Cell-free 斑点印迹作为一种实用且适应性强的免疫测定平台，用于检测人和动物血清中的抗体反应

该协议展示了无细胞点血技术，这是一种为应对 COVID-19 大流行而开发的适应性强、可访问且价格合理的免疫测定平台。现有的金标准免疫测定方法包括 ELISA 技术和侧向层析测定的变体。人们对使用分裂报道的蛋白质、电化学界面和胶体纳米颗粒等技术开发新型免疫测定产生了浓厚的兴趣。

挑战在于，由于依赖昂贵且复杂的分子成分和设备，非集中社区无法获得大多数金标准免疫测定。这种新型 CFDB 免疫测定技术可以快速适应新出现的疫情。它使用基本的实验室设备，完全依赖于可以在内部和资源匮乏的环境中生产的分子成分。

首先，使用登录码 P0DTC9 从 UniProt 数据库中获取蛋白质序列。使用 IDT 代码优化工具优化基于 ecoli 的表达序列的代码。将优化序列插入表达构建体骨架的 SnapGene 模板中，然后订购用于商业合成的优化序列，作为单链 DNA 片段重新悬浮在水中。

通过在 PCR 管中向 ecoli BL21 无细胞反应中加入 10% PCR 产物，进行初始 5 μL 规模的表达测试。将反应物在 30 摄氏度下孵育 15 小时，不要摇晃。通过在 12%SDS 页面凝胶上加载 1 微升无细胞反应并将其转移到硝酸纤维素膜上进行蛋白质印迹来评估核衣壳蛋白或 NP 抗原的表达质量。

使用 15 纳摩尔纯化的线性表达模板产物组装 1 mL 规模的无细胞反应，用于无细胞斑点印迹测定将表达混合物在 15 mL 锥形管中，在 30 °C 下以 80 RPM 振荡孵育 15 小时。使用蛋白质印迹评估表达质量并分装 50 μL 表达混合物后，将等分试样储存在零下 20 摄氏度。使用如图所示的主网格图像，该图像具有 6 x 6 厘米的图案，其中包含 12 x 12 个圆圈，每个圆圈的直径为 2 毫米，旨在匹配 96 孔板的点样能力。

打印好主网格后，将打印好的网格牢固地夹在两层 PCR 板吊顶膜之间，沿网格外边界将三明治切割成一定大小。使用 2 毫米的活检打孔器，在网格上将每个标记的圆圈挖空。剪下一块 6.5 x 6.5 厘米的硝酸纤维素膜，将其放置在主网格下方的干净表面上，并使用胶带固定。

使用记号笔在硝酸纤维素膜上标记最外层的圆圈位置，以用作样品点样后切割膜的指南。在 PBS 中将血清样品稀释 1 至 10 倍。使用微量移液器，将每个样品的 0.4 微升体积一式三份分配到硝酸纤维素膜上预定的网格位置。

让有斑点的样品结合并在环境温度下干燥 10 分钟。使用镊子小心地取出硝酸纤维素膜并沿着标记的外圈切割。将膜转移到含有 10 毫升封闭溶液的 10 厘米培养皿中。

在室温下孵育 30 分钟，同时以 100 RPM 的速度轻轻摇晃。从冰箱中取出 50 微升等分试样的游离抗原表达混合物，解冻后，将其添加到 10 厘米培养皿中的 5 毫升封闭溶液中。将膜直接转移到这种含抗原的溶液中，并在室温下孵育 1 小时，以 100 RPM 振荡。

一小时后，在含有 0.05% Tween 20 的 TBST 中冲洗并洗涤膜。接下来，向膜中加入 10 毫升封闭缓冲液，每毫升含有 10 μg 纯化的 SpyCatcher、两个顶点、两个蛋白质，然后将膜放入含有 SpyCatcher 顶点的培养皿中。以 100 RPM 振荡孵育 1 小时：用 tris 缓冲盐水或 TBS 冲洗膜后，在 TBST 中洗涤两次，每次 5 分钟，然后在 TBS 中最后冲洗。

将一块封口膜粘贴并固定在印迹成像仪器附近干净的工作台面上。敲击膜并使用镊子去除多余的液体，将其放在封口膜的顶部。立即在膜顶部加入 3 mL 增强型化学发光或 ECL 溶液，并在室温下孵育 90 秒。

轻拍干燥膜后，将其转移到兼容化学发光的成像仪器中。使用仪器的图像分析功能获得斑点强度，包括硝酸纤维素膜上三个空白位置的点强度。保持每个点的测量体积恒定。

将数据导出到电子表格，确保正确标记每个点位置。计算一式三份光斑强度的平均值和标准差。从所有样品测量中减去硝酸纤维素膜背景。

然后，使用给定的方程获得解释正或负结果的截止值。最后，将截止减去的数据绘制成条形图。对预先表征的商业人 Sarah 进行无细胞斑点印迹测定，印迹图像以及相应的信号强度图表如图所示。

游离斑点印迹检测成功鉴定了所有阴性对照样品和大多数阳性样品。美国国家微生物实验室对游离斑点印迹法的独立测试正确识别了所有 12 个阴性和 12 个阳性患者样本，证实了其稳健性。无细胞斑点印迹测定还检测到 SARS-CoV-2 感染的仓鼠 Sarah 的抗体反应，在再次感染 5 天后收集的 24 份感染后样本中，有 18 份观察到阳性信号，而所有感染前样本均保持阴性。