研究铜纳米颗粒诱导的细菌程序性细胞死亡

本研究调查了铜纳米颗粒对三种常见的具有临床意义的细菌的杀菌功效。它探讨了包括 ROS 生成和潜在的程序性细胞死亡参与在内的病例。

当前的一项挑战是实现一致的菌落数量。我相信这源于干预。与更有经验的计数相比，稀释过程中的细胞现代化使位置计数虚假。

我们小组是第一个使用细胞调节剂研究铜纳米颗粒杀菌机制的人，揭示了细菌死亡涉及 ROS 生成和自噬等细胞过程。

该协议解决了对铜纳米颗粒杀死细菌机制的更深入了解的需求，特别关注细菌程序性细胞死亡途径的未被探索的领域。

使用不同的细胞调节剂，我们证实了铜纳米颗粒诱导的细菌死亡涉及自噬和 ROS 过载，并通过简单的设计确定了由可靠的一式三份实验支持的关键途径

[旁白]首先，从商业供应商处获得直径为 25 纳米和 60 至 80 纳米的商业铜纳米粉末。使用一毫升一毫摩尔 SDS 作为每种纳米粒径的分散剂。然后在室温下使用超声波浴分散纳米颗粒至少 30 分钟。接下来，从各自的生物资源中心获取大肠杆菌、鲍曼不动杆菌和金黄色葡萄球菌菌株。在37摄氏度的有氧条件下，在10毫升LB肉汤中培养每种细菌。在LB培养基中稀释细菌培养物，使其在600纳米处达到约0.5的光密度。现在使用库存铜纳米颗粒溶液制备两种尺寸的浓度范围在每毫升 0 到 100 微克之间。将 500 微升细菌培养物移液到微量离心管中，并在室温下以 3,300 G 离心 10 分钟。移出上清液后，向每个管中加入不同浓度的两种尺寸的纳米颗粒。用 500 微升 PBS 作为阴性对照，用 500 微升 70% 酒精作为阳性对照处理对照组。然后将所有样品在37摄氏度下以每分钟200转的摇动孵育24小时。孵育后，用PBS洗涤细菌并将它们铺在LB琼脂平板上。将板在 37 摄氏度下孵育 24 小时。第二天，计算所有治疗组每个板上的菌落。用5微摩尔SBI处理细菌2小时，0.5微摩尔坏死磺酰胺1小时，100纳摩尔麦芽甘露素30分钟或100纳摩尔Z-VAD处理30分钟。所有预处理完成后，将所有试管以3,300G离心10分钟。然后将沉淀重悬于 800 微升 PBS 中以洗涤预处理调节剂。分配重悬的颗粒。离心每个管，然后弃去上清液。在搅拌孵育之前将沉淀重悬于纳米颗粒调节剂混合物中。现在加入70%乙醇和PBS作为阳性和阴性对照。包括用抑制剂处理的空白对照组，但不包括纳米颗粒。孵育后，以1比1的体积比移液细胞活力试剂并孵育。再次离心培养物后，将上清液转移到96孔板上。使用酶标仪测量 560 纳米激发和 590 纳米发射的荧光。将剩余上清液稀释至10的负5次方和10的负4次方，然后铺在LB琼脂平板上进行培养。第二天计算单个菌落。将细菌培养物移液到微量离心管中。然后将培养物暴露在405纳米紫外线下三个小时。接下来，将培养物在 45 摄氏度下孵育两个小时。然后将细菌在四摄氏度下孵育两个小时。冷处理后，将细菌在3%过氧化氢中孵育30分钟。将对照组在LB肉汤中保持在37摄氏度。现在用浓度在每毫升 1 到 100 微克之间的 20 或 60 纳米颗粒处理细菌 24 小时。然后用PBS洗涤处理过的细菌两次。离心后，将细菌沉淀重悬于2'，7'二氯二氢荧光素二乙酸盐染料的五微摩尔溶液中。分析 520 或 530 纳米发射时的荧光强度。大肠杆菌的菌落计数显着减少了 20 纳米铜纳米颗粒（每毫升 1 微克）和 60 纳米铜纳米颗粒（每毫升 5 微克）。金黄色葡萄球菌在两种纳米粒径的所有浓度下都显示出菌落计数显着减少。在鲍曼不动杆菌中，减少菌落数量需要每毫升 5 微克的 20 纳米铜纳米颗粒和每毫升 10 微克的 60 纳米铜纳米颗粒。 铜纳米颗粒处理诱导所有细菌产生活性氧，其中 20 纳米颗粒在较低浓度下显示出最高比例的阳性细胞。相比之下，60 纳米铜纳米颗粒处理导致所有浓度下一致的活性氧产生。程序化细胞死亡调节剂 Z-VAD 提高了用低至中等浓度的两种纳米粒径处理的大肠杆菌的存活率。NSA 治疗提高了金黄色葡萄球菌在所有 20 纳米铜纳米颗粒浓度下的存活率。鲍曼不动杆菌在20纳米和60纳米铜颗粒暴露下，Z-VAD在每毫升1、5和10微克下表现出更高的活力，而NSA在20纳米铜纳米颗粒暴露中仅每毫升10微克时提高了活力。