增完成的状态，适用于超分辨率显微镜观察与图像分析。生物膜的胞外多糖（EPS）基质以绿色表示，细菌细胞壁由紫色线条表示，细胞内总体蛋白质结构以灰色表示，丙烯酰胺-丙烯酸盐 ExM 聚合物则以波浪状蓝色线条表示。参与该过程的所有酶均以吃豆人符号（Pac-Man）表示：3 种糖苷水解酶（绿色）用于水解胞外多糖，分别为α-淀粉酶、纤维素酶和溶菌酶；紫色的溶菌素（mutanolysin）用于降解肽聚糖细胞壁；灰色的蛋白酶K（proteinase K）用于总体蛋白质的消化。吃豆人符号的颜色与其对应靶向结构一致。所有以低不透明度或虚线边框显示的对象代表处于酶解降解状态。本图改编自 Castagnini, D. 等人3。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67932/67932fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
1. 生物膜形成用玻璃盖玻片的清洗与灭菌
<ol>
	<li>将12 mm的玻璃盖玻片在1 M氢氧化钠溶液中室温超声处理20分钟，然后用大量去离子水冲洗。</li>
	<li>将盖玻片在70%（v/v）乙醇中室温超声处理15分钟，然后用95%（v/v）乙醇冲洗。</li>
	<li>让盖玻片在室温下自然晾干。</li>
	<li>通过高压灭菌进行灭菌。</li>
</ol>
2. Proteus mirabilis 生物膜培养
<ol>
	<li>在37 °C条件下，将 P. mirabilis 接种于10 mL LB（Luria Bertani）液体培养基中，静置培养24小时。 
	注意：本研究使用了一种市售的 P. mirabilis 标准菌株（见材料表），但鼓励使用任何易于获得的 P. mirabilis 菌株。</li>
	<li>取1 mL上述培养物，加入9 mL新鲜且无菌的LB液体培养基中，制备成1:10稀释的细菌悬液。</li>
	<li>测定1:10稀释细菌悬液在600 nm处的光密度（OD），使其OD值为0.1。若未达到该值，可通过添加少量新鲜LB培养基或 P. mirabilis 培养物进行调整，直至OD600 = 0.1。</li>
	<li>将已预先清洗并灭菌的12 mm玻璃盖玻片放入无菌的聚苯乙烯24孔板中（每孔放置一片）。 
	注意：确保盖玻片整个底面与孔底充分接触。生物膜将在朝上的盖玻片侧面形成。</li>
	<li>向各孔中加入350 µL OD600 = 0.1的细菌悬液进行接种。 
	注意：建议仅在板的内圈孔中接种，而外圈孔（即A行、D行以及1列、6列的孔）中加入无菌水或LB培养基。这是因为外圈孔的液体蒸发速率高于内圈孔，可能影响生物膜的生长。</li>
	<li>将接种后的培养板放入培养箱中，并倾斜45度放置。 
	注意：可使用常见的实验室材料（如50 mL离心管或移液器吸头盒）支撑倾斜。倾斜位置可在盖玻片表面形成气-液界面，P. mirabilis 生物膜最厚的区域将在该界面处形成。</li>
	<li>在37 °C静置条件下培养48小时，使生物膜形成。 
	注意：由于培养基蒸发可能导致生物膜干燥，该生物膜培养体系不适合超过48小时的培养。</li>
</ol>
3. 生物膜样品的固定与保存
<ol>
	<li>小心移除孔中的培养基，并用 300 µL 无菌磷酸盐缓冲液（PBS）在室温下轻轻洗涤带有生物膜的盖玻片两次，每次 5 分钟，轻微振荡即可。 
	注意：避免因反复更换液体而破坏生物膜，建议使用小体积液体进行孵育或洗涤。在 24 孔板中，300–400 µL 液体足以浸没生物膜。强烈建议采用缓慢且有条理的移液操作，并避免溶液直接冲击生物膜。</li>
	<li>移除 PBS，加入 400 µL 含 4%（w/v）多聚甲醛（PFA）的 PBS 溶液，在室温下固定生物膜 20 分钟。</li>
	<li>移除 PFA 溶液，加入 300 µL 含 1% PBST（含 1% v/v Triton X-100 的 PBS）溶液以实现细胞通透化处理，在室温下孵育 20 分钟。</li>
	<li>将 1% PBST 溶液替换为 300 µL 含 0.3% PBST（含 3% v/v Triton X-100 的 PBS）溶液，在室温下孵育 30 分钟。</li>
	<li>移除 0.3% PBST 溶液，加入 300 µL 甲醇与 0.3% PBST 的 50:50 混合液，用于样本脱水。室温孵育 5 分钟后，更换为 1 mL 纯甲醇。 
	注意：缓慢加入 1 mL 甲醇，沿孔壁流下。使用较大体积甲醇可防止样本储存期间甲醇完全蒸发。</li>
	<li>将样本在 -20 °C 下保存至少 1 天，最长可保存一个月。 
	注意：建议使用柔性石蜡膜密封板孔，以延缓甲醇蒸发并防止样本干燥。</li>
	<li>使用时，依次进行样本再水化：先用 300 µL 甲醇与 0.3% PBST 的 50:50 混合液替换甲醇，再用 300 µL 0.3% PBST 替换，均在室温下进行。</li>
</ol>
4. 生物膜荧光染色
<ol>
	<li>将复水后的生物膜样品与 300 µL 浓度为 50 µg/mL 的麦胚凝集素荧光标记凝集素偶联物（下文简称为 WGA 偶联物；参见材料表）在 PBS 中于室温孵育 20 分钟，以对细胞壁/荚膜/胞外多糖进行染色。 
	注意：有关荧光染色的详细内容，请参见讨论部分的相关主题。此后，请将样品避光保存。</li>
	<li>移除 WGA 偶联物溶液，并用 300 µL PBS 在室温下轻轻洗涤两次，每次 10 分钟。</li>
</ol>
5. PmbExM 步骤
<ol>
	<li>MA-NHS 锚定与丙烯酰胺-丙烯酸酯聚合
	<ol>
		<li>将染色后的生物膜样品与 400 µL 含 1 mM 甲基丙烯酸 N-羟基琥珀酰亚胺酯（MA-NHS）的 PBS 溶液在室温下轻柔振荡孵育 1 小时。 
		注意：MA-NHS 是一种活化酯，易在水相介质中发生水解，因此在配制 1 mM PBS 溶液后应立即使用。</li>
		<li>用 300 µL PBS 在室温下轻柔洗涤三次，每次 10 分钟。</li>
		<li>移除 PBS 并替换为 300 µL 单体溶液，在 4 °C 下过夜（O.N.）孵育。</li>
		<li>构建凝胶预反应室。以载玻片为基底，在其上放置两段对折的双面胶带作为 400 µm 的间隔物，间隔物之间相距 8–10 mm。 
		注意：有关凝胶预反应室构建的进一步说明，请参见 图 2A。此处使用的双面胶带厚度约为 100 µm，因此需修剪并对折以形成 3 mm × 5 mm × 0.4 mm 的间隔物。请根据实际可用双面胶带的厚度进行相应调整。胶带间隔物对凝胶溶液的吸收可忽略不计。作为替代方案，可将 12 mm 圆形盖玻片用液滴水粘合后堆叠，直至达到所需高度。</li>
		<li>设置湿润室，以防止样品在聚合过程中干燥。 
		注意：可通过移除移液器吸头盒内的塑料支架并替换为湿润的纸巾，将常见的吸头盒轻松改造成湿润室。</li>
		<li>新鲜配制凝胶溶液：将单体溶液、10 % (w/v) N,N,N',N'-四甲基乙二胺（TEMED）、0.5 % (w/v) 4-羟基-TEMPO（4-HT）和 10 % (w/v) 过硫酸铵（APS）按 47:1:1:1 的体积比充分混合。仅在完成步骤 5.1.5 后，再将 APS 加入其余凝胶溶液试剂中。 
		注意：所需配制的凝胶溶液总体积取决于待处理的生物膜样品数量。例如，处理三个生物膜样品时，需配制 900 µL 凝胶溶液，即混合 846 µL 单体溶液、18 µL 10 % (w/w) TEMED、18 µL 0.5 % (w/w) 4-HT 和 18 µL 10 % (w/w) APS。为防止提前聚合，APS 必须最后加入，且仅在样品、凝胶预反应室和湿润室均已准备就绪时添加。此步骤中所有提及的试剂及新配制的凝胶溶液均需保持低温。</li>
		<li>凝胶溶液配制完成后，立即轻柔移除单体溶液，并替换为 300 µL 新鲜凝胶溶液，在 4 °C 下孵育 5 分钟。</li>
		<li>在步骤 5.1.7 进行的同时，移除玻璃载片上双面胶带条的剩余保护层，并在其间的空隙中加入 40 µL 凝胶溶液。</li>
		<li>步骤 5.1.7 完成后，将每个带有生物膜的盖玻片从孔中取出，并将其放置在先前滴加于载玻片上的 40 µL 凝胶溶液液滴上。调整盖玻片方向，使生物膜表面接触凝胶溶液。</li>
		<li>使用镊子轻轻按压带有生物膜的盖玻片，使其牢固粘附于双面胶间隔物上，完成凝胶室的组装。 
		注意：这种类似三明治的结构即为所称的凝胶室（图 2B）。</li>
		<li>将样品置于湿润室内，在 37 °C 下静置孵育 2 小时，不进行振荡。</li>
		<li>在不拆卸凝胶室的情况下，通过荧光显微镜观察样品（见步骤 6.2.1），以获取膨胀前图像。 
		注意：切勿将凝胶样品在湿润室外放置超过一小时，因膨胀前凝胶易失水干燥，导致样品无法使用。有关膨胀前成像的具体操作，请参见步骤 SF2.3（补充文件 2）。</li>
		<li>拆卸凝胶室，并使用手术刀修剪生物膜样品中目标区域周围的多余凝胶。 
		注意：强烈建议修剪凝胶，以方便后续处理和安装膨胀后的样品。此外，为便于追踪目标区域在样品中的空间取向，可将凝胶修剪成不对称形状或在凝胶上保留特征性切口，以便识别正确方向。</li>
		<li>将带有修剪后凝胶的盖玻片放入新的 24 孔板中，凝胶面朝上。 
		注意：此阶段凝胶样品应仍牢固粘附于原始玻璃盖玻片上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>酶解 I-III 及 DNA 染色 
	注意：P. mirabilis 生物膜样品机械性能的均质化需经过一系列酶解处理，作者根据靶向降解的生物结构将其分为三个步骤：多糖水解（酶解 I）、肽聚糖水解（酶解 II）和蛋白质水解（酶解 III）。
	<ol>
		<li>酶解 I
		<ol>
			<li>将样品浸入 1 mL α-淀粉酶消化溶液中，在 50 °C 下过夜（O.N.）孵育。 
			注意：使用较大体积（即 0.5–1 mL）的酶溶液可防止因高温孵育导致样品干燥。</li>
			<li>移除 α-淀粉酶溶液，并用 300 µL 纤维素酶消化缓冲液在室温下洗涤凝胶 5 分钟。</li>
			<li>移除纤维素酶消化缓冲液，并替换为 500 µL 纤维素酶消化溶液，在 45 °C 下孵育 2 小时。</li>
			<li>移除纤维素酶消化溶液，并用 300 µL 裂解酶消化缓冲液在室温下洗涤凝胶 5 分钟。</li>
			<li>移除裂解酶消化缓冲液，并替换为 500 µL 裂解酶消化溶液，在 30 °C 下孵育 2 小时。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>酶解 II
		<ol>
			<li>移除裂解酶消化溶液，并用 300 µL 溶菌酶消化缓冲液在室温下洗涤凝胶 5 分钟。</li>
			<li>移除溶菌酶消化缓冲液，并替换为 1 mL 溶菌酶消化溶液，在 55 °C 下过夜（O.N.）孵育。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>酶解 III
		<ol>
			<li>移除溶菌酶消化溶液，并用 300 µL 蛋白酶 K 消化缓冲液在室温下洗涤凝胶 5 分钟。随后移除蛋白酶 K 消化缓冲液，并替换为 500 µL 蛋白酶 K 消化溶液，在 37 °C 下孵育 2 小时。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>（可选）DNA 染色
		<ol>
			<li>移除蛋白酶 K 溶液，并用 300 µL 10x PBS 在室温下洗涤凝胶 5 分钟。</li>
			<li>移除 10x PBS，并替换为 300 µL 含 5 µM 红色荧光核酸染料的 10x PBS 溶液，在室温下孵育 30 分钟。 
			注意：有关 ExM 流程中 DNA 染色的讨论，请参见讨论部分。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>膨胀
	<ol>
		<li>移除蛋白酶 K 溶液（若执行了可选步骤 5.2.4，则移除 DNA 染色溶液），并将凝胶转移至 60 mm 培养皿中，每皿放置一个凝胶。 
		注意：使用小型平头画笔将凝胶从玻璃盖玻片上轻轻推起。用实验室镊子夹取玻璃盖玻片，将其作为凝胶的承载平台。在从孔板中提起时，借助画笔防止凝胶从盖玻片上脱落。避免凝胶自身折叠。</li>
		<li>向培养皿中加入足量去离子水，完全浸没凝胶，并在室温下轻柔振荡孵育 20 分钟，换水 4–5 次。 
		注意：膨胀中的凝胶在水中几乎不可见。建议将培养皿置于光源前，以便定位凝胶，避免在换水过程中因巴斯德移液管或移液器的吸力而损坏凝胶。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="凝胶化过程装置示意图，显示生物膜及用于显微镜观察的3D打印成像腔室。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67932/67932fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：凝胶化腔室与样品安装。（A）凝胶前腔室。在载玻片上放置两个双面胶带间隔物（黄色）。一个玻璃盖玻片（<img alt="静力平衡，ΣFx=0，力矩平衡，符号，力学物理，教学示意图" src="/files/ftp_upload/67932/67932eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式1"> = 12 mm）置于其上，作为距离参考。（B）凝胶化腔室。细菌生物膜（绿色）形成于下层盖玻片表面。400 µm厚的间隔物（橙色）由100 µm厚的双面胶带切割而成。间隔物可使凝胶完全包埋样品，并防止凝胶溶液从腔室边缘溢出，从而避免样品在载玻片与盖玻片之间被压碎。（C）3D打印成像腔室（访问以下链接获取.stl文件：https://github.com/scianlab/ExM）。左侧为膨胀后的凝胶样品，右侧为浸没在去离子水中的膨胀凝胶样品。膨胀后的凝胶在浸入水中时几乎不可见。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67932/67932fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
6. 观察与分析
<ol>
	<li>扩增样品的固定
	<ol>
		<li>准备经多聚赖氨酸包被的成像室，用于在成像过程中固定样品11：将成像室的玻璃表面（见材料表）用0.1% (w/v) 多聚-L-赖氨酸在室温下孵育20分钟。</li>
		<li>移除多聚-L-赖氨酸溶液，并用大量去离子水清洗两次。室温下自然晾干1小时，或置于37 °C培养箱中以加速干燥。</li>
		<li>在完成第5.3.2步的第五次透析循环后，移除覆盖在凝胶上的水，使用小而扁平的刷子将样品推至一块24 mm × 50 mm的玻璃盖玻片上。将矩形盖玻片作为凝胶的承载平台，从培养皿中轻轻提起。</li>
		<li>用纸巾去除凝胶表面多余的水分，防止水阻碍凝胶表面与成像室玻璃表面的多聚赖氨酸涂层之间的直接接触。</li>
		<li>小心地将凝胶放置在成像室的玻璃表面上，避免凝胶与玻璃之间残留气泡。 
		注：成像室的玻璃表面必须完全干燥。若已采集过扩增前图像，应正确调整扩增后凝胶的方向，以便于在扩增前样品中重新定位先前捕获的视野。</li>
		<li>加入去离子水直至凝胶完全浸没（见图2C）。 
		注：在整个成像过程中，扩增后的凝胶必须保持水合状态，以防止成像时发生收缩。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>图像采集
	<ol>
		<li>在可用的衍射极限荧光显微镜上观察并采集样品图像。 
		注：作者使用了一台转盘共聚焦显微镜，配备63倍、数值孔径（NA）为1.2的水浸物镜。荧光染料激发采用488 nm和647 nm的固态激光线。图像由专用软件控制的16位数字CMOS相机采集（见材料表）。体素尺寸设定为64.4 mm × 64.4 mm × 200 nm（XYZ轴）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>图像处理
	<ol>
		<li>请参阅补充文件2，获取用于细菌分割（第SF2.1节）、细胞宽度测量（第SF2.2节）、EF确定（第SF2.3节）以及扩增前与扩增后条件图像匹配（第SF2.4节）的数字图像处理流程。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Bano, S., Qader, S. A. U., Aman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+novel+%CE%B1-amylase+from+Bacillus+subtilis+KIBGE+HAS%5BTitle%5D)+AND+%22AAPS+PharmSciTech%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of novel α-amylase from Bacillus subtilis KIBGE HAS.</a> AAPS PharmSciTech. 12, 255-261 (2011).</li>
<li>Kaplan, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+involved+in+the+synthesis+and+degradation+of+matrix+polysaccharide+in+Actinobacillus+actinomycetemcomitans+and+Actinobacillus+pleuropneumoniae+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Genes involved in the synthesis and degradation of matrix polysaccharide in Actinobacillus actinomycetemcomitans and Actinobacillus pleuropneumoniae biofilms.</a> J Bacteriol. 186 (24), 8213-8220 (2004).</li>
<li>Kaplan, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+human+DNase+I+decreases+biofilm+and+increases+antimicrobial+susceptibility+in+staphylococci%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antibiot%22%5BJournal%5D)">Recombinant human DNase I decreases biofilm and increases antimicrobial susceptibility in staphylococci.</a> J Antibiot. 65 (2), 73-77 (2012).</li>
<li>Schlapp, G., Scavone, P., Zunino, P., Härtel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+3D+architecture+of+uropathogenic+Proteus+mirabilis+batch+culture+biofilms%3A+A+quantitative+confocal+microscopy+approach%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of 3D architecture of uropathogenic Proteus mirabilis batch culture biofilms: A quantitative confocal microscopy approach.</a> J Microbiol Methods. 87 (2), 234-240 (2011).</li>
<li>Schermelleh, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopy+demystified%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopy demystified.</a> Nat Cell Biol. 21 (1), 72-84 (2019).</li>
</ol>

作者声明本工作中不存在与之相关的经济或个人利益冲突。

PmbExM 的关键步骤 
与任何 ExM 变体一样，该方案中最关键的步骤之一是均一化样品的机械性能。在 PmbExM 中，此目标通过一系列酶促处理实现。消化不足可能导致扩增因子（EF）偏低，并可能破坏生物膜的形态和/或拓扑结构，从而导致分辨率不理想和结果不可靠。相反，过度剧烈的消化（尤其是蛋白水解处理）则可能导致显著的荧光信号损失，并破坏生物膜的形态与结构。鉴于生物膜在结构和组成上的复杂性，PmbExM 特别设计为在接近最优条件下（基于已发表文献12,13,14,15）使用消化酶，以确保有效的均一化。该方法通过精确控制蛋白酶 K 浓度、温度和孵育时间等参数，在保持荧光信号的同时，有效保护生物膜的形态完整性。
方法的改进与故障排除 
PmbE...

荧光显微镜是研究生物膜结构、组成和功能的常用工具1然而，光学显微镜在解析生物膜的结构、细胞及亚细胞特征时，受限于衍射极限。扩展显微镜技术（ExM）是一种创新、简便且易于使用的超分辨率成像技术，在突破衍射极限以揭示生物膜结构方面具有巨大潜力。2,3ExM 通过各向同性地将生物样本膨胀至原始尺寸的约四倍来提高分辨率。该方法包括以下步骤： 原位 在整个样本中聚合可膨胀离子水凝胶，并在谨慎操作时保持分子靶标的相对空间排列4,5.
为了使膨胀显微技术（ExM）正常工作，均一化生物材料的机械性能是一个关键步骤6。标准的ExM变体最初基于哺乳动物细胞培养物和组织开发，仅通过蛋白酶K的蛋白水解消化4,5，或使用去污剂结合高压灭菌进行温和的蛋白质变性7，即可有效实现均一化，获得各向同性的4倍膨胀。然而，在细菌和细菌生物膜的情况下，肽聚糖细胞壁以及胞外多糖（EPS）基质成分（如结构多糖）会阻碍膨胀过程2,3,8,9。
本文介绍了Proteus mirabilis生物膜膨胀显微技术（PmbExM）的操作流程，这是一种定制的膨胀显微技术（ExM）变体，旨在扩增P. mirabilis的生物膜。该细菌是一种具有重要临床意义的革兰氏阴性杆菌，与高耐药性及导管相关性尿路感染密切相关10。PmbExM采用溶菌素、α-淀粉酶、纤维素酶、裂解酶和蛋白酶K的组合酶处理，分别水解肽聚糖细胞壁、多糖和蛋白质。结果表明，该方法可实现对48小时龄的P. mirabilis生物膜进行4.3倍的各向同性扩增。该技术通过双重染色3，实现了对P. mirabilis生物膜结构、组装过程及细胞内特征的超分辨率可视化。此外，通过调整酶处理以靶向不同物种特异性的生物膜组分，PmbExM还可适用于其他生物膜模型。
本文旨在详细描述用于PmbExM的生物膜样本的凝胶化、消化、扩增和封片过程中所涉及的操作步骤。此外，本文还概述了作者所采用的细菌培养条件、样本形式以及荧光染色技术，并提供了一套数据处理与分析流程，便于图像处理经验有限的研究人员直接应用。有关图像处理与分析的更全面深入的指南，请参阅Castagnini, D. 等人的文献3。

<table><tbody><tr><td>&amp;alpha;-淀粉酶来源于 &lt;em&gt;芽孢杆菌属 sp.&lt;/em&gt;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>10070</td><td>多糖消化</td></tr><tr><td>0.1% (w/v) 聚-L-赖氨酸水溶液&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td>用于成像的样品固定</td></tr><tr><td>12 mm 玻璃盖玻片</td><td>Chemglass生命科学</td><td>CLS-1760</td><td>凝胶化室组件</td></tr><tr><td>16位 C13440-20CU 相机</td><td>滨松光子学</td><td>暂无内容</td><td>用于图像采集的CMOS数码相机</td></tr><tr><td>24 mm x 50 mm 玻璃盖玻片</td><td>Chemglass生命科学</td><td>CLS-1764</td><td>样品操作/处理</td></tr><tr><td>3D打印成像室</td><td>自主研发设计</td><td>-</td><td>成像室选项</td></tr><tr><td>4-羟基-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基（4-hydroxy-TEMPO）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>176141</td><td>凝胶溶液组分</td></tr><tr><td>带黑色侧壁的6孔玻璃底培养板</td><td>CelVis</td><td>P06-1.5H-N</td><td>成像室选项</td></tr><tr><td>乙酸&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>818755</td><td>酶缓冲液组分</td></tr><tr><td>丙烯酰胺&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4058</td><td>单体溶液组分</td></tr><tr><td>过硫酸铵</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td>凝胶溶液组分</td></tr><tr><td>Axiovert 200 显微镜</td><td>Zeiss</td><td>暂无内容</td><td>共聚焦显微镜</td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8106</td><td>酶缓冲液组分</td></tr><tr><td>C-Apochromat 63倍 1.2 数值孔径水浸物镜</td><td>Zeiss</td><td>暂无内容</td><td>显微镜物镜</td></tr><tr><td>来自的纤维素酶 &lt;em&gt;黑曲霉&lt;/em&gt;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>22178</td><td>多糖消化</td></tr><tr><td>Chamlide CMB 35 mm 培养皿磁力成像腔室</td><td>活细胞检测仪器</td><td>暂无内容</td><td>成像室选项</td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472301</td><td>MA-NHS 锚定试剂储备液&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3264</td><td>酶缓冲液组分</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>清洁与灭菌</td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸</td><td>默克</td><td>324503</td><td>酶缓冲液组分</td></tr><tr><td>Falcon 聚苯乙烯 24 孔板</td><td>康宁</td><td>351147</td><td>通用实验操作平台</td></tr><tr><td>FIJI 软件</td><td>美国国立卫生研究院</td><td>-</td><td>图像处理软件</td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7893</td><td>酶缓冲液组分</td></tr><tr><td>盐酸胍</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>24115</td><td>酶缓冲液组分</td></tr><tr><td>Huygens 软件</td><td>科学体积成像</td><td>-</td><td>用于图像复原的反卷积软件</td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Supelco</td><td>1.00317</td><td>缓冲液配制</td></tr><tr><td>Kimwipes 纸巾</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666</td><td>去除多余水分</td></tr><tr><td>实验室镊子</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>M5E</td><td>通用样品操作/处理</td></tr><tr><td>Luria Bertani 肉汤</td><td>Invitrogen</td><td>12795-027</td><td>生物膜生长培养基</td></tr><tr><td>来自溶壁酶 &lt;em&gt;Arthrobacter luteus&lt;/em&gt;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>L4025</td><td>多糖消化</td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5652</td><td>酶缓冲液组分</td></tr><tr><td>甲基丙烯酸 N-羟基琥珀酰亚胺酯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>730300</td><td>锚定试剂</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32213</td><td>样品脱水 &amp;和储存</td></tr><tr><td>MicrobeJ&amp;nbsp;</td><td>-</td><td>-</td><td>图像处理软件插件</td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>Chemglass生命科学</td><td>CG-8221</td><td>凝胶化室组件</td></tr><tr><td>磷酸二氢钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td>酶缓冲液组分</td></tr><tr><td>溶菌酶 &lt;em&gt;Streptomyces globisporus&lt;/em&gt;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>M990</td><td>肽聚糖消化</td></tr><tr><td>N, N, N', N'-四甲基乙二胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7024</td><td>凝胶溶液组分</td></tr><tr><td>N,N&amp;prime;-亚甲基双丙烯酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1533</td><td>单体溶液组分</td></tr><tr><td>Nunc 40.4 mm 玻璃底培养皿</td><td>Thermo Fisher</td><td>12-567-400</td><td>成像室选项</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td>样品固定</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>79383</td><td>单体溶液组分，洗涤，酶缓冲液</td></tr><tr><td>蛋白酶K 来自 &lt;em&gt;Engyodontium album&lt;/em&gt;</td><td>Invitrogen</td><td>25530-031</td><td>蛋白质消化</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;奇异变形杆菌 &lt;/em&gt;ATCC 12453</td><td>Microbiologics</td><td>0440P</td><td>研究对象</td></tr><tr><td>小型扁头画笔</td><td>当地五金店</td><td>-</td><td>样品操作/处理</td></tr><tr><td>乙酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>241245</td><td>酶缓冲液组分</td></tr><tr><td>丙烯酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>408220</td><td>单体溶液组分</td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>酶缓冲液组分</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>单体溶液组分，酶缓冲液组分</td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465</td><td>载玻片清洗</td></tr><tr><td>固态激光线</td><td>奥密克戎</td><td>暂无内容</td><td>488、568 和 647 nm 激发激光线</td></tr><tr><td>SYTO 61 核酸染色</td><td>Invitrogen</td><td>S11343</td><td>荧光染料</td></tr><tr><td>三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐</td><td>SAFC</td><td>108219</td><td>酶缓冲液组分</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td>样品通透化，酶缓冲液组分</td></tr><tr><td>Volocity 7.0.0 采集软件</td><td>Quorum Technologies</td><td>-</td><td>显微镜采集控制器软件</td></tr><tr><td>Volocity ViewVox 转盘系统</td><td>Perkin-Elmer</td><td>暂无内容</td><td>共聚焦显微镜用旋转盘系统</td></tr><tr><td>麦胚凝集素 &amp;ndash; Alexa Fluor 488 荧光凝集素偶联物</td><td>Invitrogen</td><td>W11261</td><td>荧光染料</td></tr></tbody></table>

通过扩增显微技术对proteus mirabilis生物膜进行超分辨率成像

Super-resolution Imaging of Proteus mirabilis Biofilm by Expansion Microscopy

使用传统光学显微镜从微生物样品中获取详细的可视化信息和定量数据时，其分辨率受到衍射极限的限制。为提高分辨率，一种解决方案是扩展显微技术（Expansion Microscopy, ExM），这是一种创新且经济高效的超分辨率技术，通过物理方式将样品放大至原始尺寸的约四倍。要实现成功的扩增，关键在于均质化生物材料的机械特性。生物膜是由细菌群落附着于表面并包埋于自身产生的胞外基质中所形成的结构，因此需要对ExM实验流程进行调整，以适应其独特的结构组分。本文介绍了奇异变形杆菌生物膜扩展显微技术（Proteus mirabilis biofilm ExM, PmbExM），这是一种专门用于对培养48小时的P. mirabilis生物膜进行超分辨率成像的ExM变体。该方案聚焦于通过一系列酶解反应，在接近理论最优条件下靶向降解样品的关键结构组分。PmbExM联合使用多种酶，包括用于多糖水解的α-淀粉酶、纤维素酶和裂解酶类糖苷水解酶；用于肽聚糖水解的溶菌素（mutanolysin）；以及用于蛋白质水解的蛋白酶K。这些酶解步骤独立于凝胶化过程，因此可根据不同生物膜模型的具体均质化需求进行调整。这种可调节性使其在多种细菌种类和不同生长条件下具有广泛的应用潜力。尽管ExM已被应用于多种生物膜，但总体扩增因子普遍未达理想水平。相比之下，PmbExM实现了标准丙烯酰胺-丙烯酸酯ExM水凝胶的理论最大扩增倍数，且未出现明显的形态或拓扑结构畸变。本研究旨在提供一种易于实施的超分辨率成像方案，用于可视化分析P. mirabilis生物膜的结构架构、组装过程以及细胞内外特征。

PmbExM 将P. mirabilis 生物膜扩大了 4.3 倍，并保持了其形态和拓扑结构 
图 3A–D 展示了 P. mirabilis 生物膜细胞的物理放大效果以及该技术带来的分辨率提升。此外，这种放大效果不仅出现在细胞呈单层样排列的较薄生物膜区域，也出现在由 2 层甚至 3 层细菌密集排列构成的较厚区域（图 3G、H）。定量形态学分析显示，PmbExM 将细菌的最大宽度从 0.7 µm ± 0.07 µm 增加至 3.0 µm ± 0.22 µm（均值 ± 标准差）（图 3E），相当于约 4.3 倍的扩增因子（EF）。此外，扩增前后图像的共定位分析显示，分割出的细菌区域具有高度重叠（<strong class...

本文介绍了一种全面的PmbExM实验方案，这是一种专门设计用于 奇异变形杆菌 生物膜。PmbExM 利用逐步的酶处理方法对生物膜样品进行处理，实现各向同性的 4.3 倍扩增，从而能够对这些固着微生物群落中细胞及亚细胞结构的空间组织进行超分辨率分析。

通过扩增显微技术对Proteus mirabilis生物膜进行超分辨率成像

使用传统光学显微镜从微生物样本中获取详细的视觉信息和定量数据，受限于……

本研究的目的是为科学界提供一种易于获取的超分辨率方法，用于研究奇异变形杆菌生物膜的结构、组装过程以及超越衍射极限的细胞间特征。由于光学分辨率的限制，生物膜的定量显微观察具有挑战性。奇异变形杆菌生物膜扩增显微技术（PmbExM）将有助于更精确地描述和分析这类复杂的微生物群落。PmbExM 的两个主要优势在于：第一，它可利用常规的衍射受限显微镜实现对奇异变形杆菌生物膜的超分辨率成像；第二，该方法无需依赖复杂的数据采集后处理流程。我们的方法有助于那些无法使用专业超分辨率设备，且在数字图像处理或分析方面缺乏高级经验的研究人员对生物膜结构和组织进行纳米尺度的研究。PmbExM 将能够以纳米级分辨率研究奇异变形杆菌生物膜的结构、组装过程以及细胞和细胞内特征。此外，该方法具有可塑性，可经调整和规范化后用于其他生物膜物种的研究。[旁白] 首先，向染色的生物膜样本中加入 400 微升浓度为 1 毫摩尔的甲基丙烯酸 N-羟基琥珀酰亚胺酯（MA-NHS）磷酸盐缓冲液（PBS）溶液，在室温下轻柔振荡孵育 1 小时。1 小时后，用 300 微升 PBS 在室温下轻轻洗涤染色的生物膜样本三次，每次 10 分钟。吸除 PBS，向样本中加入 300 微升单体溶液，于 4 摄氏度孵育过夜。为构建凝胶前室，使用载玻片作为基底，然后在载玻片上裁剪、排列并粘贴两段对折的双面胶带，作为 400 微米厚的间隔物。设置湿室以防止样本在聚合过程中干燥。接下来，通过将单体溶液、10% 四甲基乙二胺（TEMED）、0.5% 4-羟基-TEMPO 和 10% 过硫酸铵按 47:1:1:1 的体积比混合，配制新鲜的凝胶溶液。凝胶溶液配制完成后立即进行操作：吸除样本中的单体溶液，并替换为 300 微升凝胶溶液。将样本在 4 摄氏度孵育 5 分钟。在此期间，移除玻璃载片上双面胶带条的剩余保护层。在间隔物之间加入 40 微升凝胶溶液。当样本孵育完成后，使用镊子小心提起每一片带有生物膜的盖玻片，将其放置在载玻片上 40 微升凝胶溶液液滴的上方。调整盖玻片方向，使其表面的生物膜与凝胶溶液接触。用镊子轻轻按压带有生物膜的盖玻片，确保其与胶带间隔物紧密贴合，完成凝胶室的组装。将组装好的凝胶室放入湿室中，于 37 摄氏度静置孵育 2 小时，以完成聚合反应。2 小时后，拆解凝胶室，使用手术刀修剪生物膜样本感兴趣区域周围的多余凝胶。将带有修剪后凝胶的盖玻片转移至新的 24 孔板中，凝胶面朝上放置。在使用蛋白酶 K 溶液对凝胶样本进行酶解消化后，吸除蛋白酶溶液，并将每个凝胶转移至独立的 60 毫米培养皿中，用于样本的膨胀处理。向每个培养皿中加入足量去离子水，使凝胶完全浸没，并在室温下轻柔振荡孵育 20 分钟。完成第五次换水后，吸除覆盖在凝胶上的去离子水。使用小号平头刷轻轻将样本推至 24×50 毫米的玻璃盖玻片上。用纸巾吸除凝胶表面多余的水分。小心地将凝胶放置在成像室的玻璃表面，确保凝胶与玻璃之间无气泡残留。最后，向成像室中加入去离子水，直至凝胶完全浸没。采用定量与空间分析方法，评估经奇异变形杆菌生物膜膨胀显微技术（PmbExM）处理后，奇异变形杆菌生物膜的膨胀保真度与形态保持情况。PmbExM 技术使生物膜结构膨胀约 4.3 倍，同时保持了细胞形态与拓扑结构的完整性。该膨胀显著提高了细菌细胞的可视分辨率，使单个细胞的结构更加清晰分明。得益于分辨率的提升，PmbExM 还能够明确识别生物膜内先前无法分辨的多层细菌排列结构。此外，PmbExM 实现了对以往难以分辨的亚细胞结构的可视化，包括 DNA 空间分布的特定模式。这些组织模式通过线强度分布图得到验证，结果显示，在膨胀后的样本中出现多个明显的荧光峰，而未膨胀的细胞中仅观察到单一荧光峰。

super-resolution-imaging-proteus-mirabilis-biofilm-expansion

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科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

通过扩增显微镜对 奇异变形杆菌 生物膜进行超分辨率成像

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利用皱褶菌落形成评估生物膜产生的半定量方法

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利用点击化学与扩展显微技术可视化细胞内唾液酸化修饰

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