利用人CD59/中介溶血素细胞清除工具快速耗竭肾巨噬细胞

我们利用小鼠体内表达人源CD59的细胞经中介溶血素（intermedilysin）介导的消融模型，研究肾脏巨噬细胞的再生过程，重点关注损伤后由趋化因子驱动的单核细胞募集以及免疫监视微环境的重建。近年来本领域的研究进展揭示了肾脏巨噬细胞再生的机制，突出了一种特异性招募巨噬细胞的趋化因子，并阐明了急性肾损伤后免疫监视功能如何重新建立。我们结合他莫昔芬诱导型谱系示踪技术、中介溶血素介导的细胞消融、多参数流式细胞术以及活体显微成像技术，对肾脏巨噬细胞进行消融、追踪和实时可视化观察。

主要挑战在于避免全身性炎症反应、特异性靶向常驻巨噬细胞，以及在不干扰肾脏微环境稳态的前提下检测快速再生过程。我们发现，在巨噬细胞清除后七天内，单核细胞可恢复88%的肾脏巨噬细胞，该过程高度依赖于CX3CR1-CX3CL1信号轴。实验开始时，将玉米油预热至42摄氏度。

将100毫克他莫昔芬溶解于5毫升预热的玉米油中，配制浓度为20毫克/毫升的储备液。以每克体重100微克的剂量，对10至12周龄的雄性小鼠进行腹腔注射他莫昔芬。15天后，以每克体重120纳克的剂量，经静脉注射单次剂量的中间链球菌溶素（intermedilysin）。

通过在给予中间型溶血素后第1天、第3天和第7天进行流式细胞术，监测并确认常驻巨噬细胞的清除及随后的再生情况。采集肾脏时，使用精细镊子和剪刀在安乐死小鼠的下腹部区域做一横向切口，然后沿中线向上垂直延伸切口，直至肋骨或胸骨下方。

轻轻牵拉皮肤和肌肉，暴露胸腔。剪开右心房，使血液从循环系统中流出。将一根21至23号的针头插入左心室。

开始灌注10至20毫升冷PBS以冲洗血液。持续灌注直至肾脏呈现苍白，表明血液已有效清除。在背侧体壁定位肾脏，并使用镊子和剪刀小心地将其从周围组织中分离。

切除肾包膜，并立即将肾脏置于冷的 PBS 中以防止降解。通过混合无钙无镁的 HBSS、IV 型胶原酶和 DNase I，制备 100 毫升消化酶混合液。酶溶液需新鲜配制，并在使用前保持在冰上。使用无菌剪刀，在含有 5 毫升 HBSS 的培养皿中将肾脏剪切成微小碎片。

将切碎的肾组织转移至含有10毫升预配酶溶液的15毫升离心管中。将离心管置于37摄氏度孵育30分钟，同时轻柔振荡以解离组织。使用移液器或注射器推杆轻轻吹打组织，进一步分散细胞团块。

通过40微米细胞筛过滤细胞悬液以去除碎片。在18摄氏度下，以700 ×g离心细胞悬液10分钟。随后，小心弃去上清缓冲液。

将沉淀重悬于5 mL裂解缓冲液中，室温孵育5分钟以裂解红细胞。加入PBS洗涤细胞并去除裂解缓冲液。将所得的单细胞悬液置于冰上保存，待后续使用。

进行密度梯度离心时，首先将细胞沉淀重悬于10毫升30%密度梯度溶液中。然后小心地将其铺加到离心管中3毫升70%密度梯度溶液的上层。在离心过程中不启用刹车，以500 ×g离心30分钟。

离心后，小心收集30%与70%溶液之间的界面层。用10毫升PBS将收集的细胞洗涤两次，每次洗涤以500 ×g离心10分钟。将最终的细胞沉淀重悬于1.5毫升离心管中的1毫升FACS缓冲液中。

使用血细胞计数板在明场显微镜下对细胞进行计数，并将细胞浓度调整至每毫升2×10⁶个细胞。将细胞在1.5毫升离心管中以650 ×g离心5分钟形成细胞沉淀，然后用1毫升FACS缓冲液重悬细胞沉淀。加入抗CD16/32抗体（1:200稀释）以阻断非特异性Fc受体结合。

将细胞在4°C条件下孵育15分钟后，使用活/死细胞染料Aqua以及包含CD45 E450、CD11B PE SI7、HCD59 PE和F4/80 BV605的预偶联抗体混合物对细胞进行染色。直接将抗体混合物加入细胞悬液中，在4°C避光条件下孵育30分钟，以保护荧光基团。

然后用FACS缓冲液洗涤细胞两次。将细胞置于冰上，用1%多聚甲醛固定30分钟。再用FACS缓冲液洗涤细胞两次，以去除残留的固定剂。

使用流式细胞仪获取染色并固定的细胞，利用软件分析数据。通过标记物 CD45、CD11B 和 F4/80 鉴定肾脏及其他组织驻留的巨噬细胞和小胶质细胞。

使用前向散射和侧向散射图进行初步设门，以选择活细胞。通过前向散射面积与高度设门排除双联体。利用活力染料排除死细胞。

通过圈选CD45阳性群体来富集免疫细胞。根据所示的设门策略，将CD45阳性门内CD11b+F4/80hi的细胞定义为肾脏驻留巨噬细胞。将小胶质细胞群定义为CD11b+CD45中等表达的细胞，并进行最终分析。

在SDS-PAGE凝胶中，于54千道尔顿附近观察到一条明显的蛋白质条带，证实了重组中间溶血素的纯度及其预期的分子量。纯化的中间溶血素表现出强烈的剂量依赖性溶血活性，在每毫升7.24纳克时可达到50%红细胞裂解，在每毫升650纳克时接近完全裂解。流式细胞术分析证实，在给予中间溶血素一天后，可诱导型人CD59复合Cre-R小鼠肾脏巨噬细胞成功且选择性地被清除，而对照组小鼠中未观察到清除现象。

肾脏巨噬细胞从第3天开始重新定植，到第7天时恢复至其原始数量的约88%。到第7天时，仅有5%新再生的肾脏巨噬细胞表达人CD59，表明其重新定植主要通过单核细胞招募，而非原位增殖。