用于光遗传学操控神经环路的行为学检测方法 黑腹果蝇

我们的研究利用光遗传学工具，探究黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）的神经回路如何调控行为，例如趋温性和妊娠过程。通过光控特定神经元，我们旨在高精度地理解这些神经回路如何驱动感觉反应并影响决策行为。光遗传学是神经科学领域的一项重要技术，能够利用光对神经活动实现精确控制。

在黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中，CsChrimson 和 GtACR2 等工具可实现对神经元的靶向激活与抑制。这些工具使研究人员能够操控神经回路、研究行为并高特异性地探究感觉反应。我们的实验方案为果蝇中的光遗传学操控提供了一种简单、经济且可重复的方法。

该方法使用市售材料，因此在资源有限的实验室和教室中均可开展。这些方法还具有高度的适应性，能够以最少的技术难题研究趋近和回避行为。首先，获取在加热细胞中表达 GtACR2 的雄性和雌性黑腹果蝇（Drosophila flies）。

将两块钢板分别放置在两个加热板上，使其边缘对齐。在钢板上方放置一张塑料文件保护膜，并用胶带固定以减少移动。然后，在塑料文件保护膜上放置一张白纸以降低背景噪声信号，并在白纸上方再覆盖一层透明塑料盖板。

然后在聚苯乙烯泡沫箱底部开一个孔，用于安装相机和蓝光灯，使其位于实验表面约12厘米上方。调整相机和蓝光灯的位置，以尽量减少反光，同时确保有效激活。将相机设置为以1秒间隔拍摄，采用窄视野，分辨率为4,000 × 3,000像素。

调节加热板的设置，使相应钢板的表面温度分别维持在 25 ± 1 °C 和 31 ± 1 °C。每次试验前后，使用表面温度探头监测钢板的温度。接着，将塑料盖放置在 25 °C 的钢板上。

现在，使用果蝇吸取器，轻轻将一只果蝇释放到盖板下方。将盒子置于实验区域上方，使下方光照变暗至低于10勒克斯，并让果蝇适应环境一分钟。适应期结束后，抬起盒子，并迅速调整塑料盖板，使盖板中心与钢板边界对齐。

启动实验，打开相机和20千勒克斯的蓝光。记录果蝇的活动持续两分钟。两分钟后，关闭相机和光源。

使用吸虫器处理果蝇。将表达CsChrimson的饥饿雄性和雌性果蝇（其甜味感受神经元中表达CsChrimson）置于冰上麻醉。在玻璃载片上涂抹7至10个小胶点。

将每只果蝇腹面朝上放置在胶点上，确保胸部和翅膀接触胶水以减少移动。将翅膀向两侧展开，以增加粘附表面积。在保湿盒中放入湿润的纸巾，并将载玻片放入盒内。

恢复两小时后，将载玻片置于显微镜下。使用注射器滴加一滴水以满足果蝇的水分需求，防止因口渴引发的喙伸展。手动持握红色激光笔，将红光照射到单只果蝇的喙部或头部，光照强度为700勒克斯。

在30秒的时间窗口内，通过显微镜观察Proboscis伸展反应。在测试光诱导的Proboscis伸展后，检查对4%蔗糖的反应。将一滴蔗糖溶液从注射器针头末端排出，并将其靠近果蝇的Proboscis。

首先，为实验组装果蝇迷宫。在黑暗或低光照条件下，将10只雄性和10只雌性表达CsChrimson的果蝇放入装载管中，并将其连接至滞留室。倾斜升降装置，并轻轻敲击管子，使果蝇进入滞留室。

将果蝇转移至滞留室后，使用升降装置将其降至加样管与测试管孔之间，随后移除加样管。将果蝇迷宫置于距离1,000毫安红色光源约13厘米处，但暂不打开光源。

降低升降装置，直至 holding chamber 与测试管孔对齐，使果蝇能够在用铝箔包裹的和未覆盖的测试管之间自由移动。同时，打开约 40 kilolux 的红光以激活 CsChrimson。让果蝇在暴露于红光的管子与遮光的管子之间选择一分钟。

一分钟后，升起加样管和测试管孔之间的升降架。从每根管中移出果蝇，计数并记录数量。

每次实验后使用蒸馏水清洁果蝇升降器和果蝇迷宫。在蓝光、光遗传学、趋热性、位置偏好实验中，对照条件下果蝇会避开31°C的一侧；而在补充ATR的蓝光照射下，果蝇对25°C与31°C之间无明显偏好，表明通过GtACR2激活抑制了HC神经元。在对照条件下，果蝇的喙伸展反应极微弱；而在补充ATR的红光照射下，果蝇出现显著的喙伸展反应，表明CsChrimson激活了感知甜味的神经元。

在红光、光遗传学果蝇迷宫实验中，对照组果蝇无明显偏好，而补充ATR后在红光激活下，果蝇会避开未遮盖的管道，表明CsChrimson激活了感知苦味的神经元。