Name: 使用流式细胞术识别受伤脊髓中的小胶质细胞和外周浸润巨噬细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-24T13:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: 了解如何使用优化的流式细胞术识别脊髓损伤中的小胶质细胞和外周浸润巨噬细胞。该方法可准确区分M1型和M2型细胞表型，为神经炎症研究提供可靠工具。

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本工作得到国家自然科学基金（编号：82072416）以及蚌埠医学院第一附属医院高水平科技创新团队基金（BYYFY2022TD001）的支持。

本研究经蚌埠医学院动物护理伦理委员会批准（编号：2020-050）。动物护理遵循中国科学技术部提供的相关规定。共购入并使用18只八周龄雌性C57/BL6小鼠。所用试剂与设备的详细信息列于下文 材料表.
1. 实验与动物准备
<ol>
	<li>手术前将小鼠饲养在通风的笼具中，维持12小时光照/12小时黑暗的昼夜循环，并提供自由摄食和饮水。环境温度保持在20–22 °C，相对湿度保持在30%–70%，适应环境至少一周。</li>
	<li>通过高压灭菌法对小鼠手术器械进行灭菌，并在使用前烘干。手术前半小时，对手术器械及动物手术室进行紫外线消毒。根据随机分组原则对小鼠进行分组并标记。记录并登记每只小鼠的体重，以备后续使用。</li>
	<li>采用氯胺酮（80 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）混合溶液，按照机构批准的方案通过腹腔注射对小鼠进行麻醉。剃除小鼠背部T8至T10椎骨区域的毛发。</li>
</ol>
2. SCI 小鼠模型的制备
<ol>
	<li>使用碘伏棉签从头部至尾部对T9为中心的手术区域进行消毒，随后用75%酒精棉签再次消毒。在T9处中央做1 cm长的皮肤切口。解剖T9周围1 cm范围内的筋膜、肌肉和韧带。
	<ol>
		<li>分离T9棘突旁的肌肉以暴露T9。使用眼科剪剪除T9与T10之间的椎板，充分暴露位于T9处的脊髓，其直径约为2 mm。 
		注意：抬起T9椎板时，确保剪刀不接触脊髓。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过夹住T7和T11的棘突固定脊柱。使用直径为1.3 mm、作用力为0.5 N的探针建立中度脊髓损伤（SCI）模型。观察脊髓损伤后小鼠尾巴向上卷曲及后肢抽搐的现象。假手术组小鼠仅行椎板切除术，不造成挫伤。</li>
	<li>在切口处彻底止血。使用无菌5-0外科缝线逐层缝合。肌肉对合时，用带齿Adson镊夹住深筋膜，用5-0可吸收单股缝线缝合肉膜层，进针时垂直于切口边缘2 mm处进针，形成对称的全层缝合（深度2–3 mm），针距3 mm。
	<ol>
		<li>打方结时控制张力，使筋膜层面解剖对齐。使用显微虹膜剪调整皮肤边缘，形成1 mm的表皮外翻。用钟表匠镊精确对合真皮层，并以间距2 mm的间断单纯5-0不可吸收缝线固定，确保均匀对合，皮下无死腔。</li>
		<li>用碘伏棉签从伤口中心向外单向擦拭缝合线进行消毒。用生理盐水浸湿的纱布轻轻蘸去残留血液，并沿切口涂抹一层薄的三联抗生素软膏。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>术后将小鼠置于温度和湿度适宜的笼内。每日早晚两次进行排尿护理，协助小鼠排尿，直至其恢复自主排尿功能。</li>
	<li>每日对每只小鼠皮下注射0.5 mL生理盐水和抗生素（庆大霉素，2000–2500 U/只），以预防感染。</li>
</ol>
3. 从小鼠 C57/BL6 中分离脊髓组织
<ol>
	<li>手术前对小鼠进行麻醉（步骤 1.3）。完全麻醉后，将小鼠仰卧位固定于手术台上。假手术组小鼠进行相同处理。</li>
	<li>在胸腔作一横向切口，位于胸骨下方并沿膈肌延伸，以暴露心脏。用止血钳轻轻固定心脏，并将灌注导管插入心尖处的左心室，推进至主动脉。
	<ol>
		<li>立即剪开右心耳，以每小时 250 mL 的速度开始灌注 10 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）。当从右心耳流出的液体由血性红色变为无色透明，或肝脏由红色转为白色时，视为灌注成功27。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在小鼠尾端横断脊柱，暴露椎管。使用眼科剪刀，仔细分离损伤部位上下各 0.5 cm 的脊髓组织。将分离出的脊髓组织置于无菌、无酶的培养皿中，培养皿内含 5% 染色缓冲液（Staining Buffer, SB），并在 4 °C 冰上保存，用于后续的胶体二氧化硅包被聚乙烯吡咯烷酮（PVP）密度梯度离心。
	 
	注：在损伤中心附近解剖脊髓时，应确保组织完整性，避免在损伤部位撕裂或损坏脊髓。5% 染色缓冲液（SB）由 2.5 mL 胎牛血清（FBS）和 47.5 mL 磷酸盐缓冲盐水（PBS）组成。</li>
</ol>
4. 使用聚乙烯吡咯烷酮包被的胶体二氧化硅进行密度梯度离心
<ol>
	<li>将脊髓组织置于300目细胞筛中，使用5 mL/10 mL一次性注射器的推杆研磨。研磨后，将细胞悬液经300目细胞筛过滤至15 mL离心管中，进行离心（5分钟，110 × g，室温）。
	<ol>
		<li>离心后，向细胞沉淀中加入1 mL胰蛋白酶细胞消化液，在37 °C细胞培养孵箱中孵育15分钟。加入1.5 mL胎牛血清终止消化，再次离心（110 × g，5分钟，室温）。用1 mL 5%染色缓冲液（SB）重悬细胞沉淀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>依次向15 mL离心管中加入4 mL 70%胶体二氧化硅包被的聚乙烯吡咯烷酮溶液、4 mL 30%胶体二氧化硅包被的聚乙烯吡咯烷酮溶液以及1 mL用5% SB重悬的细胞溶液。离心混合物（300 × g，30分钟，20 °C）。 
	注：胶体二氧化硅包被的聚乙烯吡咯烷酮分离试剂应配制为胶体二氧化硅包被的聚乙烯吡咯烷酮与10× PBS按9:1比例的混合液。使用1× PBS稀释70%胶体二氧化硅包被的聚乙烯吡咯烷酮溶液，使用DMEM或RPMI 1640细胞培养基稀释30%胶体二氧化硅包被的聚乙烯吡咯烷酮溶液。</li>
	<li>离心后，细胞将在离心管中形成分层（图1）。弃去8 mL刻度线以上的细胞碎片和血小板层。小心吸除剩余液体（至1.5 mL刻度线处），并弃去刻度线下方的沉淀。
	<ol>
		<li>将剩余液体转移至新的15 mL离心管中，加入1× PBS使总体积达到15 mL，进行离心（400 × g，5分钟，4 °C）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>弃去上清液，用5% SB重悬细胞沉淀。将溶液转移至流式细胞术（FCM）管中，洗涤并离心（110 × g，5分钟，4 °C）。在FCM管中用200 µL 5% SB重悬细胞沉淀。</li>
</ol>
5. FCM 染色
<ol>
	<li>将200 µL细胞悬液均分至两个新的流式细胞术检测管中。将其中一管标记为&#34;同型对照&#34;，另一管标记为&#34;特异性染色&#34;。</li>
	<li>染色步骤
	<ol>
		<li>向&#34;同型对照&#34;管中加入以下同型匹配的抗体：PE标记的大鼠IgG2b κ、FITC标记的大鼠IgG2b κ、APC标记的大鼠IgG2b κ，以及APC-eFluor 780标记的大鼠IgG2b κ。</li>
		<li>向&#34;特异性染色&#34;管中按推荐稀释比例加入以下荧光标记抗体组合：大鼠抗小鼠CD45 APC、大鼠抗小鼠CD11b PE、大鼠抗小鼠CD68 FITC&#160;和大鼠抗小鼠CCR7 APC-eFluor 780。</li>
		<li>将检测管在室温下避光孵育30分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>每次加入1 mL染色缓冲液（SB），对染色后的细胞洗涤两次。离心处理细胞（110 × g，5分钟，4 °C）。最后用2%多聚甲醛（PFA）固定细胞，用于流式细胞术分析。</li>
</ol>
6. 流式细胞术检测
注意：有关该实验步骤的详细信息，请参见先前的报告27,28。
<ol>
	<li>使用流式细胞仪及配套软件分析样本（参见 材料表).
	<ol>
		<li>首先，分析同型对照管以建立主图（横轴为前向散射光FSC，纵轴为侧向散射光SSC）。调节前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC）的电压，使细胞群位于适当范围内。</li>
		<li>设置另外两个图：一个以IgG-APC为横轴，IgG-PE为纵轴；另一个以IgG-FITC为横轴，IgG APC-Cy7（注意：该通道检测的是APC-eFluor 780）为纵轴。</li>
		<li>调节IgG-APC、IgG-PE、IgG-FITC和IgG APC-Cy7的荧光通道电压，使细胞群位于103 双阴性区域</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在使用同型对照管调整并优化FSC和SSC电压以及荧光通道电压后，应保持这些设置不变。随后进行抗体标记的实验管分析。
	<ol>
		<li>建立一个以 CD11b-PE 为 x 轴、SSC 为 y 轴的初级图。另设一个以 CD68-FITC 为 x 轴、CCR7 APC-Cy7 为 y 轴的图&#160;在 y 轴上。以同型对照管作为参考，设定基线值并界定 &#34;区域&#34; 用于 CD11b+ 细胞。在主图中，圈选 CD11b+ 细胞区域并将其定义为 &#34;P1 门控&#34;</li>
		<li>接下来，选择以 CD68-FITC 为横轴、CCR7 APC-Cy7 为纵轴的散点图&#160;在 y 轴上。右键单击并选择 显示群体，&#160;然后选取 P1。&#160;这将显示 CD11b 内的细胞群体+ 表达CD68的组+CCR7+ 或 CD68+CCR7-每份样本收集 50,000 个事件。</li>
		<li>获取数据后，根据需要调整荧光补偿。分析并确定CD11b阳性细胞的百分比。+ CD68+ CCR7+ （M1样）细胞和CD11b+ CD68+ CCR7- （M2样）细胞。阳性标记细胞的平均百分比以占总样本细胞群的百分比表示。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用同型对照管中已优化的电压参数，继续进行实验管的分析。
	<ol>
		<li>首先，建立以 CD45-APC 和 CD11b-PE 为参数的散点图，随后建立两幅分别以 CD68-FITC 和 CCR7 APC-Cy7 为参数的散点图。每份样本采集 50,000 个事件，数据获取完成后调整荧光补偿。</li>
		<li>在CD45/CD11b伪彩图中，分析 &#34;区域&#34; CD11b+ CD45−/低 和 CD11b+ CD45高 每个样本的细胞。然后分析CD68+ CCR7+ 细胞和CD68+ CCR7- 这两个区域内的细胞。</li>
		<li>整合分析结果，确定以下细胞群体的百分比：CD11b+ CD45−/低 CD68+ CCR7+ （M1样小胶质细胞），CD11b+ CD45−/低 CD68+ CCR7- （M2样小胶质细胞），CD11b+ CD45高 CD68+ CCR7+ （M1样巨噬细胞），CD11b+ CD45high CD68+ CCR7- （M2样巨噬细胞） 
		注：阳性标记细胞的平均百分比表示为占总样本群体的百分比。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 流式细胞术数据分析
<ol>
	<li>启动流式细胞术分析软件，将流式细胞术实验文件拖入软件中 &#34;所有样本&#34; 界面上的区域。流式细胞术实验将显示在下方 &#34;所有样本&#34; 在界面上，首先分析同型对照管，以确定阳性与阴性荧光信号之间的阈值。
	<ol>
		<li>双击 同型对照管 样本以打开一个图形窗口，显示二维点图。选择 FSC-A 对于 x轴 和 SSC-A 对于 y轴. 点击 矩形门 界面顶部的按钮，移除细胞碎片后，使用矩形工具选择区域（图2A).</li>
		<li>双击选定区域以生成新的图形窗口。选择 FITC x轴 直方图 y轴。单击 区域门控 单击界面顶部的按钮，在单参数直方图中设置门控，以确定阴性和阳性荧光信号之间的阈值。该区域门控将定义阳性区域（图2A). 
		注意：FSC 值较小的区域代表细胞碎片。</li>
		<li>针对实验中使用的四种荧光抗体，利用同型对照管样本确定阴性和阳性信号之间的阈值。在x轴上依次将荧光染料更改为PE、APC和APC-Cy7，同时保持y轴为直方图。</li>
		<li>使用 区域门控 使用单参数直方图工具设置门控，并确定四种荧光抗体各自的阴性与阳性信号之间的阈值图2A).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分析M1样和M2样细胞的比例：
	<ol>
		<li>双击 实验管样品 调出二维点图。选择 FSC-A 对于 x轴 和 SSC-A 对于 y轴. 点击 矩形门 界面顶部的按钮，使用矩形工具选择去除细胞碎片后的区域（图2B).</li>
		<li>双击选定区域以生成新的图形窗口。选择 CD11b-PE 对于 x轴 和 SSC-A 对于 y轴. 点击 矩形门 界面上方的按钮，并以同型对照设定的PE阳性/阴性阈值为参考，定义CD11b+ 门控（图2B).</li>
		<li>双击 CD11b+ 门控区域以生成新的图形窗口。选择 CD68-FITC 对于 x轴 和 CCR7 APC-Cy7 对于 y轴. 点击 交叉门 按钮。以同型对照设定的FITC和APC-Cy7阳性/阴性阈值为参考，使用十字门控对细胞进行分类，确定CD11b+ CD68+ CCR7+（M1样）细胞和CD11b+ CD68+ CCR7- （M2样）细胞（图2B). 
		注意：分析M1样巨噬细胞（M1-like Mø）、M2样巨噬细胞（M2-like Mø）、M1样小胶质细胞（M1-like MG）和M2样小胶质细胞（M2-like MG）比例的设门原则，与分析M1样和M2样细胞时所采用的原则一致。区分阳性与阴性荧光信号的阈值依据同型对照管设定，该对照管作为设门的参考标准。软件操作流程如图所示。 图2B，用于确定细胞比例的标记物表达谱在代表性结果部分有详细描述。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Durafourt, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+polarization+properties+of+human+adult+microglia+and+blood-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Comparison of polarization properties of human adult microglia and blood-derived macrophages.</a> Glia. 60 (5), 717-727 (2012).</li>
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<li>Guo, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nasal+delivery+of+Fasudil-modified+immune+cells+exhibits+therapeutic+potential+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22CNS+Neurosci+Ther%22%5BJournal%5D)">Nasal delivery of Fasudil-modified immune cells exhibits therapeutic potential in experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> CNS Neurosci Ther. 25 (6), 783-795 (2019).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

成功建立脊髓损伤（SCI）动物模型至关重要。SCI模型通过在T9节段对脊髓施加0.5 N的力来建立。动物模型成功的标志包括：小鼠尾巴卷曲、双侧后肢出现痉挛以及后肢瘫痪，导致小鼠在SCI后无法行走（见步骤2.3）。术后护理对小鼠的存活至关重要。需提供排尿护理，直至小鼠能够自主排尿。同时必须预防因感染引起的血尿。术后应防止小鼠后肢发生肿胀和感染，并采取措施防止小鼠啃咬其后肢，以避免致命后果（见步骤2.5）。
将脊髓组织研磨后离心获得的细胞沉淀用胰蛋白酶消化，以防止细胞黏附并获得单细胞悬液（见步骤4.1）。通过将70%聚乙烯吡咯烷酮包被的胶体二氧化硅溶液与30%聚乙烯吡咯烷酮包被的胶体二氧化硅溶液分层叠加形成密度梯度，确保各层之间无气泡，以维持密度梯度的连续性。将待分离的细胞悬液轻轻加至30%聚乙烯吡咯烷酮包被的胶体二氧化硅溶液上层，避免扰动梯度，防止破坏密度梯度的连续性。聚乙烯吡咯烷酮包被的胶体二氧化硅密度梯度离心体系由70%聚乙烯吡咯烷酮包被的胶体二氧化硅溶液、30%聚乙烯吡咯烷酮包被的胶体二氧化硅溶液以及制备好的细胞悬液组成，在20 °C条件下以300 × g离心...

脊髓损伤（SCI）是由多种原因导致脊髓组织受损所引起的一种疾病。SCI致残率高，目前尚无有效的治疗方法，已成为全球最严重的公共卫生问题之一1,2。SCI的病理生理过程复杂，可分为两个阶段：最初，机械性创伤会立即引发急性细胞功能障碍和细胞死亡；随后，继发性损伤会在数天、数周甚至数月内进一步导致细胞功能障碍和细胞死亡。在继发性损伤机制中，炎症已被证实是决定继发性损害严重程度的关键因素，最终影响细胞的存活与功能3。炎症反应的特征是炎性细胞浸润并激活于受损脊髓组织内，导致炎性细胞和炎性因子增多，形成炎症微环境，最终引起脊髓功能障碍4。
中枢神经系统（CNS）中的小胶质细胞和外周浸润的巨噬细胞在脊髓损伤（SCI）后的炎症反应中发挥关键作用5,6。作为CNS的常驻巨噬细胞，小胶质细胞占CNS细胞总数的5%–10%，对SCI后的恢复至关重要7,8。SCI后，小胶质细胞可吞噬并清除细胞碎片，介导修复性瘢痕的形成9,10。然而，小胶质细胞的过度活化可导致持续的炎症反应，并促进胶质瘢痕的形成，从而阻碍轴突再生11。SCI后，活化的小胶质细胞主要表现为两种表型：M1样和M2样12,13。M1样表型具有促炎特性，可促进炎症因子的合成，导致细胞凋亡和继发性损伤。M1样小胶质细胞还具有神经毒性作用，会加重损伤并促进神经元凋亡14,15。相比之下，M2样表型具有抗炎特性，可促进血管生成、再髓鞘化、轴突生长和组织修复16,17。M2样小胶质细胞在调节炎症和修复过程中发挥关键作用。
脊髓损伤（SCI）后，外周巨噬细胞通过受损的血-脊髓屏障和血管进入损伤部位17,18，进一步调控炎症反应、吞噬作用、瘢痕形成以及神经组织再生19,20。外周浸润的巨噬细胞可减轻脊髓损伤后的炎症反应，吞噬组织碎片21，促进神经再生和基质重塑。然而，由外周浸润巨噬细胞介导的持续性炎症反应可能导致继发性损伤，不利于长期恢复22,23。M1样外周浸润巨噬细胞具有较强的吞噬能力和抗原呈递能力，能够清除坏死细胞24。但其过度分泌促炎性细胞因子、活性氧（ROS）和活性氮（RNS），会损伤神经元和胶质细胞，导致更严重的神经元凋亡25。相反，M2样外周浸润巨噬细胞可抑制神经元凋亡，减轻脊髓损伤后的炎症反应，从而促进神经组织修复26。
脊髓损伤（SCI）后，活化的微胶质细胞与外周浸润的巨噬细胞在形态学和分子表达上具有相似性，因而难以区分。流式细胞术（FCM）是一种广泛应用的技术，可用于分析细胞表面及细胞内分子的表达，鉴定不同的细胞亚群，并同时评估单个细胞的多个参数。目前正致力于建立稳定的FCM检测方法，以区分活化的微胶质细胞与外周浸润的巨噬细胞，从而促进对二者在脊髓损伤中作用的研究。本文介绍了已建立的稳定检测方法。

<table><tbody><tr><td>1&amp;times;PBS</td><td>&amp;nbsp;Solarbio</td><td>P1020</td><td></td></tr><tr><td>10&amp;times;PBS</td><td>&amp;nbsp;Solarbio</td><td>P1022</td><td></td></tr><tr><td>18 只八周龄雌性 C57/BL6 小鼠&amp;nbsp;</td><td>中国常州 Cavens 实验动物有限公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>APC-eFluor 780 标记的大鼠抗小鼠 CCR7（IgG2b kappa）</td><td>Invitrogen</td><td>47-1971-82</td><td>0.25&amp;mu;g/次</td></tr><tr><td>APC-eFluor 780 标记的大鼠 IgG2b kappa&amp;nbsp;同型对照</td><td>Invitrogen</td><td>47-4321-82</td><td>0.25&amp;mu;g/次</td></tr><tr><td>APC 标记的大鼠抗小鼠 CD45（IgG2b kappa）</td><td>Invitrogen</td><td>17-0451-82</td><td>0.125&amp;mu;g/次</td></tr><tr><td>APC 标记的大鼠 IgG2b kappa&amp;nbsp;同型对照</td><td>Invitrogen</td><td>17-4031-82</td><td>0.125&amp;mu;g/次</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Lonsera</td><td>S711-001</td><td></td></tr><tr><td>FITC 标记的大鼠抗小鼠 CD68（IgG2b kappa）</td><td>Invitrogen</td><td>&amp;nbsp;MA5-16676</td><td>0.25&amp;mu;g/次</td></tr><tr><td>FITC 标记的大鼠 IgG2b kappa&amp;nbsp;同型对照</td><td>Invitrogen</td><td>11-4031-82</td><td>0.25&amp;mu;g/次</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>biosharp</td><td>23319084</td><td></td></tr><tr><td>PE 标记的大鼠抗小鼠 CD11b（IgG2b kappa）</td><td>Invitrogen</td><td>12-0112-81</td><td>0.25&amp;mu;g/次</td></tr><tr><td>PE 标记的大鼠 IgG2b kappa&amp;nbsp;同型对照</td><td>Invitrogen</td><td>12-4031-82</td><td>0.25&amp;mu;g/次</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>&amp;nbsp;Solarbio</td><td>P8370</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶溶液</td><td>biosharp</td><td>BL526A</td><td></td></tr></tbody></table>

利用流式细胞术鉴定损伤脊髓中的小胶质细胞和外周浸润巨噬细胞

Identifying Microglia and Peripheral Infiltrating Macrophages in the Injured Spinal Cords Using Flow Cytometry

在健康的脊髓中，外周浸润的巨噬细胞几乎无法检测到，而小胶质细胞（MG）通过吞噬作用、清除细胞碎片以及产生神经营养因子，参与维持脊髓微环境的稳定。脊髓损伤（SCI）后，MG被激活，外周免疫细胞浸润至受损脊髓组织。在这些免疫细胞中，活化的小胶质细胞和外周浸润的巨噬细胞（Mø）在SCI的病理过程中发挥关键作用。这些细胞可被区分为促炎型（M1样）和抗炎型（M2样）表型；然而，由于它们在形态学和许多细胞标志物上的相似性，区分二者具有挑战性。流式细胞术（FCM）是生物医学领域广泛使用的一种技术，可在单次实验中同时检测多种细胞参数，如细胞大小、颗粒度、细胞表面及胞内标志物。经过多年的科研探索，研究者尝试应用FCM鉴定脊髓中的MG和Mø，并不断优化该方法，最终建立了一种稳定的检测方案。该方法通过检测CD45、CD11b、CD68、CCR7等标志物的表达谱，实现对SCI后M1样MG、M2样MG、M1样Mø及M2样Mø的识别。在本方案中，CD11b+CD45−/lowCD68+CCR7+、CD11b+CD45−/lowCD68+CCR7-、CD11b+CD45highCD68+CCR7+和CD11b+CD45highCD68+CCR7-细胞可分别被鉴定为M1样MG、M2样MG、M1样Mø和M2样Mø。

利用聚乙烯吡咯烷酮包被的胶体二氧化硅密度梯度离心法分离脊髓组织中的免疫细胞。在离心过程中，细胞根据其浮力密度分布到不同层次，从而实现细胞分离（图1）。从上至下，分布依次为：细胞碎片、富含单核细胞的层、富含淋巴细胞的层，以及底部的红细胞和粒细胞层。
M1样和M2样细胞的流式细胞术（FCM）分析采用由CD68、CD45、CD11b和CCR7组成的细胞标志物表达谱29,30。表达CD11b+ CD68+ CCR7+的细胞被定义为M1样细胞，而CD11b+ CD68+ CCR7-细胞则被定义为M2样细胞。此外，CD11b+CD45−/lowCD68+CCR7+、CD11b<su...

在受损脊髓中区分小胶质细胞（MG）和外周浸润的巨噬细胞（Mø）具有挑战性。本方案中，采用流式细胞术（FCM）分别鉴定M1样MG、M2样MG、M1样Mø和M2样Mø。该技术也可应用于其他中枢神经系统疾病，以阐明MG和Mø的作用。

在健康的脊髓中，外周浸润的巨噬细胞几乎无法检测到，而小胶质细胞（MG）参与维持……的稳定性

本研究通过优化的流式细胞术鉴定脊髓损伤中的小胶质细胞和浸润性巨噬细胞，以明确其在神经炎症中的作用。流式细胞术和密度梯度离心是高特异性、高效率分离和表征中枢神经系统免疫细胞的关键技术。然而，形态学上相似的小胶质细胞与巨噬细胞的区分、分离过程中细胞损失的最小化，以及动态损伤微环境中较低的微特异性，仍是当前面临的主要挑战。现有方法难以可靠地区分常驻小胶质细胞与浸润性巨噬细胞。我们基于标志物的策略解决了脊髓损伤研究中的这一关键局限性。[Presenter] 首先，使用兼容的软件通过流式细胞仪分析同型对照管。调节前向散射和侧向散射电压，使细胞群位于适当范围内。设置另外两个图，一个以IgG APC为X轴、IgG PE为Y轴，另一个以IgG-FITC为X轴、IgG APC-Cy7为Y轴。然后调节IgG APC、IgG PE、IgG FITC和IgG APC-Cy7的荧光通道电压，使细胞群位于双阴性区域的10³范围内。使用同型对照管确认优化后的电压后，保留所有设置。接着分析抗体标记的实验管。建立一个以CD11b PE为X轴、侧向散射为Y轴的图。再设置另一个图，包含CD68 FITC和CCR7 APC-Cy7。以同型对照为参考，划定CD11b阳性区域，并将其定义为P1门。选择CD68 FITC和CCR7 APC-Cy7图，右键单击打开“显示群体”（Show Population），并将F4列分配给P1。数据采集完成后，根据需要调整荧光补偿。分析并记录CD11b CD68 CCR7阳性以及CD11b CD68阳性 CCR7阴性细胞群体的百分比。使用同型对照管确定的电压设置开始分析实验管。建立一个以CD45 APC和CD11b PE为坐标轴的图。然后设置两个包含CD68 FITC和CCR7 APC-Cy7的图。每份样本采集50,000个事件，并在数据收集后调整荧光补偿。在CD45与CD11b的伪彩色图中，识别并分析CD11b阳性、CD45低阴性以及CD11b阳性 CD45高表达的细胞区域。然后分析各区域内CD68阳性 CCR7阳性及CD68阳性 CCR7阴性细胞群体。整合所有分析结果，确定在所定义区域中M1样和M2样小胶质细胞及巨噬细胞的比例。启动流式细胞分析软件。将流式细胞实验文件拖入界面的“所有样本”（All Samples）区域。双击同型对照样本，打开二维点图。选择FSCA作为X轴，SSCA作为Y轴，点击矩形门控按钮，选择排除细胞碎片的区域。双击已圈选区域，打开新的直方图。然后选择FITC作为X轴，直方图作为Y轴。点击区域门控按钮，定义阴性和阳性荧光信号之间的阈值。对于四种荧光抗体中的每一种，均使用同型对照样本来确定阴性和阳性信号之间的阈值。依次将X轴荧光素更换为PE、APC和APC-Cy7，同时保持Y轴为直方图。在每个直方图中使用区域门控工具，最终确定用于区分四种抗体阴性和阳性荧光信号的门控。接下来，双击实验样本以打开点图。选择FSCA作为X轴，SSCA作为Y轴，点击矩形门控按钮，在去除碎片后对细胞群进行门控。双击已门控区域，打开一个新的点图。选择CD11b PE作为X轴，SSCA作为Y轴。点击矩形门控按钮，并使用来自同型对照的PE阈值定义CD11b阳性门。现在双击CD11b阳性区域以打开另一个点图，选择CD68 FITC作为X轴，CCR7 APC-Cy7作为Y轴。点击十字门控（crossgate）按钮，并使用由同型对照获得的FITC和APC-Cy7阈值，将细胞分类为M1样和M2样类型。在脊髓损伤（SCI）对照组中，CD45高表达 CD11b阳性 CD68阳性 CCR7阳性细胞的比例显著高于假手术组，而CRID3处理未改变该水平。在SCI对照组中，CD45低阴性 CD11b阳性 CD68阳性 CCR7阳性细胞的比例显著高于假手术组，且经CRID3处理后显著降低。在SCI对照组中，CD11b阳性 CD68阳性 CCR7阳性细胞的比例显著高于假手术组，且在CRID3处理后显著下降。CD11b阳性 CD68阳性 CCR7阴性细胞以及CD45低阴性 CD11b阳性 CD68阳性 CCR7阴性细胞的比例在两个SCI对照组中均显著低于假手术组，而在CRID3处理后升高。

identifying-microglia-peripheral-infiltrating-macrophages-injured

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

使用流式细胞术识别受伤脊髓中的小胶质细胞和外周浸润巨噬细胞

本文介绍了一种快速分离脑和脊髓组织中单个核细胞的高效方案，所获细胞可有效用于流式细胞术分析。...

使用Percoll梯度分离脑和脊髓单个核细胞

通过流式细胞术对受损或病变的中枢神经系统中的细胞炎症进行定量分析时，脂质/髓鞘碎片会带来复杂性，因为这些碎片的大小和颗粒度与细胞相似，从而降低检测的灵敏度和准确性。我们改进了一种细胞制备方法，可有效去除髓鞘碎片，提高流式细胞术在损伤脊髓中对细胞的检测能力。...

脊髓损伤组织中免疫细胞的流式细胞术定量评估：一种细胞纯化方法的创新应用

小胶质细胞是中枢神经系统的常驻巨噬细胞，承担着免疫防御和免疫监视的第一道防线。微小RNA（microRNA）是一类调控分子，在包括巨噬细胞的活化与分化在内的多种生理过程中发挥重要作用。本文介绍了在小胶质细胞中检测微小RNA的方法。...

在正常中枢神经系统及神经炎症期间通过实时PCR检测小胶质细胞中的微小RNA

脑卒中后脑内髓系细胞的表征可通过体视学结合光学分数器方法，或通过脑白细胞悬液的流式细胞分析来实现。这两种技术均有助于对缺血性脑组织中主要髓系细胞亚群进行准确的表型区分。...

短暂性或永久性脑缺血模型中白细胞亚群的体视学与流式细胞术表征

双光子活体成像可用于研究骨髓嵌合动物在脊髓背柱受到创伤性脊髓 crush...

活体成像观察小鼠背柱 crush 损伤后轴突与小胶质细胞及巨噬细胞的相互作用

本方案通过流式细胞术分析成年小鼠中枢神经系统中的巨噬细胞亚群，有助于研究这些细胞表达的多种标志物。...

通过流式细胞术分析中枢神经系统中的小胶质细胞和单核细胞来源的巨噬细胞

由于小鼠坐骨神经组织稀少，对其进行细胞成分的定量分析较为困难。本方案描述了一种组织消化与制备方法，可获得足够数量的细胞，用于对单只小鼠神经中的免疫细胞群体进行流式细胞术分析。...

利用流式细胞术分析单只小鼠单侧坐骨神经和背根神经节中的免疫细胞

本文介绍了一种利用柱状磁性激活细胞分选技术，在脱髓鞘疾病动物模型中分离和纯化原代小胶质细胞的实验方案。...

脱髓鞘动物模型中通过磁激活细胞分选法分离小鼠原代小胶质细胞

本文介绍了一种在轻度卒中模型中利用流式细胞术分析评估缺血性卒中后免疫细胞功能的实验方案。该方法可实现对神经免疫相互作用的详细研究，并可适用于其他神经退行性疾病的探索，从而加深我们对卒中病理过程中免疫应答机制的理解。...

微型中风小鼠模型中神经免疫相互作用的分离与流式细胞术评估

本方案结合流式细胞术和单细胞RNA测序技术，用于分离和表征出生后早期小鼠脑小脑中的小胶质细胞状态。该方法通过酶解消化、Percoll离心及免疫染色，揭示小胶质细胞的异质性，从而加深对其在小脑发育与疾病中作用的理解。...

流式细胞术与单细胞分析用于表征小鼠出生后早期脑发育过程中小胶质细胞的活化

了解如何使用优化的流式细胞术识别脊髓损伤中的小胶质细胞和外周浸润巨噬细胞。该方法可准确区分M1型和M2型细胞表型，为神经炎症研究提供可靠工具。

利用流式细胞术鉴定损伤脊髓中的小胶质细胞和外周浸润巨噬细胞

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