Name: 人母乳来源的细胞外囊泡的快速分离 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-11-14T12:50:00.000+00:00
Duration: 4 min 35 s
Description: 学习从人母乳中快速分离高纯度细胞外囊泡的方法。该方案采用快速过滤技术，相比传统超速离心法显著缩短分离时间，同时保持相似的粒径和蛋白表达水平，为炎症调控等临床应用提供高效工具。

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图片和图示使用 biorender.com 生成。本出版物中报告的研究由阿拉巴马大学伯明翰分校高分辨率成像设施支持。本研究由美国国立卫生研究院/儿童健康与人类发展研究所（NIH/NICHD）资助，项目编号为 5R21HD104481。

母乳在阿拉巴马大学伯明翰分校（UAB）区域重症监护室采集。在母乳解冻供患者使用后，因患者无法摄入整份喂养量而剩余的样本被收集。这些喂养液通常会被丢弃，但本研究将其收集用于科研。样本来自去标识化的个体，并在实验前储存于−80 °C。样本采集已获得阿拉巴马大学伯明翰分校机构审查委员会协议号N160203002的批准。所用试剂和设备列于材料表中。
1. 细胞外囊泡分离（差速超速离心法）
<ol>
	<li>在生物安全柜中，将母乳用无菌 PBS 在 15 mL 圆锥管中按 1:10 比例稀释。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 300 × g 离心母乳 10 分钟。离心后应出现三层明显分层：乳脂（顶层）、乳清或脱脂乳（中间水相层）以及细胞和其他碎片（沉淀于底部）。在生物安全柜中，将乳脂层和乳清层通过 70 µm 滤膜过滤（便于去除脂肪），同时保持沉淀物不受扰动。将滤过液转移至新管中。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 2600 × g 离心样品 10 分钟。此步骤可去除残留的乳脂、细胞和碎片。在生物安全柜中，将上清液通过 70 µm 滤膜过滤。将上清液转移至超速离心管中。超速离心前，确认管中液体体积至少为 10 mL。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 20,000 × g 超速离心样品 45 分钟。超速离心后可能出现与步骤 1.2 类似的三层结构：乳脂、乳清或脱脂乳，以及细胞和其他碎片。在生物安全柜中，将乳脂层和乳清层通过 70 µm 滤膜过滤，避免扰动沉淀。将上清液转移至 15 mL 圆锥管中。</li>
	<li>在生物安全柜中，使用 0.22 µm 滤器对母乳进行注射器过滤。将滤过液转移至新的超速离心管中。超速离心前，确认管中液体体积至少为 10 mL。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 110,000 × g 超速离心样品 70 分钟。吸除上清液，并将沉淀重悬于 10 mL 无菌 PBS 中。</li>
	<li>再次在 4 °C 条件下，以 110,00 × g 超速离心样品 70 分钟。</li>
	<li>在生物安全柜中，将沉淀重悬于 150–200 µL 无菌 PBS 中。</li>
</ol>
2. 细胞外囊泡分离（快速过滤法）
<ol>
	<li>在生物安全柜中，将母乳用无菌 PBS 按 1:10 比例稀释。</li>
	<li>在 4°C 条件下，以 300 × g 离心母乳 10 分钟。离心后应出现三层明显分层：乳脂层（顶层）、乳清或脱脂乳（中间水相层）以及细胞和其他碎片（沉淀于底部）。在生物安全柜中，将乳脂层和乳清层通过 70 µm 滤膜过滤（有助于更易去除脂肪），同时保持沉淀物不受扰动。将滤过液转移至新离心管中。</li>
	<li>在 4°C 条件下，以 2600 × g 离心样品 10 分钟。此步骤可去除残留的乳脂、细胞和碎片。在生物安全柜中，将上清液通过 70 µm 滤膜过滤。将上清液转移至 15 mL 离心管中。</li>
	<li>在生物安全柜中，使用 5.4 mL PBS 对 0.22 µm、16 英寸滤膜延长装置进行预冲洗。
	<ol>
		<li>进行预冲洗时，用注射器吸取 5.4 mL 无菌 PBS，冲洗系统直至 PBS 从管路另一端流出。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 0.22 µm、16 英寸滤膜延长装置对母乳进行注射器过滤。此步骤可去除残留的乳脂、细胞和碎片。 
	注意：根据样品中碎片含量的不同，可能需要使用多个滤膜延长装置。</li>
	<li>将滤过液收集至 15 mL 锥形离心管中。</li>
</ol>
3. 纳米颗粒示踪分析
<ol>
	<li>用无菌 PBS 将样品稀释（1:1000）。快速过滤的样品可直接使用，无需稀释。</li>
	<li>短暂涡旋混匀样品。取 1 mL 样品加入结核菌素注射器中。</li>
	<li>将注射器连接至注射装置，并固定注射器。</li>
	<li>将注射泵设定为 50。打开相机，确保观察到的颗粒数量既不过多也不过少。确保颗粒流动稳定，无间断或样品流突然跳跃现象。</li>
	<li>将注射泵设定为 100。运行程序。 
	注意：软件设置为每分钟读取一次，共读取 5 次。</li>
	<li>读取样品。</li>
	<li>样品之间用 PBS 冲洗 Nanosight 仪器。 
	注意：采用纳米颗粒追踪分析系统测定颗粒大小及每毫升颗粒浓度。超速离心样品的平均浓度为 3.30 e+08 ± 4.08 e+06 颗粒/mL，而快速过滤法的平均浓度为 5.50e+08 ± 1.16e+08 颗粒/mL。</li>
</ol>
4. 细胞外囊泡的负染色及透射电子显微镜观察
注意：用于透射电子显微镜（TEM）的样本其外泌体浓度范围为 108。
<ol>
	<li>使用放电装置对镀有甲酰铬/碳膜的铜网电子显微镜载网进行20 mA、25秒的辉光放电处理。</li>
	<li>将7 µL的EV悬浮液加样至载网上，孵育1分钟。</li>
	<li>用Whatman滤纸从网格下方引出并吸除多余液体 &#34;拉&#34; 将样品朝向载网移动，而不是远离它。</li>
	<li>用移液器将7 µL过滤后的1%醋酸铀（UA）溶液滴加到电镜载网上，立即对样品进行染色。</li>
	<li>15秒后，用滤纸接触载网边缘以去除多余的UA溶液。立即将样品（24小时内）在透射电镜下以80 kV观察。</li>
</ol>
5. 蛋白质浓度
<ol>
	<li>将250 µL纯化的EVs（1:4）在-20 °C下用丙酮沉淀1小时。 
	注：超速离心法使用100 µL纯化的外泌体。</li>
	<li>在16,000 × g 条件下离心样品30分钟。</li>
	<li>将沉淀物风干，随后重悬于100 µL RIPA缓冲液中。</li>
	<li>按照BCA蛋白检测试剂盒说明书测定蛋白浓度。使用酶标仪在562 nm处测量吸光度。 
	注：通常情况下，1 mL母乳通过超速离心法可获得约1.3 µg/mL蛋白，通过快速过滤法可获得约0.2–1 µg/mL蛋白。</li>
</ol>
6. 蛋白质印迹
<ol>
	<li>将1体积的蛋白质样品与4体积的上样缓冲液混合，进行还原处理，并在90°C下煮沸7分钟。</li>
	<li>取10 µg蛋白质样品加入SDS 10%凝胶中，先以70 V电泳15分钟，随后将电压升至100 V，继续电泳90分钟。</li>
	<li>使用半干转装置，在15 V条件下将凝胶中的蛋白质于30分钟内转印至硝酸纤维素膜上。</li>
	<li>用TBS-0.1%吐温（TBS-T）溶液洗涤膜3次，每次10分钟。</li>
	<li>用快速封闭缓冲液（稀释至1×）在室温下封闭膜30分钟。</li>
	<li>将一抗（Hsp70 1:1000；CD63 1:1000；CD9 1:1000）溶于1×缓冲液中，于4°C摇床上孵育过夜10,11,12。</li>
	<li>用TBS-T溶液洗涤膜3次，每次10分钟。</li>
	<li>将HRP标记的抗小鼠二抗（H+L）以1:1000稀释比例溶于含2%脱脂奶粉的TBS-T溶液中，针对所有目标蛋白（Hsp70、CD9和CD63）在室温摇床上孵育2小时。</li>
	<li>用TBS-T溶液洗涤膜3次，每次10分钟。</li>
	<li>使用ECL（1:1）显色液显影，并用X光片进行曝光显影。</li>
</ol>
7.&#160;体外培养 IEC-6 细胞
<ol>
	<li>在5 mL完全RPMI培养基中，于T-25培养瓶中接种1.0 × 106个细胞。过夜培养使细胞贴壁。</li>
	<li>移除完全培养基，并用1–2 mL PBS洗涤细胞。</li>
	<li>吸除PBS，加入5 mL无细胞外囊泡（EV-free）的完全RPMI培养基。</li>
	<li>每孔同时加入终浓度为400 µM的H2O2和10 µg/mL的细胞外囊泡，共同处理细胞过夜。</li>
	<li>移除培养基，并用1–2 mL PBS洗涤细胞。</li>
	<li>吸除PBS，加入1 mL胰蛋白酶。
	<ol>
		<li>将细胞置于37°C培养箱中孵育5分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>加入两倍体积的完全RPMI培养基以终止胰蛋白酶消化作用。将细胞转移至15 mL离心管中，在125 × g条件下离心5分钟。</li>
	<li>吸除上清液，将沉淀重悬于1 mL PBS中。</li>
	<li>使用细胞计数仪对细胞进行计数。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明，本研究、作者身份和/或本文发表不存在潜在的利益冲突。

文献表明，细胞外囊泡（EVs）可能调控多种炎症机制，并具有保护性益处，因此正受到越来越多的关注2,7。然而，EVs在临床应用中的一个局限在于分离EVs并获得足够产量所需的时间较长8,15。本文概述了一种使用美国食品药品监督管理局（FDA）批准的过滤系统从人乳（HBM）中快速高效分离EVs的分步操作方案。该方法的实用性在于，相较于传统EVs分离方法，可将操作时间缩短一半，同时不降低产量。因此，若在未来可批准EVs疗法，本方案可能有助于实现人乳来源EVs在临床环境中的实际治疗应用。
现有的EV分离方案已证明能从来源液体中稳定且高效地获得EV。然而，无论是作为金标准的差速超速离心法，还是商用试剂盒的使用，传统的分离方法均存在一定的局限性。EV的分离 通过 差速超速离心法虽然有效，但耗时较长，其操作流程中累计离心时间至少约3 h2,8,15分离时间结合准确定量EV数量的方案，使得在临床环境中受时间限制的情况下使用EV变得具有挑战性。此外，尽管商业试剂盒效果良好，但成本较高。同时，由于这些试剂盒价格昂贵，每套试剂盒可处理的样本数量也较少。8,15.
本方案克服了上述局限性，在不牺牲外泌体得率和纯度的前提下，节省了时间和成本。为确保本方案的有效性，在实施过程中必须遵循若干关键步骤。首先，需对人乳样品进行稀释并进行初始离心，以去除细胞外碎片和乳脂。去除这些杂质对于防止滤器扩展系统堵塞至关重要，从而避免单个样品需使用多个滤器。此外，使用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗滤器扩展系统十分关键，该步骤可对滤器进行预处理，使其处于适宜状态以准备加样。预处理有助于确保样品在加样过程中不发生损失。需要注意的是，根据乳汁样品的具体成分，即使在过滤前已进行稀释和离心，仍可能需要使用不止一套滤器扩展装置。若出现此情况，可更换新的滤器继续操作；但每次更换后的新滤器扩展装置在用于样品过滤前必须重新进行预处理。
该方案在分离人乳中的细胞外囊泡（EVs）方面具有高效性和可重复性，但仍存在一些局限性需要考虑。在样品过滤之前，离心步骤（两次离心总时间约20分钟）是必要的。若尝试在未离心的情况下直接过滤稀释后的样品，将导致滤膜扩展系统反复堵塞、样品损失，并为EV分离流程增加&#160;额外时间&#160;。此外，样品纯度有限，这一点已通过纳米颗粒跟踪分析（NTA）和透射电子显微镜（TEM）分析得到证实。若在过滤前未对样品进行离心处理，可能会将不需要的污染物引入样品中，进而根据分离所得EVs的后续下游应用，产生脱靶效应。另外，本方案目前仅针对人乳中EVs的分离进行了验证，因此其在其他体液EVs分离中的有效性尚未被研究。鉴于所有体液均具有水相特性，若将本方案用于其他来源的EVs分离，预计在EV纯度和得率方面不会存在显著差异。
还应注意，该方案在分离小型细胞外囊泡（sEV）方面具有较高效率。根据纳米颗粒跟踪分析（NTA）结果，HBM来源的细胞外囊泡（EVs）大小约为100 nm，表明样品中不存在较大的EVs。其原因是样品经过了0.22 µm滤膜过滤，这种过滤方式主要用于分离外泌体及其他较小的EVs，这也是本研究进行时实验室的主要研究重点。理论上，使用孔径更大的滤膜可能有助于较大EVs的分离。然而，这些问题超出了本研究的范围。
人乳来源的细胞外囊泡（EV）是一种天然的治疗资源，易于获取，可用于临床。将EV研究推进到临床应用的一个限制因素是，缺乏一种任何机构都可能采用的实用方法来分离EV。本方案旨在克服这一局限性，可轻松应用于医院环境，并利用现有医院级别、经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的过滤系统实施，该系统可商业获得，且价格远低于标准超速离心机。该方法具有成本效益，能够利用临床环境中已使用的过滤系统，获得富含EV且纯度高的样本。

细胞外囊泡（EVs）是普遍存在的纳米级颗粒，大小约为20-1000 nm， 通过 内体途径（当微囊泡与质膜融合，促进细胞内容物释放到细胞外空间）或质膜途径（即出芽）。EVs 包含来源于宿主细胞的多种组分，如脂质、蛋白质、核酸、多种代谢物及其他成分，具体组成取决于其来源。此外，EVs 在细胞间通讯、血管生成、免疫抑制、肿瘤微环境重塑以及癌症进展等方面具有重要作用。1,2,3,4值得注意的是，人乳（HBM）富含细胞外囊泡（EV），且可从哺乳期母亲中便捷获取5近年来，源自人乳的细胞外囊泡（HBMDEVs）作为治疗疾病的载体正受到越来越多的关注1,2早产或低出生体重新生儿易感染多种疾病，包括坏死性小肠结肠炎。坏死性小肠结肠炎以回肠或结肠坏死为特征，临床表现从轻度肠道炎症至多系统器官衰竭不等，婴儿死亡率可高达50%6. 母乳来源的细胞外囊泡预处理足以在坏死性小肠结肠炎实验模型中预防肠道炎症 体外 和 体内2,7因此，在临床环境中，使用HBMDEVs可能是治疗坏死性小肠结肠炎的一种可行方案。
尽管HBMDEVs具有治疗潜力，但目前的分离技术存在已知的局限性，即这些方法要么耗时较长，要么需要专用设备，二者在临床环境中均不具备普遍适用性。&#34;金标准&#34;的EV分离方法涉及多轮差速超速离心，该方法虽然能够获得较为满意的EV产量，但可能影响其结构完整性和功能活性8,9。此外，超速离心时间至少需要2 h，在临床环境中属于昂贵的资源消耗9。分离试剂盒已被证明既节省时间，又在一定程度上具有成本效益。然而，使用此类方法进行分离同样会导致产量较低，因而可扩展性差。因此，亟需开发出既节省时间又具有成本效益、同时不牺牲EV产量的HBMDEV分离技术。
本方案旨在利用现有临床可用且经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的工具，概述一种快速从人脑膜（HBM）中分离细胞外囊泡（EVs）的逐步操作方法。为实现这一目标，采用标准离心法及临床级滤膜扩展系统，从人脑膜（HBM）中分离出EVs。这些囊泡的尺寸处于预期范围内，形态学特征与已知的EVs一致，富含EV标志物，并在功能上与采用传统超速离心法分离的EVs相似。因此，该HBM来源EVs的分离方案可能有助于在临床环境中实现EVs的快速、便捷分离与应用。

<table><tbody><tr><td>(H+L) HRP偶联抗小鼠抗体</td><td>Bio-Rad</td><td>1721011</td><td></td></tr><tr><td>(H+L) HRP偶联抗兔抗体</td><td>Bio-Rad</td><td>1706515</td><td></td></tr><tr><td>0.20 毫米针头滤器</td><td>Fisherbrand</td><td>09-719C</td><td></td></tr><tr><td>0.70 微米细胞筛</td><td>Corning</td><td>431751</td><td></td></tr><tr><td>1.5 M Tris HCl</td><td>实验室自制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL 离心管</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>16英寸滤器延长装置</td><td>B-BRAUN</td><td>FE2012F</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris HCl</td><td>Teknova</td><td>T1068</td><td></td></tr><tr><td>1× PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-031</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>Falcon</td><td>353070</td><td></td></tr><tr><td>5× 还原性上样缓冲液</td><td>Thermo Scientific</td><td>39000</td><td></td></tr><tr><td>丙烯酰胺</td><td>Fisher Scientifc&amp;nbsp;</td><td>BP1410-1</td><td></td></tr><tr><td>两性霉素B</td><td>Gibco</td><td>15290-018</td><td></td></tr><tr><td>AMT NanoSprint43 Mark-II 相机</td><td>AMT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌素混合液（Anti-Anti）</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>抗CD63抗体</td><td>Novusbio</td><td>NBP2-32830</td><td></td></tr><tr><td>抗CD9抗体</td><td>Invitrogen</td><td>10626D</td><td></td></tr><tr><td>过硫酸铵（APS）</td><td>Thermo Scientific</td><td>17874</td><td></td></tr><tr><td>BCA蛋白定量试剂盒</td><td>Pierce</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Beckman离心管</td><td>Beckman coulter&amp;nbsp;</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>BrightStar ECL化学发光检测试剂</td><td>Alkali Scientific</td><td>XR92</td><td></td></tr><tr><td>外泌体去除胎牛血清</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0464480</td><td></td></tr><tr><td>快速封闭缓冲液</td><td>Pierce</td><td>37575</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Life Technologies</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Hsp70</td><td>Invitrogen</td><td>MA3-006</td><td></td></tr><tr><td>人胰岛素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9278-5ML</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢</td><td>Fisher Scientific</td><td>H325-500</td><td></td></tr><tr><td>IEC-6&amp;nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CRL-1592</td><td></td></tr><tr><td>JEOL 1400 FLASH 透射电子显微镜</td><td>JEOL USA Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>上样指示用还原性缓冲液</td><td>Thermo Scientific</td><td>39000</td><td></td></tr><tr><td>脱脂奶粉</td><td>Bioworld</td><td>30620074-1</td><td></td></tr><tr><td>Nanosight NS 300 纳米颗粒追踪分析仪</td><td>Malvern Instruments Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>硝酸纤维素膜</td><td>Life technologies</td><td>88018</td><td></td></tr><tr><td>PELCO easiGlow 等离子体处理仪</td><td>Ted Pella</td><td></td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂小片剂</td><td>Pierce</td><td>A32955</td><td></td></tr><tr><td>RIPA裂解缓冲液</td><td>Pierce</td><td>89901</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基</td><td>Fisher Scientifc&amp;nbsp;</td><td>11875119</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠（SDS）</td><td>Fisher Scientifc&amp;nbsp;</td><td>BP2436-200</td><td></td></tr><tr><td>T-25 培养瓶</td><td>Thermo Scientific</td><td>156367</td><td></td></tr><tr><td>Tris缓冲盐溶液（TBS）</td><td>实验室自制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>四甲基乙二胺（TEMED）</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0801</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA溶液</td><td>Gibso</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>吐温20</td><td>Thermo Scientific</td><td>J20605-AP</td><td></td></tr></tbody></table>

快速分离人乳源性细胞外囊泡

Rapid Isolation of Human Breast Milk-Derived Extracellular Vesicles

细胞外囊泡（EVs）是一类尺寸约为20-1000 nm的纳米级颗粒，因其治疗潜力而受到广泛关注。特别是源自人乳的细胞外囊泡（HBMDEVs）已在坏死性小肠结肠炎的实验模型中显示出保护作用；坏死性小肠结肠炎是一种主要影响早产儿的肠道疾病，死亡率可高达50%。然而，传统的细胞外囊泡分离技术，如差速超速离心法、尺寸排阻色谱法等，要么耗时较长，要么需要专用仪器，均难以在临床环境中实际应用。因此，亟需一种简便的分离方法，以实现HBMDEVs对患者的快速反应性给药。本文提出的方法结合了人乳的离心处理以去除脂肪和细胞碎片，以及对剩余脱脂乳进行快速超滤，从而获得高产量且功能完整的细胞外囊泡。该技术的应用可能使HBMDEVs在临床环境中成为一种切实可行的治疗选择。

使用超速离心法和快速分离法分离细胞外囊泡 
教科书式地，从人乳中分离细胞外囊泡（EV）需通过离心去除乳脂及其他大颗粒物质，随后进行过滤、多轮超速离心，并将富集EV的样品重悬于磷酸盐缓冲液（PBS）中。快速过滤法则利用离心去除乳脂和细胞碎片，继而进行过滤。 通过 0.22 µm 滤膜延长过滤器，进一步去除残留碎片，从而获得与传统超速离心法相当的外泌体富集样本图1).
滤芯扩展快速过滤系统中人脑微血管内皮囊泡的表征 
纳米颗粒示踪分析显示，经超速离心处理的（图2A）以及快速滤过分离的HBMDEVs（图2B）。两种方法均表明，分离得到的EVs平均大小约为100 nm。EVs携带多种 cargo（如蛋白质、脂质、miRNA等），从宿主细胞分泌至不同靶标。因此，首个检测的目标蛋白为热休克蛋白70（Hsp70），该蛋白已知可被运输 通过 细胞外囊泡13Western blot 分析显示，通过快速过滤法分离的细胞外囊泡在 Hsp70 表达水平上与超速离心法分离的囊泡相当图3A 和 补充图 1A）。此外，EVs 可被鉴定 通过 CD9 和 CD63 等四次跨膜蛋白的表面表达14Western blot 分析表明，分离的 EVs 通过 快速过滤确实表达 CD9（图3B 和 补充图 2B）和 CD63（图3C 和 补充图3C最后，对HBMDEVs进行形态学分析 通过 透射电子显微镜显示两种分离技术获得的囊泡形态相似（图 4A- D).
多家实验室已证实，细胞外囊泡（EVs）具有保护特性，可在细胞应激期间促进细胞存活2,3,7。与先前发表的研究类似，采用快速过滤法分离的EVs能够保护肠道上皮细胞（IEC-6）免受过氧化氢诱导的细胞死亡2（图5A、B）。这些数据表明，采用快速过滤法分离的HBMDEVs不仅在特性上与差速超速离心法分离的EVs相当，而且在功能上也相似。
<img alt="超速离心法与快速过滤法用于细胞外囊泡富集过程的示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67954/67954fig1.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图1"> 
图1：人乳中细胞外囊泡（EVs）分离过程中超速离心法与快速过滤法的原理示意图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67954/67954fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="Ultracentrifugation and rapid filtration particle size distribution chart; concentration vs. size analysis." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67954/67954fig2.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="Figure 2"> 
图2采用超速离心法和快速过滤法从人乳中分离细胞外囊泡的纳米颗粒示踪分析 (A采用超速离心法分离的人乳细胞外囊泡（以1×PBS按1:1000稀释）的纳米颗粒追踪分析（NTA）结果。所示数据为3–4次独立实验中的一次代表性结果。B人乳来源细胞外囊泡经快速过滤法分离后的纳米颗粒追踪分析. 所示数据为3至4次独立实验中的一次代表性结果。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67954/67954fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看该图的放大版本。</a>
<img alt="Western blot蛋白条带，70kDa，25kDa，实验结果，蛋白质分析，凝胶电泳。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67954/67954fig3.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图3"> 
图3：通过超速离心和快速过滤分离的细胞外囊泡（EVs）的Western blot分析。（A）热休克蛋白70（Hsp70）10 µg的一秒曝光结果。“L”表示蛋白分子量标记，“U”表示超速离心法，“R”表示快速过滤法。通过快速过滤获得的样品经110,000 × g 离心70分钟浓缩，重复两次。所示图像为四次独立实验中的一次代表结果。（B）CD9蛋白10 µg的二十秒曝光结果。“L”表示蛋白分子量标记，“U”表示超速离心法，“R”表示快速过滤法。快速过滤样品经110,000 × g离心70分钟浓缩，重复两次。所示图像为四次独立实验中的一次代表结果。（C）CD63蛋白10 µg的二十秒曝光结果。“L”表示蛋白分子量标记，“U”表示超速离心法，“R”表示快速过滤法。快速过滤样品经110,000 × g离心70分钟浓缩，重复两次。所示图像为四次独立实验中的一次代表结果。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67954/67954fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示纳米颗粒形成、结构分析和实验结果的电子显微镜图像" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67954/67954fig4.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图4"> 
图4：通过超速离心法和快速过滤法分离的细胞外囊泡（EVs）的透射电子显微镜分析。 （A）通过超速离心法分离的EVs在8,000倍放大下的电子显微图像。比例尺 = 800 nm。所示图像代表三次独立实验中的一次。（B）通过超速离心法分离的EVs在20,000倍放大下的电子显微图像。比例尺 = 200 nm。所示图像代表三次独立实验中的一次。（C）通过快速过滤法分离的EVs在8,000倍放大下的电子显微图像。比例尺 = 800 nm。EVs通过在110,000 × g 条件下离心70分钟进行浓缩，重复两次。所示图像代表三次独立实验中的一次。（D）通过快速过滤法分离的EVs在20,000倍放大下的电子显微图像。比例尺 = 200 nm。EVs通过在110,000 × g 条件下离心70分钟进行浓缩，重复两次。所示图像代表三次独立实验中的一次。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67954/67954fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞活力和计数柱状图；超速离心与快速过滤效果，H2O2处理。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67954/67954fig5.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="Figure 5"> 
图5：通过超速离心和快速过滤分离的细胞外囊泡（EVs）的功能分析。（A）在无EV的完全RPMI-1640培养基中培养的IEC-6细胞的细胞活力。细胞同时用400 µM H2O2和10 µg/mL EV处理过夜。所示数据为两次独立实验中的一次。（B）在无EV的完全RPMI-1640培养基中培养的IEC-6细胞的细胞计数。细胞同时用400 µM H2O2和10 µg/mL EV处理过夜。所示数据为两次独立实验中的一次。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67954/67954fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充图1：通过超速离心法和快速过滤法分离的细胞外囊泡中Hsp70的Western印迹表征。对10 µg热休克蛋白70（Hsp70）进行1秒曝光。“L”表示蛋白分子量标记，“U”表示超速离心法，“R”表示快速过滤法。快速过滤样品经110,000 × g离心70分钟浓缩，重复两次。每个样品代表一个独立的生物学重复。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67954/Supplementary%20Figure%201.png" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图2：通过超速离心法和快速过滤法分离的细胞外囊泡中CD9的Western印迹表征。 对10 µg的CD9进行5分钟曝光。“L”表示蛋白分子量标记，“U”表示超速离心法，“R”表示快速过滤法。快速过滤样品经110,000 × g 离心70分钟浓缩，共进行两次。每个样品代表一个独立的生物学重复。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67954/Supplementary%20Figure%202.png" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图3：通过超速离心和快速过滤分离的细胞外囊泡中CD63的蛋白质印迹表征。 对10 µg CD63进行10分钟曝光。“L”表示蛋白分子量标记，“U”表示超速离心，“R”表示快速过滤。快速过滤样品经110,000 × g 离心浓缩，每次70分钟，共进行两次。每个样品代表一个独立的生物学重复。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67954/Supplementary%20Figure%203.png" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本方案旨在加速并有效分离出高纯度的人乳来源细胞外囊泡。

细胞外囊泡（EVs）是一类大小约为20–1000 nm的纳米级颗粒，因其治疗潜力而迅速受到广泛关注。

我们的研究重点在于深入了解人乳源性外泌体在调控炎症反应中的作用。目前实验面临的主要挑战仅仅是分离这些细胞外囊泡所需的时间。因此，我们希望缩短这一过程所需的时间。与其他技术相比，本实验方案的优势在于，显著缩短了从人乳中分离这些细胞外囊泡所需的时间。近年来，细胞外囊泡因其作为潜在治疗靶点的前景而受到广泛关注。因此，若能大幅缩短细胞外囊泡的分离时间，则有望将其应用于临床环境。首先，将母乳置于生物安全柜中，并使用无菌 PBS 按 1 比 10 的比例进行稀释。轻轻混匀溶液，以确保稀释均匀。将稀释后的母乳在 4 摄氏度条件下以 300 ×g 离心 10 分钟。离心后，观察试管中出现的三层结构：顶部为乳脂层，中间为脱脂乳或乳清层，底部为细胞和碎片形成的沉淀。在生物安全柜中，将乳脂层和乳清层通过0.7微米滤膜过滤，保留底部沉淀不受扰动。将流穿液转移至新离心管中。随后，在4摄氏度条件下，以2,600 G离心过滤后的样品10分钟。在生物安全柜中，将所得上清液通过0.7微米滤膜过滤，并将最终的上清液转移至15毫升离心管中。在生物安全柜中，使用 5.4 毫升磷酸盐缓冲液（PBS）预润湿一个 0.22 微米、16 英寸的滤器延长装置。用注射器将 PBS 冲洗整个系统，直至液体从管路另一端流出。随后，将母乳通过已预润湿的 0.22 微米、16 英寸滤器延长装置进行注射器过滤，以去除残留的乳脂、细胞和碎片。最后，将滤过的流穿液收集到一个15毫升的锥形管中。通过快速过滤法获得的细胞外囊泡与超速离心法获得的细胞外囊泡进行了比较。纳米颗粒示踪分析显示，采用超速离心法分离的细胞外囊泡平均大小约为100纳米，粒子浓度在此范围内达到峰值。快速过滤法获得的细胞外囊泡平均粒径也约为100纳米，但其颗粒浓度明显高于超速离心法。Western印迹分析显示，热休克蛋白70在通过超速离心法和快速过滤法分离的细胞外囊泡中表达水平相当。CD9和CD63在通过超速离心法和快速过滤法分离的细胞外囊泡中均被检测到。8,000倍透射电子显微镜观察显示，通过超速离心法分离的样品中存在具有典型形态的囊泡，而快速过滤法获得的样品中也可见形态相似的囊泡。过氧化氢处理显著降低了IEC-6细胞培养物的细胞活力和细胞数量，证实其具有细胞毒性作用。无论使用超速离心法还是快速过滤法分离的细胞外囊泡进行共处理，均能显著恢复细胞活力和细胞数量，表明二者具有相当的保护作用。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

人母乳来源的细胞外囊泡的快速分离

来源：Watson, D. C., et.al. 大肠杆菌及其他细菌来源细胞外囊泡的可扩展分离与纯化. J. Vis. Exp.

细菌外膜来源的胞外囊泡的分离与富集

来源：DeMarino, C.，等．远离病毒的高产量细胞外囊泡制备物的纯化．J. Vis. Exp.

在病毒颗粒共存条件下细胞外囊泡的分离与富集

本方案详细描述了一种从低至10...

基于纸张的细胞外囊泡分离与表征装置

本方案描述了从非贴壁/间充质型乳腺上皮细胞中分离、定量和表征细胞外囊泡（EVs）/外泌体的方法，并介绍了利用这些囊泡将乳腺腺体形成能力转移至管腔型乳腺上皮细胞的技术。来源于具有干细胞样特性的乳腺上皮细胞的EVs/外泌体，能够将此类细胞特性传递给摄取这些EVs/外泌体的细胞。...

通过细胞外囊泡/外泌体在乳腺基底上皮细胞与乳腺腔上皮细胞之间转移乳腺腺体形成能力

本文介绍了两种细胞外囊泡的分离方案：超滤离心法和密度梯度超速离心法，用于从小鼠支气管肺泡灌洗液样本中分离细胞外囊泡。通过这两种方法获得的小鼠支气管肺泡灌洗液来源的细胞外囊泡均进行了定量和表征。...

使用超滤离心技术从小鼠支气管肺泡灌洗液中分离细胞外囊泡

本文描述了一种从液体样本中无标记固定外泌体和细胞外囊泡，并通过原子力显微镜（AFM）对其进行成像的逐步操作方法。利用AFM图像可估算溶液中外泌体的尺寸，并表征其其他生物物理特性。...

原子力显微镜对外泌体的成像

本方案通过结合细胞外囊泡（EV）沉淀、密度梯度超速离心和颗粒捕获技术，高效且高得率地将细胞外囊泡与病毒颗粒分离，从而实现简化的操作流程并降低起始样本体积需求，最终获得可重复的细胞外囊泡制备物，适用于所有细胞外囊泡相关研究。...

高产量细胞外囊泡与病毒分离纯化

本方案表明，可利用尺寸排阻色谱法从细胞培养条件培养基中有效分离出细胞外囊泡。...

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本方案展示了如何在简单的实验室台式条件下分离人脐带来源的间充质干细胞小细胞外囊泡（hUC-MSC-sEVs）。通过纳米颗粒追踪分析、BCA蛋白定量检测、蛋白质印迹以及透射电子显微镜，分别对分离得到的hUC-MSC-sEVs的粒径分布、蛋白浓度、sEVs标志物及形态进行表征。...

一种简易台式过滤法从人源间充质干细胞分离小细胞外囊泡

本研究描述了一种从人粪便中富集、分离和纯化细菌胞外囊泡（BEVs）的方法 通过...

利用密度梯度离心法从人粪便中分离和纯化细菌胞外囊泡

学习从人母乳中快速分离高纯度细胞外囊泡的方法。该方案采用快速过滤技术，相比传统超速离心法显著缩短分离时间，同时保持相似的粒径和蛋白表达水平，为炎症调控等临床应用提供高效工具。

快速分离人乳源性细胞外囊泡

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