Name: 黑腹果蝇神经回路光遗传学作的行为测定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-07T14:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: 了解黑腹果蝇光遗传学神经回路操作方法，使用CsChrimson和GtACR2工具精确调控神经元活性，研究温度趋避与味觉行为机制。该方案为神经科学决策研究提供可重复的技术框架。

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所有图示的示意图均使用 Biorender.com 制作。本研究由 NIH R01GM140130（https://www.nigms.nih.gov/）资助，受资助者为 L.N.。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决策以及稿件撰写过程中均未发挥任何作用。

1. 菌株、果蝇饲养与果蝇吸取器
<ol>
	<li>菌株与保种
	<ol>
		<li>实验所用菌株包括 HC-Gal410、Gr5a-Gal420（Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC): 57592）、Gr66a-Gal421（BDSC: 57670）、UAS-GtACR23、UAS-CsChrimson2（BDSC: 55136）。将果蝇在标准玉米粉培养基上，于25 °C、12小时光照:12小时黑暗循环条件下饲养。 
		注意：1 L 玉米粉培养基包含 1 L dH2O、79 g 葡萄糖、7.5 g 琼脂、24 g 酵母粉、57 g 玉米粉、2.1 g 对羟基苯甲酸甲酯（溶于11.1 mL 乙醇中）、6 g 酒石酸钠钾四水合物以及0.9 g 氯化钙。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>果蝇饲养与实验准备
	<ol>
		<li>挑选0至3日龄的果蝇。实验时果蝇将为3至6日龄，以确保年龄一致性（图1A）。</li>
		<li>在实验开始前3天，将每种基因型分为四组：常光ATR -、常光ATR +、红光或蓝光ATR -、红光或蓝光ATR +。</li>
		<li>通过将ATR溶于100%乙醇中制备80 mM ATR储备液。向ATR +组的食物中添加400 µM ATR。</li>
		<li>向ATR -组的食物中添加相同浓度的乙醇，但不加ATR。</li>
		<li>所有组均在黑暗中饲养22。</li>
		<li>将Gr5a&gt;CsChrimson果蝇在仅含湿润滤纸的培养管中饥饿处理16–24小时。ATR +组的培养管中加入含400 µM ATR的水溶液，而ATR -组的培养管中加入含相同浓度乙醇的dH2O。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>果蝇吸虫器
	<ol>
		<li>使用塑料管、昆虫网纱和两支3 mL移液管组装果蝇吸虫器（图1B）。</li>
		<li>剪去移液管的尖端和吸头部分，确保果蝇吸入端口允许果蝇顺畅通过。该设计可通过吸气实现轻柔吸取果蝇，最大限度减少损伤，并便于高效收集和转移单个果蝇。</li>
		<li>将昆虫网纱覆盖在塑料管上，并用Parafilm将移液管的吸头端固定在塑料管上。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 单果蝇蓝光光遗传学趋温定位偏好实验
<ol>
	<li>Drosophila 品系与果蝇饲养
	<ol>
		<li>将 HC-Gal410 驱动品系与 UAS-GtACR23 品系杂交，获得实验基因型 HC&gt;GtACR2。HC&gt;GtACR2 果蝇在加热细胞中表达 GtACR2。 
		注意：确保每种实验条件下使用的雄性和雌性果蝇数量相等。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>实验装置设置与操作
	<ol>
		<li>将两块钢板分别放置在两个加热板上，使其边缘相接。在钢板上方覆盖一张塑料文件保护膜，并用胶带固定以减少移动。在保护膜上放置一张白纸，以降低背景噪声信号（图1C）。 
		注意：每次实验开始前或白纸被污染时，应更换新的白纸。</li>
		<li>在白纸上放置一个透明塑料盖（2 mm 高 × 58 mm 宽 × 83 mm 长），该盖子允许果蝇自由行走，同时防止其飞行。</li>
		<li>在聚苯乙烯泡沫箱（27 cm 高 × 22 cm 宽 × 16 cm 长）底部开一个孔，用于固定摄像头和蓝光光源（1,000 mA），使其位于实验表面约 12 cm 上方。</li>
		<li>调整摄像头和蓝光光源的位置，在确保有效激活的同时尽量减少反光。 
		注意：可能需要预先测试以确定蓝光的激活范围。</li>
		<li>将摄像头设置为以下参数进行录制：1 秒间隔拍摄、窄视野、4000 × 3000 像素。</li>
		<li>调节加热板设置，使两块钢板表面温度分别维持在 25 ± 1 °C 和 31 ± 1 °C。 
		注意：对于需要低于 25 °C 的实验条件，需采用替代冷却方法，如帕尔贴装置或冰块。若钢板温度超过目标值，可向表面喷洒蒸馏水以达到并维持所需温度，随后用纸巾吸去塑料保护膜上的多余水分。</li>
		<li>每次试验前后，使用表面温度探头监测钢板温度。 
		注意：精确的温度控制至关重要，温度波动可能影响实验结果。</li>
		<li>将塑料盖置于 25 °C 区域一侧。使用果蝇吸管轻轻释放一只果蝇至盖下。将泡沫箱置于实验区域上方，营造弱光环境（&lt;10 lux），并让果蝇适应 1 分钟。</li>
		<li>适应期结束后，移开泡沫箱，并迅速调整塑料盖位置，使其中心对准钢板边界，确保 25 °C 和 31 °C 区域各占一半覆盖面积。 
		注意：在此过程中，31 °C 侧盖内空气温度在 5 秒内升至约 27 °C（补充图1），足以激活加热细胞11。</li>
		<li>开启摄像头和蓝光（20 kLux）以启动实验。 
		注意：切勿在室内光照条件下开启蓝光。开启摄像头并先录制数帧画面后再打开蓝光，以防运动干扰。</li>
		<li>持续超过 2 分钟后，关闭摄像头和光源以结束实验。使用吸管清除果蝇。 
		注意：关闭摄像头时可能产生运动，建议多录制几帧画面。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>行为学与统计分析
	<ol>
		<li>仅分析实验开始时停留在 25 °C 区域的果蝇数据。 
		​注意：排除起始位置在 31 °C 区域的果蝇数据，因其常表现出偏好异常23；排除未接近 31 °C 区域边缘的果蝇试验，以确保其已做出温度选择；排除静止不动超过 30 秒的果蝇数据。</li>
		<li>按照先前描述的方法进行结果分析23。计算偏好指数（PI），即果蝇在不同温度区域停留时间之差与总时间的比值，公式如下： 
		<img alt="PI 计算公式，(25°C 下的时间) - (31°C 下的时间) / 总时间，以方程形式展示。" src="/files/ftp_upload/67964/67964eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="方程 1"> 
		注意：实验的统计学细节见图注。数据分析使用适当的数据分析软件完成。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 单果蝇红光光遗传学位置偏好实验
<ol>
	<li>Drosophila 品系与果蝇培养
	<ol>
		<li>将 Gr66a-Gal421 驱动品系与 UAS-CsChrimson2 杂交，获得实验基因型 Gr66a&gt;CsChrimson。Gr66a&gt;CsChrimson 果蝇在苦味味觉神经元中表达 CsChrimson。 
		注意：确保每种实验条件下使用的雄性和雌性果蝇数量相等。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>实验检测的设置与实施
	<ol>
		<li>在暗室或遮光环境中进行实验，以确保对 CsChrimson 的可控激活（图 1D）。</li>
		<li>将摄像机置于实验台面上方约 45 cm 处。
		<ol>
			<li>使用无红外滤光片的摄像机。若摄像机内部装有短通红外滤光片（可阻断波长大于 700 nm 的光），需将其移除。</li>
			<li>使用强力胶将 830 nm 长通滤光片固定于镜头上，以捕获红外波段的光信号。此调整对于在红外光照条件下记录果蝇运动至关重要。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将红光源24 置于实验台面上方约 45 cm 处，确保光照强度约为 2.5 kLux（1,000 mA）。 
		注意：建议佩戴可过滤红光或激光的眼部防护装置。激光防护眼镜有助于防止高强度红光直射造成的眼睛损伤。</li>
		<li>使用红外光在装置内观察果蝇。实验全程保持开启。 
		注意：避免红外光在实验区域产生眩光；眩光可能干扰数据分析。</li>
		<li>使用胶水将 780 nm 红外长通滤光片粘贴至塑料盖的一半区域。 
		注意：可使用任何可阻断 780 nm 以下波长的长通滤光片。未过滤的一侧允许红光和红外光透过，而过滤的一侧仅允许红外光透过。</li>
		<li>在实验区域下方放置黑色哑光材料，以最小化背景噪声。</li>
		<li>使用果蝇吸移器将一只果蝇置于透明塑料盖下（高度 2 mm × 宽度 58 mm × 长度 83 mm），并让其适应 1 分钟。</li>
		<li>等待果蝇出现在未过滤的一侧后，启动摄像机和红光以开始实验。 
		注意：摄像机在启动后可能立即产生运动伪影。录制过程中应牢固固定摄像机，并在正式记录前数秒开启摄像机，以避免异常移动干扰分析。红光应在实验开始时才开启。</li>
		<li>记录果蝇运动 1 分钟。 
		注意：若果蝇未接近中线或连续超过 15 秒未移动，则舍弃该次实验数据。</li>
		<li>1 分钟后，关闭摄像机和光源以结束实验。使用吸移器处理果蝇。 
		注意：建议多记录若干帧画面，以避免关机时运动带来的干扰。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>行为学与统计分析
	<ol>
		<li>采用先前描述的方法23 进行结果分析。偏好指数（PI）定义为果蝇在无滤光区域停留时间与在有滤光区域停留时间之差，除以总时间，计算公式如下： 
		<img alt="PI 公式：(无滤光区时间 - 有滤光区时间) / 总时间；用于数据分析的公式。" src="/files/ftp_upload/67964/67964eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 2"> 
		注意：实验的统计学细节见图注。数据分析使用适当的数据分析软件完成。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 红光光遗传学诱导的喙伸展反应
<ol>
	<li>Drosophila 品系与果蝇饲养
	<ol>
		<li>将 Gr5a-Gal420 驱动品系与 UAS-CsChrimson2 杂交，获得实验基因型 Gr5a&gt;CsChrimson。Gr5a&gt;CsChrimson 果蝇在甜味感受神经元中表达 CsChrimson。 
		注意：确保每种条件下使用的雄性和雌性果蝇数量相等。</li>
		<li>在测试前将果蝇饥饿处理 16–24 小时，并添加（ATR +）或不添加（ATR -）ATR。 
		注意：可能需要更长的饥饿时间以引发较强的反应。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>实验检测的设置与操作
	<ol>
		<li>通过冰上冷却使果蝇麻醉（图 1E）。 
		注意：避免果蝇与冰直接接触。冷却时间应控制在约 1 分钟以内；长时间冷却可能导致恢复困难和死亡。</li>
		<li>使用 1000 µL 移液枪枪头在载玻片上点 7–10 个微小胶点。 
		注意：载玻片上的小胶滴可防止果蝇被胶液淹没，并有助于避免胶粘附到其喙部或腿部。</li>
		<li>将一只果蝇腹面朝上放置于每个胶点上。确保其胸部和翅膀接触胶液以减少移动。将翅膀向两侧展开，以增加粘附表面积。 
		注意：避免将果蝇放置得过近，以免在光照时意外激活多只果蝇。</li>
		<li>让胶液干燥约 10 分钟。</li>
		<li>将载玻片转移至湿度盒（内含湿润纸巾的塑料盒）中，让果蝇恢复 2 小时。</li>
		<li>将载玻片置于显微镜下。使用注射器滴加一滴水以使果蝇饱足，防止因口渴引发的喙伸展反应。</li>
		<li>手动持红光激光笔照射单只果蝇的喙部/头部（700 lux），同时通过显微镜观察其 PER 反应。 
		注意：通过显微镜观察红光时，必须佩戴可过滤红光激光的眼部防护装置。</li>
		<li>在 30 秒时间窗口内观察并记录喙伸展情况。采用以下评分系统对每只果蝇进行评分：0 表示无伸展，0.5 表示伸展持续 1–2 秒，1 表示伸展持续超过 3 秒。</li>
		<li>在检测光诱导的喙伸展反应后，使用注射器检测 4% 蔗糖的反应。将蔗糖液滴从针头末端推出，并靠近果蝇喙部。 
		注意：对未响应蔗糖液滴的果蝇，应舍弃其数据。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>行为学与统计分析
	<ol>
		<li>使用适当的数据分析软件进行统计分析。 
		注意：实验的统计学细节在图注中提供。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 红光光遗传果蝇迷宫实验
<ol>
	<li>Drosophila 品系与果蝇培养
	<ol>
		<li>将 Gr66a-Gal421 驱动品系与 UAS-CsChrimson2 杂交，获得实验基因型 Gr66a&gt;CsChrimson。Gr66a&gt;CsChrimson 果蝇在苦味味觉神经元中表达 CsChrimson。 
		注意：确保每组包含数量相等的雄性和雌性果蝇。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>果蝇迷宫组装
	<ol>
		<li>按照 图1F 所示制作果蝇迷宫。 
		注意：也可采用3D打印技术制作迷宫组件，并按先前所述方法进行组装25。</li>
		<li>将三根5 mL塑料培养管裁剪至适当长度，分别作为装载管、无遮盖透明测试管和铝箔包裹测试管。按照 图1F 所示将各管连接至果蝇迷宫。
		<ol>
			<li>根据迷宫材料裁剪测试管，以确保不同测试条件下距离相等。根据滞留室的长度，在透明迷宫中缩短无遮盖测试管的长度；若迷宫为不透明材质，则缩短铝箔包裹测试管的长度。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>实验检测设置与操作
	<ol>
		<li>在黑暗或低光照条件下，将10只雄性和10只雌性果蝇放入装载管中。将装载管连接至滞留室。倾斜升降装置并轻敲管体，使果蝇进入滞留室。 
		注意：降低升降装置，使滞留室仅有一半开口。该操作有助于果蝇从装载管顺利转移至滞留室。</li>
		<li>果蝇转移至滞留室后，使用升降装置将其降至装载管与测试管孔之间，随后移除装载管。</li>
		<li>将果蝇迷宫置于距离红光光源（1000 mA）约13 cm处，此时暂不开启光源。</li>
		<li>继续降低升降装置，直至滞留室与测试管孔对齐，使果蝇可在铝箔包裹管与无遮盖测试管之间自由移动。同时开启红光以激活CsChrimson。确保无遮盖测试管表面的红光强度约为40 kLux。 
		注意：必须在滞留室完全下降并与测试管孔对齐后才可开启红光。由于红光亮度较高，建议佩戴可过滤红光/激光的护目镜。</li>
		<li>果蝇在暴露于红光的管与遮蔽管之间自由选择，持续1分钟。</li>
		<li>1分钟后，将升降装置升至装载管与测试管孔之间。统计各管中的果蝇数量。 
		注意：仅统计活跃且未受伤的果蝇。</li>
		<li>每次实验后，使用dH2O清洗果蝇升降装置和迷宫。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>数据分析与统计
	<ol>
		<li>偏好指数（PI）的计算方法为：无遮盖管与遮盖管中果蝇数量之差除以果蝇总数，公式如下： 
		<img alt="行为分析用偏好指数（PI）公式；实验结果计算方程。" src="/files/ftp_upload/67964/67964eq03.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="方程3"> 
		注意：实验的统计学细节见图注。数据分析使用适当的数据分析软件进行。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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作者声明，本文的发表不存在任何利益冲突。所有作者均已披露任何潜在的利益冲突，并确认他们与本研究所述工作无任何可能产生影响的财务或个人关系。

光遗传学操控通过实现对神经回路的时空精确控制，彻底改变了神经科学领域27神经回路由通过突触相互连接的神经元群体组成，激活后可执行特定功能。 果蝇 全脑连接组已完成，为脑内突触通路提供了全面深入的解析 果蝇 脑28,29尽管连接组能够预测某些行为背后的潜在神经环路机制，但仍需进一步的实验验证。通过结合遗传学工具与行为检测方法，光遗传学操控为探究神经环路在行为功能中的作用提供了强有力的手段。例如，整合 转- 与光遗传学技术结合使用，可激活或沉默下游神经元，使研究人员能够确定单个突触后神经元在行为学上的意义5,30.
本研究建立了简单、易行且可重复的光遗传学实验方案，用于行为学检测 黑腹果蝇通过设计四种靶向不同神经环路的实验方法，我们展示...

光遗传学已成为神经科学领域中结合光学与遗传学的一项强大技术，通过光刺激实现对神经元活动的精确、非侵入性调控1在 黑腹果蝇 一种广泛使用的模式生物，光遗传学工具可实现对特定神经元的激活与抑制，使研究人员能够调控神经回路。在所使用的工具中，CsChrimson 和 GtACR（Guillardia theta 阴离子通道视紫红质）为神经元靶向提供了互补的方法。CsChrimson通道视紫红质是一种来自绿藻的红光敏感型阳离子通道，在红光照射下可通过去极化实现神经元激活，其峰值激活波长约为590 nm。2. CsChrimson 在组织穿透性方面优于先前的通道视紫红质，并可减少光诱导的行为伪影 果蝇 研究2相比之下，GtACR（包括GtACR2等变体）是一种光控氯离子通道，可通过超极化使神经元沉默。3,4GtACR2 传导阴离子，并可被蓝光激活，其最大激活波长约为 470 nm4CsChrimson 和 GtACR2 可被不同波长的光激活，从而确保对神经元活动进行精确且独立的调控，避免交叉激活5.
Drosophila 因其成本低、易于培养以及对环境刺激（包括趋近和回避行为）具有显著的行为反应，成为神经科学研究中有效的模式生物6。其体型小且体壁半透明，有利于光的穿透，尤其是长波长的红光，从而实现高效的光遗传学操控7,8。尽管 Drosophila 细胞无法合成足够的视黄醛（视蛋白功能所需的关键辅因子），但在其饮食中添加视黄醛可弥补这一缺陷，确保光遗传学工具的有效激活9。
为了探究光遗传学操控的影响 果蝇我们描述了四个针对不同神经回路和行为的实验，每个实验均采用不同的方法来评估回避或趋近反应，实验范围从单只果蝇检测到群体水平的评估。加热细胞（HC）在 果蝇 位于触角芒中的热感受神经元，可响应温度升高10这些神经元表达对热敏感的离子通道，可触发回避行为，引导果蝇远离热源10,11在方法1中，我们采用单只果蝇蓝光光遗传学热趋向定位偏好实验来操控HC神经元。通过在这些神经元中表达GtACR2，蓝光照射可抑制其活性。果蝇被暴露于两种温度选择环境中：25 °C和31 °C。在室光照条件下，果蝇避开31 °C区域，表现出典型的热趋向反应。然而，在蓝光激活GtACR2后，HC神经元被沉默，果蝇不再表现出显著的温度偏好，表明光遗传学抑制成功。除了评估感觉神经元的功能外，在下游感觉神经元中表达GtACR2也可实现类似的光遗传学操控，用于研究特定感觉模式所必需的神经环路5.
果蝇中的味觉受体GR66a在喙末端的下唇须以及腿部表达，介导苦味感知12,13。这些神经元在接触苦味物质时会触发回避行为。在方法2中，我们采用单只果蝇红光光遗传位置偏好实验来操控表达GR66a的神经元。通过在这些神经元中表达CsChrimson，可在红光照射下激活它们。将果蝇置于一个半区透红光、另半区过滤红光的实验区域中。在无红光照射时，果蝇无明显偏好。然而，红光激活CsChrimson后刺激了苦味感知神经元，导致果蝇显著回避被照亮的区域，证实了对GR66a神经元的光遗传学激活成功。类似的方法已被用于鉴定足以引发回避行为的热感应细胞的下游神经环路5。
我们在方法3中重点研究了趋近行为中奖赏性行为的光遗传学激活。表达GR5a的神经元位于喙器和足部的味觉感受器中，能够感知糖类并驱动摄食行为。这些神经元的激活可引发喙伸展反应（proboscis extension response, PER）14。我们采用红光光遗传学喙伸展反应检测法来激活GR5a神经元。通过在这些神经元中表达CsChrimson，利用红光对其进行刺激。果蝇在室内光照条件下不会伸展喙部，但在红光激活CsChrimson后，即使没有甜味刺激，也能引发喙伸展反应，表明GR5a神经元成功实现了光遗传学激活。该方法已被用于研究包括味觉感觉神经元、味觉投射神经元以及喙部运动神经元在内的神经环路15,16。
在方法4中，我们利用红光光遗传果蝇迷宫实验&#160;，研究了激活GR66a神经元后对果蝇群体回避行为的影响。将果蝇置于两根管子的交汇处：其中一根管子用红光照射，另一根则处于遮蔽状态。GR66a神经元中表达的CsChrimson引发了回避行为。在无红光照射时，果蝇未表现出偏好；而在红光激活条件下，表达GR66a的果蝇会主动避开红光区域，表明该神经通路被成功激活。果蝇迷宫实验已被广泛用于研究多种感觉模态，包括温度、湿度和嗅觉。当与光遗传学技术结合时，该方法在探究趋近性和回避性行为方面具有强大优势17,18,19。
这些方法为研究光遗传学激活与抑制提供了可重复的框架 果蝇 神经环路。通过结合使用不同的通道视紫红质和可及的行为学检测方法，这项概念验证研究展示了光遗传学操控的有效性，提供了直接调控神经环路功能的方法，具有在神经科学研究中广泛应用的潜力。

<table><tbody><tr><td>1000 mA LED 驱动器</td><td>Luxeon Star</td><td>3021-D-E-1000</td><td></td></tr><tr><td>5 mL VWR培养管，塑料，带双位置盖</td><td>VWR</td><td>60818-664</td><td></td></tr><tr><td>780 长通滤光片 / 红外 780 nm 100 mm × 100 mm</td><td>李氏滤光片</td><td>BH #LE8744</td><td>裁剪至约 47 x 100 以适配塑料盖</td></tr><tr><td>Agfabric 6.5英尺 x 15英尺 昆虫防护网 园艺遮网 用于保护植物、蔬菜、花卉和水果</td><td>家得宝</td><td>EIBNW6515</td><td></td></tr><tr><td>全反式视黄醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>116-31-4</td><td></td></tr><tr><td>铝板（30.5 cm × 30.5 cm × 0.6 cm）</td><td>亚马逊</td><td></td><td>购自亚马逊</td></tr><tr><td>黑色塑料盒</td><td>LI-COR</td><td>929-97101</td><td></td></tr><tr><td>无水氯化钙 25克</td><td>赛默飞世尔科技&amp;nbsp;</td><td>AC297150250</td><td></td></tr><tr><td>配备 Exmor R CMOS 传感器的 CX405 Handycam</td><td>索尼</td><td>HDR-CX405</td><td></td></tr><tr><td>埃尔默&amp;rsquo;s &amp;ldquo;学校用胶水&amp;rdquo;</td><td>埃尔默</td><td></td><td></td></tr><tr><td>乙醇，纯品（200度）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Isotemp 加热磁力搅拌器</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP88850200</td><td></td></tr><tr><td>果蝇品系：Gr5a-Gal4</td><td>布卢明顿果蝇品系中心</td><td>57592</td><td></td></tr><tr><td>果蝇品系：Gr66a-Gal4</td><td>布卢明顿果蝇品系中心</td><td>57670</td><td></td></tr><tr><td>果蝇品系：HC-Gal4（II）</td><td>Dr. Marco Gallio 实验室</td><td></td><td>一份善意的馈赠</td></tr><tr><td>果蝇品系：UAS-CsChrimson</td><td>布卢明顿果蝇品系中心</td><td>55136</td><td></td></tr><tr><td>果蝇品系：UAS-GtACR2/TM6B</td><td>Dr. Quentin Gaudry 实验室</td><td></td><td>一份善意的馈赠</td></tr><tr><td>Flystuff 62-101 黄玉米粉（11.3 千克），黄色，11.3 千克/单位</td><td>Genesee Scientific</td><td>62-101</td><td></td></tr><tr><td>Flystuff 62-107 无活性干酵母，10 千克，营养片状，10 千克/单位</td><td>Genesee Scientific</td><td>62-107</td><td></td></tr><tr><td>Flystuff 66-103 Nutri-Fly 果蝇培养基琼脂，石花菜，100目，5公斤（11.02磅）/单位</td><td>Genesee Scientific</td><td>66-103</td><td></td></tr><tr><td>FreeMascot OD 8+ 190 nm&amp;ndash;420 nm / 600 nm&amp;ndash;1100 nm 波长紫光/红光/红外激光防护眼镜&amp;nbsp;</td><td>FreeMascot&amp;nbsp;</td><td>B08LGMQ65S</td><td>从亚马逊购买</td></tr><tr><td>GoPro Hero8 Black</td><td>GoPro</td><td>6365359</td><td></td></tr><tr><td>LEE Filters 100&amp;times;100 毫米红外 #87 红外聚酯滤光片</td><td>B&amp;amp;H 照片</td><td>LE8744</td><td></td></tr><tr><td>长通滤光片，彩色玻璃，50.8 × 50.8 mm，截止波长830 nm，RG830</td><td>纽波特</td><td>FSQ-RG830</td><td></td></tr><tr><td>对羟基苯甲酸甲酯，99%，Thermo Scientific Chemicals</td><td>赛默飞世尔科技&amp;nbsp;</td><td>126960025</td><td></td></tr><tr><td>MicroWell 微孔板，60 孔，低矮型，无菌聚苯乙烯</td><td>赛默飞世尔科技&amp;nbsp;</td><td>NUNC 439225</td><td>盖子用作 &quot;塑料盖&quot;</td></tr><tr><td>Olympus Plastics 24-160RS, 1000 &amp;micro;L 奥林巴斯人体工学低吸附移液器吸头，盒装，无菌，每单元8盒，每盒96个吸头</td><td>Eppendorf</td><td>24-160RS</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M 封口膜</td><td>Heathrow Scientific</td><td>HS234526B</td><td>4 英寸 × 125 英尺</td></tr><tr><td>氯化钾，ACS，99.0-100.5%&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技&amp;nbsp;</td><td>AA1159530</td><td></td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad</td><td>版本 9</td><td>数据分析软件</td></tr><tr><td>Samco 刻度移液管</td><td>赛默飞世尔科技&amp;nbsp;</td><td>225</td><td>3 mL</td></tr><tr><td>载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-2</td><td>&amp;nbsp;5 mm × 75 mm × 1.0 mm</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>OLYMPUS</td><td>CZ61</td><td></td></tr><tr><td>泡沫箱（27 cm 高度） &amp;times; 22 cm 宽度 &amp;times; 16 cm 长度）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Fisher Scientific</td><td>225911</td><td></td></tr><tr><td>表面温度探头</td><td>弗卢克</td><td>80PK-3A</td><td></td></tr><tr><td>注射器</td><td>BD Integra</td><td>305270</td><td></td></tr><tr><td>Tate &amp;amp; Lyle 457 葡萄糖，Tate &amp;amp; Lyle, Pow, Tate &amp;amp; Lyle 457 葡萄糖，Tate &amp;& Lyle，粉末，50 磅/单位</td><td>Genesee Scientific</td><td>62-113</td><td></td></tr><tr><td>可追溯校准式多位数热电偶温度计</td><td>可追溯于 cple-parmer</td><td>&amp;nbsp;UX-91210-07</td><td>Fisherbrand Traceable BigDigit K型温度计</td></tr><tr><td>三重蓝光LED右侧</td><td>LEDSupply</td><td>07007-PB000-D</td><td>470 nm</td></tr><tr><td>三重红光LED右舷灯</td><td>LEDSupply</td><td>07007-PD000-F</td><td>627 nm</td></tr><tr><td>Tygon PVC 透明管 1/4&quot; ID，3/8&quot; 光密度，5 英尺长度&amp;nbsp;</td><td>McMaster-Carr 供应公司&amp;nbsp;</td><td>6516T21&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Univivi IR 照明器，850 nm 12 颗 LED 广角红外照明器，用于夜视</td><td>Univivi</td><td>4331910725</td><td></td></tr><tr><td>Wakefield Thermal 25.4 mm 圆形散热片星形 LED 基板 - 882-100AB</td><td>Wakefield-Vette</td><td>882-100AB</td><td></td></tr><tr><td>无线演示器</td><td>DinoFire 商店</td><td>B01410YNAM</td><td>购自亚马逊</td></tr></tbody></table>

用于光遗传学操控神经环路的行为学检测方法 黑腹果蝇

Behavioral Assays for Optogenetic Manipulation of Neural Circuits in Drosophila melanogaster

光遗传学已成为神经科学中的一项基本技术，能够通过光刺激精确控制神经元活动。本研究介绍了在黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中易于实施的光遗传学实验装置。研究中使用了两种光遗传学工具：CsChrimson（一种红光激活的阳离子通道）和GtACR2（一种蓝光激活的阴离子通道），并应用于四种实验方法。其中三种方法涉及单只果蝇实验：（1）针对温度敏感性加热细胞的蓝光光遗传热趋向定位偏好实验；（2）激活苦味感知神经元的红光光遗传定位偏好实验；（3）激活甜味感知神经元的喙伸展反应实验。第四种方法（4）是利用多只果蝇进行的果蝇迷宫实验，用于评估回避行为。对神经活动在时间和空间上的操控能力，为理解感觉信息处理和决策过程提供了强有力的手段，凸显了光遗传学在推进神经功能研究方面的潜力。这些方法为未来的神经科学研究提供了可及且可靠的框架，有助于深入理解特定神经通路及其行为结果。

单果蝇蓝光光遗传学趋温位置偏好实验 
共测试了四种条件：室内光照且无ATR补充（室内光，ATR -）、室内光照且有ATR补充（室内光，ATR +）、蓝光照射且无ATR补充（蓝光，ATR -），以及蓝光照射且有ATR补充（蓝光，ATR +）。前三种条件作为对照。在对照实验中，果蝇会避开31 °C一侧。而在蓝光照射并补充ATR的条件下，果蝇对25 °C与31 °C两侧无显著偏好，表明通过激活GtACR2成功抑制了HC神经元（图2A）。
单果蝇红光光遗传学位置偏好实验 
共测试了四种条件：室内光照且无ATR补充（室内光，ATR -）、室内光照且有ATR补充（室内光，ATR +）、红光照射且无ATR补充（红光，ATR -）以及红光照射且有ATR补充（红光，ATR +）。前三种条件作为对照。对照组中的果蝇未表现出位置偏好，两侧分布相似。在补充ATR的情况下进行红光激活（红光，ATR +）可引导果蝇避开红光区域，表明苦味感知神经元被CsChrimson激活...

本文介绍了利用CsChrimson和GtACR2激活和抑制特定神经元的黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）光遗传学操作方法。通过四项实验，应用光遗传学技术研究趋热性和味觉行为，揭示调控这些过程的神经机制。

光遗传学已成为神经科学中的一项基本技术，能够通过光刺激精确控制神经元活动。本研究……

我们的研究利用光遗传学工具，探究黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）的神经回路如何调控行为，例如趋温性和妊娠过程。通过光控特定神经元，我们旨在高精度地理解这些神经回路如何驱动感觉反应并影响决策行为。光遗传学是神经科学领域的一项重要技术，能够利用光对神经活动实现精确控制。在黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中，CsChrimson 和 GtACR2 等工具可实现对神经元的靶向激活与抑制。这些工具使研究人员能够操控神经回路、研究行为并高特异性地探究感觉反应。我们的实验方案为果蝇中的光遗传学操控提供了一种简单、经济且可重复的方法。该方法使用市售材料，因此在资源有限的实验室和教室中均可开展。这些方法还具有高度的适应性，能够以最少的技术难题研究趋近和回避行为。首先，获取在加热细胞中表达 GtACR2 的雄性和雌性黑腹果蝇（Drosophila flies）。将两块钢板分别放置在两个加热板上，使其边缘对齐。在钢板上方放置一张塑料文件保护膜，并用胶带固定以减少移动。然后，在塑料文件保护膜上放置一张白纸以降低背景噪声信号，并在白纸上方再覆盖一层透明塑料盖板。然后在聚苯乙烯泡沫箱底部开一个孔，用于安装相机和蓝光灯，使其位于实验表面约12厘米上方。调整相机和蓝光灯的位置，以尽量减少反光，同时确保有效激活。将相机设置为以1秒间隔拍摄，采用窄视野，分辨率为4,000 × 3,000像素。调节加热板的设置，使相应钢板的表面温度分别维持在 25 ± 1 °C 和 31 ± 1 °C。每次试验前后，使用表面温度探头监测钢板的温度。接着，将塑料盖放置在 25 °C 的钢板上。现在，使用果蝇吸取器，轻轻将一只果蝇释放到盖板下方。将盒子置于实验区域上方，使下方光照变暗至低于10勒克斯，并让果蝇适应环境一分钟。适应期结束后，抬起盒子，并迅速调整塑料盖板，使盖板中心与钢板边界对齐。启动实验，打开相机和20千勒克斯的蓝光。记录果蝇的活动持续两分钟。两分钟后，关闭相机和光源。使用吸虫器处理果蝇。将表达CsChrimson的饥饿雄性和雌性果蝇（其甜味感受神经元中表达CsChrimson）置于冰上麻醉。在玻璃载片上涂抹7至10个小胶点。将每只果蝇腹面朝上放置在胶点上，确保胸部和翅膀接触胶水以减少移动。将翅膀向两侧展开，以增加粘附表面积。在保湿盒中放入湿润的纸巾，并将载玻片放入盒内。恢复两小时后，将载玻片置于显微镜下。使用注射器滴加一滴水以满足果蝇的水分需求，防止因口渴引发的喙伸展。手动持握红色激光笔，将红光照射到单只果蝇的喙部或头部，光照强度为700勒克斯。在30秒的时间窗口内，通过显微镜观察Proboscis伸展反应。在测试光诱导的Proboscis伸展后，检查对4%蔗糖的反应。将一滴蔗糖溶液从注射器针头末端排出，并将其靠近果蝇的Proboscis。首先，为实验组装果蝇迷宫。在黑暗或低光照条件下，将10只雄性和10只雌性表达CsChrimson的果蝇放入装载管中，并将其连接至滞留室。倾斜升降装置，并轻轻敲击管子，使果蝇进入滞留室。将果蝇转移至滞留室后，使用升降装置将其降至加样管与测试管孔之间，随后移除加样管。将果蝇迷宫置于距离1,000毫安红色光源约13厘米处，但暂不打开光源。降低升降装置，直至 holding chamber 与测试管孔对齐，使果蝇能够在用铝箔包裹的和未覆盖的测试管之间自由移动。同时，打开约 40 kilolux 的红光以激活 CsChrimson。让果蝇在暴露于红光的管子与遮光的管子之间选择一分钟。一分钟后，升起加样管和测试管孔之间的升降架。从每根管中移出果蝇，计数并记录数量。每次实验后使用蒸馏水清洁果蝇升降器和果蝇迷宫。在蓝光、光遗传学、趋热性、位置偏好实验中，对照条件下果蝇会避开31°C的一侧；而在补充ATR的蓝光照射下，果蝇对25°C与31°C之间无明显偏好，表明通过GtACR2激活抑制了HC神经元。在对照条件下，果蝇的喙伸展反应极微弱；而在补充ATR的红光照射下，果蝇出现显著的喙伸展反应，表明CsChrimson激活了感知甜味的神经元。在红光、光遗传学果蝇迷宫实验中，对照组果蝇无明显偏好，而补充ATR后在红光激活下，果蝇会避开未遮盖的管道，表明CsChrimson激活了感知苦味的神经元。

behavioral-assays-for-optogenetic-manipulation-neural-circuits

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

黑腹果蝇神经回路光遗传学作的行为测定

光遗传学技术能够利用光来操控经过基因工程改造、表达特定视蛋白的神经元——这些视蛋白是光敏感蛋白，其光激活可引发神经元状态的改变。本文介绍了一种在果蝇（Drosophila）中应用视蛋白Channelrhodopsin2的光遗传学方法。该示例实验方案采用光遗传学检测手段，旨在研究果蝇逃避行为背后的神经环路机制。...

Drosophila 光遗传学：一种操控神经环路的方法

本视频展示了一项关于导航行为的研究 果蝇 幼虫在嗅觉感觉神经元（ORNs）光遗传学刺激下的反应。转基因 果蝇...

导航行为 果蝇 幼虫对嗅觉感觉神经元光遗传学刺激的反应

可遗传编码的光遗传学工具能够非侵入性地操控特定神经元 果蝇...

光遗传学刺激黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）的逃避行为

本文介绍了一种果蝇幼虫的明暗偏好实验。该检测方法可提供有关光感知及光行为的先天性与昼夜节律调控的信息。...

Drosophila 幼虫中研究先天性和昼夜节律调控光行为的光偏好实验

在此，我们描述了一种在半离体条件下通过光遗传学手段操控运动神经元活动，同时监测运动输出（肌肉收缩）变化的实验方案。 果蝇...

利用激光照射对半完整神经组织进行光遗传学干预以调控神经活动 果蝇 运动中的幼虫

在本视频文章中，我们描述了一种自动化检测方法，用于测量饥饿或饱腹状态对成年果蝇Drosophila...

一种用于果蝇觅食行为的单体检测方法 果蝇

本文介绍了一种用于检测多达100只醋蝇（Drosophila...

通过计算机追踪检测的嗅觉行为 果蝇 四象限嗅觉仪中

本方案分析导航行为 黑腹果蝇 幼虫在嗅觉神经元同时接受光遗传学刺激时的行为反应。使用波长为630...

追踪 果蝇 幼虫对嗅觉神经元光遗传学刺激的行为反应

本方案介绍了一种光斑检测法，用于研究黑腹果蝇（Drosophila）幼虫的趋光行为。在该检测中，通过产生一个光斑作为光刺激，利用基于红外光的成像系统记录幼虫避光过程。...

基于光斑的实验方法用于分析 Drosophila 幼虫趋光性

本方案描述了在果蝇（Drosophila...

建立用于心脏功能成像与光遗传学调控的 Drosophila melanogaster 模型

本方案介绍了一种高通量、低成本的方法，通过量化果蝇运动功能障碍来评估其神经毒性，作为传统哺乳动物模型的替代方案。该方法旨在利用一种灵敏、可重复且符合伦理要求的模型，评估药物化合物、环境因子或基因修饰的神经毒性效应。...

Drosophila melanogaster 运动功能障碍的行为学分析作为神经毒性的检测指标

了解黑腹果蝇光遗传学神经回路操作方法，使用CsChrimson和GtACR2工具精确调控神经元活性，研究温度趋避与味觉行为机制。该方案为神经科学决策研究提供可重复的技术框架。

用于光遗传学操控神经环路的行为学检测方法黑腹果蝇

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