Name: 使用人 CD59/中间溶血素细胞消融工具快速耗竭肾巨噬细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-09T14:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: 了解利用人CD59/中间溶血素工具选择性消融肾巨噬细胞的方法，研究急性肾损伤后单核细胞依赖CX3CR1/CX3CL1信号轴在七天内恢复88%巨噬细胞的再生机制与免疫监视重建过程。

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我们感谢秦实验室的历任及现任成员，为本研究所采用的实验方案的开发与优化所做出的贡献。同时，我们感谢俄克拉荷马大学健康科学中心 R. K. Tweten 博士团队慷慨提供了重组 ILY 质粒，该质粒对本研究起到了关键作用。本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）基金项目 NIH 5 P51OD011104-58、R01DK129881（X.Q.）和 R21OD024931（X.Q.）的支持。

动物实验方案经杜兰大学医学院机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准（方案编号 1482）。实验小鼠， Cx3cr1CreER+/+ 和 ihCD59+/+，10-12周龄，体重25-30 g，在大学动物实验中心的特定病原体-free（SPF）条件下饲养。所有涉及肾脏分离的操作均在无菌环境中进行，研究人员佩戴手套和口罩以防止污染。本研究中所用试剂与设备的详细信息见于 材料表.
1. 动物准备
<ol>
	<li>从杰克逊实验室（The Jackson Laboratory）获取 CX3CR1CreER+/+ 小鼠。将小鼠饲养于杜兰大学医学院（Tulane University School of Medicine, SOM）的特定无病原体（SPF）设施中。在12小时光照/12小时黑暗循环及受控环境条件下维持动物生存。</li>
	<li>使用先前构建的具有C57BL/6遗传背景的 ihCD59+/+ 小鼠进行繁育。将纯合的 CX3CR1CreER+/+&#160; 小鼠（CX3CR1表达缺陷型）与 ihCD59+/-&#160; 小鼠杂交，以获得以下基因型子代：CX3CR1CreER+/-/ihCD59-/- 和 CX3CR1CreER+/-/ihCD59+/-。</li>
	<li>通过抗CX3CR1抗体流式细胞术分析确认，杂合子 CX3CR1CreER+/- 小鼠保留功能性CX3CR1表达，而纯合子 CX3CR1CreER+/+ 小鼠则缺乏CX3CR1表达9。</li>
</ol>
2. ILY 的制备（源自14,15）
<ol>
	<li>第0天
	<ol>
		<li>从-80 °C冰箱中取出携带pTrcHis-A质粒中带His标签的ILY序列的ILY菌株BL21-DE3-RIPL冻存菌种（补充图1）。取10 µL菌种接种至40 µL含氨苄青霉素（终浓度1 µg/mL）的Luria肉汤（LB）培养基中。</li>
		<li>将接种后的混合液均匀涂布于添加氨苄青霉素（1 µg/mL）的LB琼脂平板上。将平板置于37 °C细菌培养箱中过夜培养。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第1天
	<ol>
		<li>从LB琼脂平板上挑选六个单菌落，将每个菌落分别接种至3.5 mL含氨苄青霉素的LB培养基中。于37 °C过夜培养。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第2天
	<ol>
		<li>将每个3.5 mL的预培养物转移至250 mL含氨苄青霉素的LB培养基中。在37 °C、230 x g振荡条件下培养3小时，以促进细菌生长。</li>
		<li>培养3小时后，从1 M储存液（-20 °C保存）中按1:1000比例加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），使终浓度为1 mM。继续培养4小时以诱导蛋白表达。</li>
		<li>称量一个空离心瓶并记录重量。将约250 mL诱导后的菌液转移至该离心瓶中。</li>
		<li>在4 °C条件下以10,000 x g离心15分钟收集菌体沉淀。弃去上清液后，称量含有沉淀的离心瓶重量。通过减去空瓶重量计算出菌体沉淀的净重。</li>
		<li>将细菌沉淀于-20 °C保存，用于后续ILY蛋白的提取与纯化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第3天：ILY蛋白的提取与纯化
	<ol>
		<li>在50 mL离心管中，将30 mL Bug Buster蛋白提取试剂与30 µL苯并核酸酶（1200 Kunitz单位）及0.9 µL溶菌酶（酶活性10,000单位）混合，配制裂解缓冲液。</li>
		<li>轻轻混匀溶液，确保裂解缓冲液均匀。将配制好的裂解缓冲液加入细菌沉淀（2–5 g）中。充分涡旋振荡30–60秒，使细菌细胞完全重悬。</li>
		<li>将重悬液均分至两个50 mL离心管中。将离心管置于冰上孵育30–90分钟。孵育期间，使用旋转摇床轻柔振荡，并每隔5–10分钟短暂涡旋10–15秒，以增强细胞裂解效果。</li>
		<li>孵育结束后，在4 °C条件下以4,900 x g离心30分钟。</li>
		<li>使用1 mL移液枪头以自来水彻底清洗层析柱，去除前次使用残留的树脂。</li>
		<li>用70%乙醇冲洗层析柱以进行消毒。再用冷的ddH2O清洗2–3次，去除残留乙醇。将层析柱放入支架中。</li>
		<li>加入6–10 mL冷的ddH2O进一步清洗并平衡层析柱，为纯化做准备。向柱中加入约3 mL树脂珠。将层析柱连接至流速设定为30的蠕动泵。</li>
		<li>加入10 mL冷的ddH2O使树脂充分悬浮，为蛋白结合做准备。用15 mL 1x Charging Buffer清洗树脂珠，使树脂准备好结合蛋白。</li>
		<li>离心后，将细菌裂解液上清转移至新离心管中，确保弃去沉淀。使用0.45 µm滤膜和注射器过滤上清液，去除残留的细胞碎片。</li>
		<li>将20–25 mL过滤后的细菌裂解液分三轮通过层析柱。每轮通过后，收集20 µL穿流液，标记为P.E.，用于后续光密度（OD）测定。</li>
		<li>用20–30 mL结合缓冲液清洗层析柱，去除未结合的蛋白。再用20–30 mL洗涤缓冲液清洗层析柱。收集20 µL洗涤液用于OD测定。</li>
		<li>加入10–20 mL洗脱缓冲液洗脱结合的蛋白。从3–4分钟后开始使用微量离心管收集洗脱液，每管约收集1 mL，共收集15–17管。</li>
		<li>使用分光光度计测定各洗脱组分在A280处的吸光度。以洗脱缓冲液作为空白对照进行A280读数。收集A280吸光度显著升高的管段，这些组分通常在第13管左右，含有His标签的ILY蛋白。</li>
		<li>将含有ILY蛋白的洗脱组分（或管）于4 °C保存。应在次日内进行后续操作，以确保蛋白稳定性。 
		注意：尽可能在冰上或4 °C条件下进行所有操作，以维持蛋白完整性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第4天：洗脱液中内毒素的去除
	<ol>
		<li>用6–10 mL超纯水冲洗去内毒素树脂柱。轻轻按压柱体以调节流速。</li>
		<li>用10 mL 1%脱氧胆酸钠溶液（新鲜配制或不超过1个月）冲洗柱子，以去除结合的内毒素。再用6–10 mL超纯水冲洗柱子，去除残留的去垢剂。</li>
		<li>将制备好的蛋白样品上样至树脂柱中。室温（RT）孵育1小时，以实现内毒素的最佳结合。</li>
		<li>收集初始穿流液组分。向柱中加入ddH2O进行进一步洗脱，并将洗脱组分收集至约10个管中（每管1 mL）。</li>
		<li>将树脂柱保存于含25%乙醇的4 °C环境中，以备后续使用。测定洗脱蛋白样品的光密度（O.D.）以量化蛋白得率。预计可从第一批次洗脱液中回收约50%–70%的总蛋白。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第5–6天：透析
	<ol>
		<li>通过高压灭菌1600 mL去离子蒸馏水（ddH2O）配制2 L透析缓冲液。向灭菌后的水中加入200 mL 10x PBS、200 mL甘油和3.5115 g MES（2-(N-吗啉代)乙磺酸）。</li>
		<li>使用磁力搅拌器搅拌，直至所有试剂完全溶解。将配制好的缓冲液于4 °C保存。</li>
		<li>将保存的洗脱组分加入透析装置中，用针头排出装置内的空气。将蛋白溶液在4 °C条件下以搅拌速度约2进行透析，持续24小时。</li>
		<li>调整透析装置，确保其完全浸没于缓冲液中。次日，将透析装置中的缓冲液更换为新鲜的2 L透析缓冲液，继续透析24小时。</li>
		<li>小心地将全部溶液（包括可能出现的白色沉淀）转移至无菌离心管中，以保留可能聚集的ILY蛋白。使用离心过滤装置浓缩ILY蛋白，并按照制造商说明进行离心操作。</li>
		<li>将浓缩后的ILY蛋白分装为每管200 µL，置于无菌管中。在每管上标注日期和名称。将分装样品于-80 °C保存，用于后续的凝胶电泳和溶血活性检测。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 通过SDS-PAGE电泳对ILY进行表征
<ol>
	<li>通过将20倍浓缩的运行缓冲液用ddH2O稀释，配制1倍MOPS SDS电泳缓冲液。</li>
	<li>在通风橱中将90 µL的6倍上样缓冲液与10 µL的β-巯基乙醇（β-ME）混合，配制样品缓冲液。充分混匀溶液，确保完全均一。</li>
	<li>将制备好的样品与上样缓冲液混合，使终体积达到30 µL。将样品解冻并剧烈涡旋，以确保充分混匀。</li>
	<li>在95 °C加热样品5分钟以使蛋白质变性。将样品上样至4%–20% SDS-PAGE凝胶中，在恒定电压80 V条件下电泳运行90分钟。</li>
	<li>小心打开凝胶夹板，将凝胶浸入ddH2O中5分钟。使用摇床重复洗涤步骤2次。</li>
	<li>在室温（RT）下用考马斯亮蓝染色液染色凝胶1小时。用ddH2O洗涤凝胶30分钟。更换为新鲜的ddH2O，并在摇床上孵育凝胶，时间从过夜至3天，以完成脱色。</li>
	<li>使用相机拍摄染色后凝胶的图像（图1A）。使用ImageJ软件对凝胶进行定性和定量分析。</li>
</ol>
4. ILY 活性的溶血实验
<ol>
	<li>在室温下完全解冻保存的ILY（Intermedilysin）样品。充分涡旋振荡已解冻的样品以确保均一性，因为ILY在解冻后可能发生聚集。</li>
	<li>准备一个96孔板用于系列稀释。向第一孔中加入160 µL的ILY原液（26.7 ng/µL）。在同一行或列的后续各孔中分别加入80 µL的1x PBS。</li>
	<li>从第一孔取80 µL ILY溶液转移至第二孔。通过反复吹打充分混匀，确保溶液均一。再从第二孔取80 µL转移至第三孔，并同样充分混匀。</li>
	<li>重复此过程，依次将80 µL溶液从前一孔转移至下一孔，直至完成所需数量的稀释。当向最后一孔转移80 µL后，从中弃去80 µL，以确保各孔间体积一致。</li>
</ol>
5. 人红细胞（RBCs）的制备
<ol>
	<li>将1-2 mL新鲜人血抽入含有抗凝剂（如EDTA）的试管中，在室温下以3,000 × g离心5分钟。</li>
	<li>弃去上清液，并用PBS洗涤人红细胞沉淀2至3次，直至上清液澄清。将洗涤后的人红细胞按10 µL红细胞加入900 µL 1× PBS的比例稀释，得到1:100的稀释液。</li>
	<li>向每个孔中加入10 µL稀释后的人红细胞悬液。从稀释板中取30 µL系列稀释的ILY溶液加入各孔。再加入160 µL 1× PBS，使每孔终体积为200 µL（起始浓度：4 ng/µL）。</li>
	<li>向对照孔中加入10 µL稀释后的人红细胞悬液。向对照孔中加入190 µL水或1× PBS作为阴性对照。轻轻敲击酶标板以混匀内容物。</li>
	<li>将酶标板在37 °C孵育30分钟，使溶血反应发生。然后以3,000 × g离心5分钟，使未破裂的人红细胞形成沉淀。</li>
	<li>小心地将每孔中的100 µL上清液转移至新的平底96孔板中。使用酶标仪在405 nm波长下测定各上清液的吸光度。</li>
	<li>通过将样品的吸光度值与对照进行比较，计算ILY的溶血活性16。</li>
</ol>
6. 他莫昔芬处理、RM细胞耗竭及再生
<ol>
	<li>将玉米油预热至 42 °C。将 100 mg 他莫昔芬溶解于 5 mL 预热的玉米油中，配制浓度为 20 mg/mL 的储备液。</li>
	<li>对 10–12 周龄的雄性 CX3CR1CreER+/-/ihCD59+/- 小鼠进行腹腔内（i.p.）注射他莫昔芬，剂量为 100 µg/g 体重。连续 3 天重复注射他莫昔芬。</li>
	<li>末次他莫昔芬注射后等待 15 天，以允许 Cre 介导的 hCD59 表达。</li>
	<li>向 CX3CR1CreER+/-/ihCD59+/- 小鼠及其 CX3CR1CreER+/-/ihCD59-/- 同窝对照小鼠静脉注射单剂量的中介溶血素（ILY），剂量为 120 ng/g 体重。</li>
	<li>在注射 ILY 后第 1、3 和 7 天进行流式细胞术，监测并确认肾小球足细胞的消融及后续再生17。</li>
</ol>
7. 小鼠安乐死
<ol>
	<li>将动物放入合适的麻醉舱内，根据IACUC规程暴露于异氟烷中。通过检查反射是否消失（如足底回缩反射）来确认麻醉效果。</li>
	<li>当小鼠完全麻醉且无反应时，实施颈椎脱位以确保安乐死。通过确认反射消失（如足底回缩反射）来验证安乐死效果。</li>
	<li>使用精细镊子和剪刀在腹部下侧做一横向切口，随后沿中线垂直向上延伸切口，直至肋骨或胸骨下方。轻柔地牵拉皮肤和肌肉，暴露胸腔。</li>
	<li>使用钝头手术剪小心沿胸骨剪开，打开肋骨 cage，暴露心脏。在右心房做一切口，以便循环系统中的血液排出。</li>
	<li>将21G–23G针头插入心脏左心室。开始用10–20 mL冰冻PBS进行灌注，以冲洗循环血液。持续灌注直至肾脏变苍白，表明器官内血液已成功清除。</li>
	<li>在背部体壁定位肾脏。使用镊子和剪刀轻柔地将肾脏从周围组织中分离。切除肾包膜，并立即将肾脏置于冷PBS中，以防止降解。</li>
</ol>
8. 肾脏消化
<ol>
	<li>通过混合无钙/镁的HBSS、IV型胶原酶（5 mg/mL）和DNase I（20 µg/mL）配制100 mL消化酶混合液。现配现用，并在使用前置于冰上保存。</li>
	<li>在含有5 mL HBSS的培养皿中，用无菌剪刀将肾脏组织剪切成微小碎片（理想情况下≤1 mm）。将肾组织碎片转移至含有10 mL预配酶溶液的15 mL离心管中。</li>
	<li>将离心管在37 °C孵育30分钟，并轻轻振荡以解离组织。使用移液器或注射器推杆轻轻吹打，进一步分散细胞团块。</li>
	<li>将细胞悬液通过40 µm细胞滤网以去除组织碎片。在18 °C下以700&#160;x g离心10分钟。</li>
	<li>离心后小心弃去上清液。将沉淀重悬于5 mL裂解缓冲液中，在室温下孵育5分钟以裂解红细胞。</li>
	<li>用PBS洗涤细胞以去除裂解缓冲液。将所得的单细胞悬液置于冰上保存，待后续使用。</li>
</ol>
9. 密度梯度离心
<ol>
	<li>为富集造血细胞，将上一步洗涤所得的细胞沉淀用10 mL 30%密度梯度溶液重悬。在离心管中，小心地将该溶液铺加到3 mL 70%密度梯度溶液之上。</li>
	<li>将密度梯度在500 × g 条件下离心30分钟，期间不启用刹车。离心结束后，仔细收集30%与70%溶液之间的界面层；该层含有富集的单细胞。</li>
	<li>用10 mL PBS将收集的细胞洗涤两次，每次在500 × g 条件下离心10分钟。将最终的细胞沉淀重悬于1.5 mL离心管中的1 mL FACS缓冲液（含2% FBS的1×PBS）中。</li>
	<li>在明场显微镜下使用血细胞计数板对细胞进行计数。将细胞浓度调整至2 × 106&#160;cells/mL。</li>
</ol>
10. 流式细胞术染色与数据采集
<ol>
	<li>在1.5 mL离心管中，以650 × g 离心5分钟沉淀细胞，然后用1 mL FACS缓冲液重悬细胞沉淀。</li>
	<li>加入抗CD16/32抗体（1:200稀释），以阻断Fc受体的非特异性结合。将细胞在4 °C孵育15分钟。</li>
	<li>使用Aqua Live/Dead染料和预偶联抗体混合物（1:100稀释）对细胞进行染色，抗体混合物包括CD45-e450、CD11b-PE-Cy7、hCD59-PE和F4/80-BV605。将抗体混合物直接加入细胞悬液中。</li>
	<li>将样品在4 °C避光孵育30分钟，以防止荧光染料发生光漂白。用FACS缓冲液（含2%胎牛血清的PBS）洗涤染色后的细胞两次，每次以650 × g 离心5分钟。</li>
	<li>在冰上用1%多聚甲醛（PFA）固定细胞30分钟。用FACS缓冲液洗涤固定后的细胞两次，以去除残留的PFA。</li>
	<li>使用流式细胞仪采集染色并固定的细胞。使用软件分析数据。</li>
	<li>根据文献9所述方法，利用CD45、CD11b和F4/80标记物鉴定肾脏及其他组织驻留型巨噬细胞和小胶质细胞。</li>
	<li>通过前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）图进行初步设门，选择活细胞。通过前向散射面积（FSC-A）与前向散射高度（FSC-H）的散点图设门排除双联体。利用LIVE/DEAD活力染料排除死细胞。</li>
	<li>通过设门选择CD45+细胞群富集免疫细胞。在CD45+细胞群中，将CD11b+F4/80++细胞定义为肾脏驻留型巨噬细胞，如门控策略图所示（图2A）。</li>
	<li>将微胶质细胞群定义为CD11b+CD45iⁿᵗ细胞（图2B）。在流式细胞仪上进行数据采集。使用软件完成最终分析，以完成流式细胞术研究。</li>
</ol>

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作者声明，他们不存在可能影响本论文所报告工作的竞争性财务利益或个人关系。本研究的设计、实施、解释或报告未受到任何利益冲突的影响，包括财务、非财务、专业或个人方面的关系。

本研究中，His标签重组ILY蛋白的成功表达、纯化及功能验证遵循了一项成熟 established 的实验方案15。然而，该过程包含多个关键步骤，以确保获得高产量、高纯度及具有生物活性的蛋白。通过IPTG诱导E. coli BL21 (DE3)细胞时，优化了诱导条件，以在控制蛋白表达水平的同时尽量减少包涵体的形成。尽管该方案具有良好的重复性，但仍需进行若干修改和故障排查，以最大化蛋白产量和功能活性。其中一项关键改进是优化IPTG浓度和诱导温度，因为在较高温度下过度表达会导致蛋白形成不溶性聚集体。在37 °C条件下，将IPTG浓度从0.2 mM逐步提高至0.5 mM，显著改善了蛋白的可溶性。此外，在纯化过程中，洗涤缓冲液中的咪唑浓度经过精细调整，以在有效洗脱目标蛋白的同时尽量减少非特异性蛋白结合。
在本文中，我们描述了一种利用 ILY-hCD59 系统选择...

肾巨噬细胞（RMs）是维持肾脏稳态、调节免疫反应以及在损伤后促进组织修复的关键免疫细胞。它们执行多种功能，包括吞噬作用、抗原提呈，以及协调炎症和抗炎反应1,2,3。根据局部微环境的不同，RMs 可极化为促炎型（M1）或抗炎型（M2）表型，从而加剧损伤或促进修复4,5,6。RMs 功能失调已被证实参与急性肾损伤（AKI）和慢性肾脏病（CKD）的发生与发展，使其成为肾脏健康与疾病过程中的关键参与者7,8。RMs 来源于多种前体细胞，包括胚胎发育期间卵黄囊来源的巨噬细胞、胎儿肝脏单核细胞以及成年期骨髓来源的单核细胞。出生后，RMs 随肾脏生长同步扩增和成熟，出生前主要来源于胎儿肝脏单核细胞，成年后则通过外周单核细胞补充实现自我维持9。在成体中，循环单核细胞可被稳态或损伤信号招募至肾脏，并在局部微环境影响下分化为巨噬细胞。RMs 的稳态维持依赖于局部增殖以及循环单核细胞的周期性补充9,10,11,12。
我们先前已证明，人源CD59（hCD59）/中介溶血素（ILY）细胞消融系统可作为一种工具13,14，用于研究来源于骨髓或胚胎的不同来源的肾巨噬细胞（RMs）各自的命运、动态变化及其微环境生态位9。ILY通过在靶细胞膜上形成孔道，在数秒内选择性裂解表达人源CD59的细胞15。这种特异性源于ILY仅与人源CD59（hCD59）结合，而对缺乏该受体的其他物种细胞无结合或裂解作用15。基于此原理，我们构建了一种工具，可在转基因小鼠模型中通过施用中介溶血素（ILY）实现对表达人源CD59的细胞进行快速、条件性且靶向性的消融14。为促进该工具的应用，我们通过构建带有loxP位点包围的终止序列-CD59基因敲入小鼠（ihCD59），建立了一种条件性和靶向性细胞消融模型，在该模型中，人源CD59的表达仅在Cre介导的重组后发生13。先前研究发现，CX3CR1cre-EFP基因特异性表达于CD11bintF480hi细胞，该细胞群被定义为肾巨噬细胞9。因此，我们利用CX3CR1CreER2+/+小鼠品系与ihCD59小鼠杂交，以实现在肾巨噬细胞上表达hCD59。我们成功获得了基因型为ihCD59+/-/CX3CR1CreER+/-的复合型小鼠9（+/-、+/+ 和 -/- 分别表示纯合子、半合子和非转基因携带小鼠）。在ihCD59+/-/CX3CR1CreER+/-&#160;复合型小鼠中给予他莫昔芬，可条件性地标记并标记表达hCD59的肾巨噬细胞9。在通过ILY处理耗竭肾巨噬细胞生态位后，外周单核细胞迅速分化为骨髓来源的肾巨噬细胞，有效重建该生态位，如先前研究所述9。这一再生过程高度依赖于CX3CR1/CX3CL1信号轴，凸显了该通路在维持和恢复肾巨噬细胞群体中的关键作用9。我们还发现，由于其不同的糖酵解能力，胚胎来源的肾巨噬细胞比骨髓来源的肾巨噬细胞具有更强的免疫复合物清除能力，并且对免疫刺激更为敏感9。
我们提供了一种详细的方案，通过使用伊尔利毒素（ILY）给药后，利用Cre诱导型人源CD59（ihCD59）介导的快速细胞消融技术，选择性清除肾小管间质巨噬细胞（RMs），以研究其再生过程。在CX3CR1CreER+/-/ihCD59+/-&#160;复合小鼠中，注射ILY可靶向清除条件性且特异性表达hCD59的RMs。消融后，我们通过流式细胞术监测巨噬细胞的动态变化，发现巨噬细胞迅速减少，随后RMs开始再生。重组ILY在大肠杆菌E. coli BL21(DE3)细胞中表达，并通过镍-NTA亲和层析纯化。通过SDS-PAGE、分光光度法和溶血实验验证了重组ILY的纯度和功能活性，证实其具有典型的胆固醇依赖性溶细胞毒素活性。我们使用ILY清除小鼠体内的RMs，在给药后1天内实现了高效的巨噬细胞消融。肾巨噬细胞的再生始于消融后第3天，至第7天恢复约85%。数据表明，再生过程主要由单核细胞募集驱动。该模型为研究巨噬细胞生物学提供了有力工具，并在肾脏疾病的巨噬细胞群体靶向调控方面具有潜在治疗价值。ihCD59/ILY细胞消融技术可用于研究肾脏、肝脏、脂肪组织及其他器官中的细胞功能与再生。

<table><tbody><tr><td>0.45 &amp;micro;m 注射器滤器</td><td>Millipore</td><td>SLHVR33RS</td><td></td></tr><tr><td>4-15% TGX 免染色蛋白质凝胶</td><td>Bio-Rad</td><td>4568084</td><td></td></tr><tr><td>6X 上样缓冲液</td><td>Fisher</td><td>50-103-6570</td><td></td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td>WWR Life Science</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>ACK（氯化铵-氯化钾）裂解缓冲液</td><td>Gibco</td><td>A1049201</td><td></td></tr><tr><td>亲和树脂珠</td><td>Millipore</td><td>69670</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素钠溶液</td><td>Zymo Research</td><td>A1001-5</td><td></td></tr><tr><td>抗 CD11b-PE-Cy7（克隆 M1/70）</td><td>Invitrogen</td><td>25-0112-82</td><td></td></tr><tr><td>抗 CD16/32（Fc&amp;gamma;RIII/II，克隆 93）</td><td>eBioscience</td><td>48-0161-80</td><td></td></tr><tr><td>抗 CD45-e450（克隆 30-F11）</td><td>eBioscience</td><td>48-0451-82</td><td></td></tr><tr><td>抗 F4/80-BV605（克隆 BM8）</td><td>BioLegend&amp;nbsp;</td><td>123133</td><td></td></tr><tr><td>抗 hCD59-PE（克隆 OV9A2）</td><td>Invitrogen</td><td>12-0596-42</td><td></td></tr><tr><td>Aqua 活/死细胞染料</td><td>Invitrogen</td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; L34957A</td><td></td></tr><tr><td>珠粒（树脂）</td><td>Millipore</td><td>69670</td><td></td></tr><tr><td>苯并核酸酶</td><td>Millipore</td><td>70664-10KUN</td><td></td></tr><tr><td>BugBuster 蛋白提取试剂</td><td>Millipore</td><td>70584-4</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管用离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>离心管用离心机</td><td>Thermo Scientific</td><td>75-001-241</td><td></td></tr><tr><td>IV 型胶原酶</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS004188</td><td></td></tr><tr><td>玉米油</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8267</td><td></td></tr><tr><td>脱氧核糖核酸酶（DNA酶）I</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS002007</td><td></td></tr><tr><td>Detoxi-Gel 树脂柱</td><td>Millipore</td><td>69670</td><td></td></tr><tr><td>DPBS（Dulbecco&amp;rsquo;s 磷酸盐缓冲液）溶液</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 管</td><td>BD</td><td>365974</td><td></td></tr><tr><td>FBS（胎牛血清）</td><td>Gibco</td><td>10082-139</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Fisher</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>HBSS（Hank&amp;rsquo;s 平衡盐溶液）</td><td>Gibco</td><td>24020117</td><td></td></tr><tr><td>IPTG（异丙基 &amp;beta;-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷）&amp;nbsp;</td><td>Millipore-Sigma</td><td>206-703-0</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>VET one</td><td>502017</td><td></td></tr><tr><td>LB 培养基</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSRFortessa 流式细胞仪</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MES [2-(N-吗啉代)乙磺酸]</td><td>Fisher</td><td>50-488-796</td><td></td></tr><tr><td>MOPS [3-(N-吗啉代)丙磺酸]</td><td>Fisher</td><td>50-213-522</td><td></td></tr><tr><td>Percoll 密度梯度介质</td><td>Cytiva</td><td>17089101</td><td></td></tr><tr><td>蠕动泵</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>现已停产，请使用替代品</td></tr><tr><td>PFA（多聚甲醛）</td><td>Thermo Scientific</td><td>I28800</td><td></td></tr><tr><td>纯化柱</td><td>Millipore</td><td>UFC900308</td><td></td></tr><tr><td>r溶菌酶溶液</td><td>Novagen</td><td>20C71110</td><td></td></tr><tr><td>摇床水浴箱&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>TSSB15</td><td></td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer 透析试剂盒</td><td>Thermo</td><td>66107</td><td></td></tr><tr><td>脱氧胆酸钠</td><td>Fisher</td><td>BP349-100</td><td>新鲜配制或使用一个月内</td></tr><tr><td>无菌细胞筛（40 &amp;mu;m）</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-547</td><td></td></tr><tr><td>他莫昔芬</td><td>Sigma Aldrich</td><td>6734</td><td></td></tr><tr><td>超滤离心管</td><td>Millipore</td><td>UFC900308</td><td></td></tr><tr><td>超纯水</td><td>Thermo</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>涡旋混合器</td><td>Fisher Scientific</td><td>2215365</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-ME（&amp;beta;-巯基乙醇）</td><td>Fisher</td><td>BP176-100</td><td></td></tr></tbody></table>

利用人cd59/中介溶血素细胞清除工具快速耗竭肾巨噬细胞

Rapid Depletion of Renal Macrophages Using Human CD59/Intermedilysin Cell Ablation Tool

肾脏巨噬细胞（RMs）对肾脏健康至关重要，可协调免疫监视、组织稳态以及对损伤的应答。此前，我们报道了利用人CD59（hCD59）/中介溶血素（ILY）细胞清除工具，研究来源于骨髓或胚胎的不同命运、动态变化及微环境的RMs。RMs起源于卵黄囊来源的巨噬细胞、胎儿肝脏单核细胞以及骨髓来源的单核细胞，并通过局部增殖和循环单核细胞的招募在成年期得以维持。本文中，我们报告了一种选择性清除RMs以研究其再生的详细实验方案，包括：1）在小鼠RMs中诱导Cre依赖性hCD59表达的构建与表征；2）ILY的纯化及其活性的鉴定；3）在复合型小鼠中诱导RMs表达hCD59；以及4）ILY介导的RMs清除后再生过程的表征。ILY可在复合型小鼠中特异性且快速地清除RMs，在给予ILY后1天内即可实现高效的巨噬细胞清除。肾内巨噬细胞的再生在清除后第3天开始，至第7天恢复约88%。该模型为研究巨噬细胞生物学提供了有力工具，也可用于选择性清除肾脏、肝脏及脂肪组织中的其他细胞群体，以探究其功能与再生机制。

His标签重组ILY的纯化遵循此前文献14中所述的相同方案。ILY在含有编码中间链球菌（Streptococcus intermedius）ILY基因质粒的E. coli BL21(DE3)细胞中成功表达。经IPTG诱导后，目标蛋白的过表达明显。表达完成后，利用C端His标签进行镍-NTA亲和层析纯化ILY蛋白。通过SDS-PAGE分析确认了ILY的纯度及其分子量（约54 kDa）（图1A）。使用ImageJ软件对蛋白条带强度进行密度测定定量，并通过分光光度分析进一步验证蛋白浓度，最终浓度为1.27 mg/mL。通过人红细胞（RBCs）溶血实验评估纯化后ILY的生物学活性，该实验是评估胆固醇依赖性溶细胞素的标准方法。实验结果显示剂量依赖性的溶血活性，证实了重组蛋白的功能完整性。阳性对照（水）引起完全溶血，而阴性对照（PBS缓冲液）未出现溶血。纯化的ILY表现出强烈的溶血活性，在7.24 ng/mL浓度下可引起50%的人红细胞裂解，在650 ng/mL时溶血率接近完全（99.62%）（<stron...

本文报道了一种利用人CD59/中介溶血素细胞清除工具选择性清除肾巨噬细胞以研究其再生的实验方案。该方法也可用于研究肾脏、肝脏和脂肪组织中其他细胞群体的功能与再生。

利用人CD59/中介溶血素细胞清除工具快速耗竭肾巨噬细胞

肾脏巨噬细胞（RMs）对肾脏健康至关重要，可协调免疫监视、组织稳态以及对损伤的应答。此前，我们……

我们利用小鼠体内表达人源CD59的细胞经中介溶血素（intermedilysin）介导的消融模型，研究肾脏巨噬细胞的再生过程，重点关注损伤后由趋化因子驱动的单核细胞募集以及免疫监视微环境的重建。近年来本领域的研究进展揭示了肾脏巨噬细胞再生的机制，突出了一种特异性招募巨噬细胞的趋化因子，并阐明了急性肾损伤后免疫监视功能如何重新建立。我们结合他莫昔芬诱导型谱系示踪技术、中介溶血素介导的细胞消融、多参数流式细胞术以及活体显微成像技术，对肾脏巨噬细胞进行消融、追踪和实时可视化观察。主要挑战在于避免全身性炎症反应、特异性靶向常驻巨噬细胞，以及在不干扰肾脏微环境稳态的前提下检测快速再生过程。我们发现，在巨噬细胞清除后七天内，单核细胞可恢复88%的肾脏巨噬细胞，该过程高度依赖于CX3CR1-CX3CL1信号轴。实验开始时，将玉米油预热至42摄氏度。将100毫克他莫昔芬溶解于5毫升预热的玉米油中，配制浓度为20毫克/毫升的储备液。以每克体重100微克的剂量，对10至12周龄的雄性小鼠进行腹腔注射他莫昔芬。15天后，以每克体重120纳克的剂量，经静脉注射单次剂量的中间链球菌溶素（intermedilysin）。通过在给予中间型溶血素后第1天、第3天和第7天进行流式细胞术，监测并确认常驻巨噬细胞的清除及随后的再生情况。采集肾脏时，使用精细镊子和剪刀在安乐死小鼠的下腹部区域做一横向切口，然后沿中线向上垂直延伸切口，直至肋骨或胸骨下方。轻轻牵拉皮肤和肌肉，暴露胸腔。剪开右心房，使血液从循环系统中流出。将一根21至23号的针头插入左心室。开始灌注10至20毫升冷PBS以冲洗血液。持续灌注直至肾脏呈现苍白，表明血液已有效清除。在背侧体壁定位肾脏，并使用镊子和剪刀小心地将其从周围组织中分离。切除肾包膜，并立即将肾脏置于冷的 PBS 中以防止降解。通过混合无钙无镁的 HBSS、IV 型胶原酶和 DNase I，制备 100 毫升消化酶混合液。酶溶液需新鲜配制，并在使用前保持在冰上。使用无菌剪刀，在含有 5 毫升 HBSS 的培养皿中将肾脏剪切成微小碎片。将切碎的肾组织转移至含有10毫升预配酶溶液的15毫升离心管中。将离心管置于37摄氏度孵育30分钟，同时轻柔振荡以解离组织。使用移液器或注射器推杆轻轻吹打组织，进一步分散细胞团块。通过40微米细胞筛过滤细胞悬液以去除碎片。在18摄氏度下，以700 ×g离心细胞悬液10分钟。随后，小心弃去上清缓冲液。将沉淀重悬于5 mL裂解缓冲液中，室温孵育5分钟以裂解红细胞。加入PBS洗涤细胞并去除裂解缓冲液。将所得的单细胞悬液置于冰上保存，待后续使用。进行密度梯度离心时，首先将细胞沉淀重悬于10毫升30%密度梯度溶液中。然后小心地将其铺加到离心管中3毫升70%密度梯度溶液的上层。在离心过程中不启用刹车，以500 ×g离心30分钟。离心后，小心收集30%与70%溶液之间的界面层。用10毫升PBS将收集的细胞洗涤两次，每次洗涤以500 ×g离心10分钟。将最终的细胞沉淀重悬于1.5毫升离心管中的1毫升FACS缓冲液中。使用血细胞计数板在明场显微镜下对细胞进行计数，并将细胞浓度调整至每毫升2×10⁶个细胞。将细胞在1.5毫升离心管中以650 ×g离心5分钟形成细胞沉淀，然后用1毫升FACS缓冲液重悬细胞沉淀。加入抗CD16/32抗体（1:200稀释）以阻断非特异性Fc受体结合。将细胞在4°C条件下孵育15分钟后，使用活/死细胞染料Aqua以及包含CD45 E450、CD11B PE SI7、HCD59 PE和F4/80 BV605的预偶联抗体混合物对细胞进行染色。直接将抗体混合物加入细胞悬液中，在4°C避光条件下孵育30分钟，以保护荧光基团。然后用FACS缓冲液洗涤细胞两次。将细胞置于冰上，用1%多聚甲醛固定30分钟。再用FACS缓冲液洗涤细胞两次，以去除残留的固定剂。使用流式细胞仪获取染色并固定的细胞，利用软件分析数据。通过标记物 CD45、CD11B 和 F4/80 鉴定肾脏及其他组织驻留的巨噬细胞和小胶质细胞。使用前向散射和侧向散射图进行初步设门，以选择活细胞。通过前向散射面积与高度设门排除双联体。利用活力染料排除死细胞。通过圈选CD45阳性群体来富集免疫细胞。根据所示的设门策略，将CD45阳性门内CD11b+F4/80hi的细胞定义为肾脏驻留巨噬细胞。将小胶质细胞群定义为CD11b+CD45中等表达的细胞，并进行最终分析。在SDS-PAGE凝胶中，于54千道尔顿附近观察到一条明显的蛋白质条带，证实了重组中间溶血素的纯度及其预期的分子量。纯化的中间溶血素表现出强烈的剂量依赖性溶血活性，在每毫升7.24纳克时可达到50%红细胞裂解，在每毫升650纳克时接近完全裂解。流式细胞术分析证实，在给予中间溶血素一天后，可诱导型人CD59复合Cre-R小鼠肾脏巨噬细胞成功且选择性地被清除，而对照组小鼠中未观察到清除现象。肾脏巨噬细胞从第3天开始重新定植，到第7天时恢复至其原始数量的约88%。到第7天时，仅有5%新再生的肾脏巨噬细胞表达人CD59，表明其重新定植主要通过单核细胞招募，而非原位增殖。

rapid-depletion-renal-macrophages-using-human-cd59intermedilysin-cell

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

使用人 CD59/中间溶血素细胞消融工具快速耗竭肾巨噬细胞

巨噬细胞在多种组织的稳态和病理过程中发挥核心作用。本文介绍的方法包括在体内耗竭巨噬细胞、从小鼠骨髓穿刺物中诱导极化巨噬细胞，以及将巨噬细胞过继转移至小鼠体内。这些技术有助于明确极化巨噬细胞在健康与疾病中的作用。...

小鼠巨噬细胞的耗竭与重建

巨噬细胞是造血系统中具有可塑性的细胞，在保护性免疫和内环境稳态中发挥关键作用。在本报告中，我们描述了优化的 体外...

功能鉴定抑制移植物反应性免疫的调节性巨噬细胞

为了进行后续应用，需要可靠且高效的肾脏免疫细胞分离技术。该技术要求对少量肾脏免疫细胞进行表面抗体标记。本文介绍了一种简明的肾脏免疫细胞分离方法，该方法似乎能够实现这一目标。...

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通过流式细胞术对大鼠肾脏巨噬细胞进行表型表征

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小鼠原代肾小管上皮细胞的分离、鉴定及高通量细胞外通量分析

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一个 离体 高脂饮食诱导脂肪组织炎症的小鼠模型

了解利用人CD59/中间溶血素工具选择性消融肾巨噬细胞的方法，研究急性肾损伤后单核细胞依赖CX3CR1/CX3CL1信号轴在七天内恢复88%巨噬细胞的再生机制与免疫监视重建过程。

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