Name: Cell-free 斑点印迹作为一种实用且适应性强的免疫测定平台，用于检测人和动物血清中的抗体反应 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-23T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: 学习无细胞斑点印迹技术，用于人和动物血清中的抗体检测。该方法成本低、适应性强，可在资源有限的环境中快速部署，适用于新发传染病的诊断需求。

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S.S. 和 R.Z. 的研究得到了美国国防高级研究计划局（Defense Advanced Research Projects Agency, DARPA）的资助，合同编号为 N66001-23-2-4042。文中表达的观点、意见和/或研究成果均为作者个人观点，不应被解释为代表美国国防部或美国政府的官方立场。本研究还获得了 K.P. 所获资金的支持，包括加拿大卫生研究院（CIHR）基金会资助项目（201610FDN-375469）、CIHR 加拿大研究主席计划（950-231075 和 950-233107）、多伦多大学“设计医学”计划（Medicine by Design Initiative），后者获得加拿大卓越研究基金（Canada First Research Excellence Fund）的资助，以及加拿大国防研究与发展部加拿大安全与安保计划（Canadian Safety and Security Program）向 K.P. 提供的资金支持（合同编号 39903-200137）。图 1 和 补充图 S1 使用 SnapGene Viewer 软件制作。

所有仓鼠实验均在加拿大公共卫生署的国家微生物实验室（NML）进行，实验经加拿大人类与动物健康科学中心批准，并遵循加拿大动物护理委员会的指导方针。所有人血清/血浆样本均通过商业途径获得用于内部检测，或由临床合作方提供给国家微生物实验室用于在该实验室进行独立检测。
1. 抗原线性表达模板（LETs）的设计与制备
<ol>
	<li>根据 Norouzi 等人的指导，设计针对目标抗原的无细胞表达 LETs7 并含有N端/C端SpyTag，如Norouzi等所述5. 
	注意：此处提供了SARS-CoV-2核衣壳蛋白（NP，氨基酸2-419）的制备细节。
	<ol>
		<li>确保SARS-CoV-2核衣壳蛋白（NP）的LET图1 和 补充文件 1包含5'和3' Ter位点，在T7启动子前和终止密码子后各有50个碱基对的缓冲序列。</li>
		<li>在NP蛋白的N端添加His标签6-SpyTag-TEV</li>
		<li>从 UniProt 数据库（登录号 P0DTC9）获取蛋白序列，并对其密码子进行优化 E. coli基于 IDT 密码子优化工具的表达8. 将该序列作为单链DNA片段进行商业合成，重悬于水中，浓度为10 ng/μLμL. 
		注意：TEV 蛋白酶切割位点和 His6 标签不是 LET 设计中的必要特征。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用通用引物 Ter FW（GGCTCCGAATAAGTATGTTGTAACTAAAGTGCGGCC）对DNA片段进行PCR扩增 
	ACGATGCGTCCGGCGTAGAGGATCG）和 Ter RV（CCGAGGCAATAAGTATGTTGTAACTAAAGTGCTCAG 
	CTTCCTTTCGGGCTTTGTTAGCAGCC）引物，使用高保真DNA聚合酶试剂盒（见 材料表)
	<ol>
		<li>设置一个 100 µL 反应如下： 75 µL 无核酸酶水 20 µL 5x DNA聚合酶缓冲液 2 µL 10 mM dNTPs（终浓度 200 µM), 0.5 µL 的 100 µM Ter-FW 引物， 0.5 µL 的 100 µM Ter-RV 引物， 1 µL 10 ng/µL 单链 LET， 1 µL(2U) DNA聚合酶</li>
		<li>使用以下PCR程序：初始变性在 98 °C 30 秒；35 个循环： 98 °C 6 秒 60 °C 15 秒 72 °C 90秒；保持 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用商品化的PCR纯化试剂盒纯化PCR产物，取样在1%琼脂糖凝胶上电泳检测其质量，并用紫外-可见分光光度计测定其浓度。 
	注意：粗制的PCR产物也可直接用于无细胞表达。然而，纯化步骤有助于实现更标准化的操作流程。</li>
</ol>
<img alt="SARS-CoV-2 NP基因示意图；包含T7启动子、x6His标签、SpyTag、TEV位点；1630 bp。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67973/67973fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：SARS-CoV-2-NP的线性表达模板。 该示意图展示了His-SpyTag-SARS-CoV-2 NP线性DNA模板的结构特征。图中已标注关键DNA模板元件。目标蛋白（此处为NP）的编码序列置于T7启动子的转录调控之下，以实现高效表达。在NP蛋白的N端，连接有SpyTag，可用于SpyCatcher2-Apex2检测试剂进行特异性检测。x6His标签和TEV蛋白酶切割位点虽为通用线性表达模板（LET）设计的一部分，但在无细胞点印迹（CFDB）应用中并非必需。在线性DNA模板的两端，分别包含“上游”和“下游”Ter位点，每个Ter位点前均有相应的50个碱基对的缓冲序列，用于通过Tus蛋白介导保护模板，防止无细胞裂解液中的核酸外切酶降解DNA。缩写：NP = 核衣壳蛋白；LET = 线性表达模板；TEV = 烟草蚀纹病毒；CFDB = 无细胞点印迹。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67973/67973fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
2. SpyCatcher2-Apex2 报告蛋白的纯化
<ol>
	<li>使用 Norouzi 等人5 构建的 pET24b-SpyCatcher2-Apex2 质粒（完整序列见补充文件 2，质粒图谱见补充图 S1）制备 SpyCatcher2-Apex2 报告蛋白。</li>
	<li>制备含有 50 μg/mL 卡那霉素的琼脂平板和溶菌肉汤（LB）。将 pET24b-SpyCatcher2-Apex2 质粒转化至大肠杆菌（E. coli）BL21 (DE3) 感受态细胞中。挑取单克隆接种于 15 mL 含卡那霉素的 LB 培养基中，于 37 °C、250 RPM 振荡培养过夜。</li>
	<li>次日，将 10 mL 菌液接种至 500 mL 新鲜的含 50 μg/mL 卡那霉素的 LB 培养基中，于 37 °C、250 RPM 振荡培养，直至菌液在 600 nm 处的光密度（OD）达到 0.6–0.8（约 3 小时）。</li>
	<li>加入 0.5 mM 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside）和 1 mM 盐酸5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinic acid hydrochloride）诱导 SpyCatcher2-Apex2 表达。将培养温度降至 30 °C，继续培养 4 小时。</li>
	<li>在 8,000 × g 条件下离心 15 分钟收集菌体。随后进行细胞裂解，或可将菌体沉淀于 -80 °C 保存备用。</li>
	<li>将菌体沉淀重悬于 20 mL 裂解缓冲液中，缓冲液含 50 mM Tris-HCl（pH 7.8）、300 mM NaCl、1 mg/mL 溶菌酶、无 EDTA 蛋白酶抑制剂片剂和 1 mM 二硫苏糖醇（DTT）。采用超声破碎法裂解细胞，设置为 50% 振幅，工作 5 秒，间歇 10 秒，累计工作时间 3 分钟。</li>
	<li>在 4 °C、20,000 × g 条件下离心 1 小时以澄清裂解液，将上清液通过 0.2 μm 注射器滤器过滤。</li>
	<li>向澄清后的裂解液中加入氯化血红素，使其终浓度为 250 μM，在 4 °C 下孵育过夜。随后进行蛋白纯化。 
	注：与氯化血红素孵育可最大程度促进血红素插入 Apex-2 过氧化物酶中，从而获得最佳酶活性。</li>
	<li>向澄清裂解液中加入 2.5 mL 镍柱树脂，在 4 °C 轻柔振荡孵育 45 分钟。将混合物上样至重力柱，用 50 mL 洗脱缓冲液（50 mM Tris-HCl（pH 7.8）、300 mM NaCl 和 1 mM DTT）洗涤树脂。</li>
	<li>用含 400 mM 咪唑的 Tris 缓冲液共 25 mL 洗脱 SpyCatcher2-Apex2 蛋白。使用离心过滤装置对洗脱液进行浓缩和缓冲液置换，目标终体积为 0.5–1.0 mL。</li>
	<li>利用 SpyCatcher2-Apex2 的摩尔消光系数（27,390 M-1 cm-1）在紫外-可见光分光光度计上测定蛋白浓度。加入甘油至终浓度为 40%，分装后于 -20 °C 保存。 
	注：本方案预计可获得约 40 mg 高纯度且具有活性的 SpyCatcher2-Apex2 蛋白，足以支持 400 次 CFDB 实验，适用于标准 96 样品印迹尺寸。</li>
	<li>在使用常规 Western 印迹9 检测 SpyTag 融合蛋白以及进行 CFDB 实验时，均应使用含 5% 脱脂奶粉的 TBST 缓冲液（1× Tris 缓冲盐水含 0.05% Tween-20）封闭膜。将 SpyCatcher2-Apex2 蛋白以终浓度 10 μg/mL 加入封闭液中使用。 
	注：SpyCatcher2-Apex2 报告系统需使用增强化学发光（ECL）溶液进行信号显影。ECL 溶液可商业购买或根据 Mruk 等人10 的方法自行配制。本实验所用 ECL 溶液终浓度为 0.4 mM p-香豆酸、2.5 mM 鲁米诺和 0.015% H2O2，溶于 100 mM Tris-HCl（pH 8.6）中。</li>
</ol>
3. 抗原的无细胞制备与质量检测
<ol>
	<li>按照 Levine 等11 和 Norouzi 等5 的说明，制备并组装 E. coli BL21 无细胞表达裂解液及反应组分。在最终反应体系中补充 5 μM Tus 蛋白和 1.2 μM T7 RNA 聚合酶，以下为一个典型的 100 μL 反应体系的配制方法：14.6 µL 溶液 A、14 µL 溶液 B、33.3 µL E. coli BL21 裂解液、2.5 µL 200 mM Tus 蛋白、1.2 µL 100 mM T7 RNA 聚合酶、1 µL 1.5 µM 线性 DNA 模板、33.4 µL 无核酸酶水。 
	注意：有关制备 E. coli BL21 无细胞裂解液的关键说明，请参见补充文件 3；有关溶液 A 和溶液 B 的详细配方，请参见补充表 S1。也可采用其他替代方案制备 E. coli 无细胞表达系统，或直接购买商业产品，但反应体系中必须补充 Tus 蛋白和 T7 RNA 聚合酶。</li>
	<li>在 PCR 管中，将 10%（v/v）的粗制 PCR 产物加入无细胞反应体系，进行初始的 5 μL 规模表达测试。在 30 °C 下静置孵育 15 小时。</li>
	<li>通过将 1 μL 无细胞反应产物上样至 12% 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE），检测 NP 抗原的表达质量，并按步骤 2.12 所述方法将其转移至硝酸纤维素膜进行 Western 印迹分析。使用 SpyCatcher2-Apex2 报告蛋白通过 SpyTag 对印迹进行标记，也可选择使用针对目标抗原的特异性商业抗体（如抗 SARS-CoV-2-NP 抗体）。</li>
	<li>组装 1 mL 规模的无细胞反应体系，加入 15 nM 纯化的 LET 产物，用于 CFDB 检测。将表达反应混合物置于 15 mL 锥形管中，在 30 °C、80 RPM 振荡条件下孵育 15 小时。通过 Western 印迹检测表达质量，并将 50 μL 分装样品储存于 -20 °C。</li>
</ol>
4. 血清样本
<ol>
	<li>通过商业渠道、临床合作方或内部采集方式，按照机构人类研究伦理委员会或动物护理与使用委员会的指南，采用标准操作程序获取人或动物的血清（或血浆）样本。确保已采取适当的样本预处理措施，以降低污染风险。 
	注意：预处理措施可能包括溶剂-去污剂处理、热灭活以及血液传播病毒标志物检测。有关从全血中分离血清和血浆的实用方案可参见文献12。与其他免疫检测平台类似，初次感染或疾病发作后早期（&lt;3周）采集的血清样本可能不含足够水平的抗体反应，其检测结果应谨慎解读。</li>
	<li>为验证SARS-CoV-2 NP CFDB试剂的质量，可使用英国国家生物标准与控制研究所（NIBSC）世界卫生组织（WHO）抗SARS-CoV-2免疫球蛋白国际参考品套装，其中包含1份新冠前样本和4份抗NP免疫球蛋白水平不同的SARS-CoV-2阳性样本13。或者，也可使用来自其他来源的已表征的健康人和阳性血清样本。</li>
	<li>进行CFDB实验时，可通过混合多个（&gt;3）健康人血清样本制备阴性对照样本，以提高检测准确性，并有助于结果的分析与解释。</li>
</ol>
5. 无细胞点印迹（CFDB）操作步骤
<ol>
	<li>下载并打印主网格图像文件（补充图 S2）。主网格为 6 × 6 cm 的图案，包含 12 × 12 个直径为 2 mm 的圆圈，其点样容量与 96 孔板相当。</li>
	<li>将网格牢固地夹在两层粘性 PCR 板封膜之间，并沿外侧网格边界裁剪至合适尺寸。使用 2 mm 活检打孔器对每个标记的圆圈进行打孔。 
	注意：使用 70% 乙醇擦拭后，该主网格可重复使用多次。</li>
	<li>裁剪一块 6.5 × 6.5 cm 的硝酸纤维素膜，将其置于清洁表面上的主网格下方，并用胶带固定，如 图 2 和 补充图 S3 所示。使用记号笔在硝酸纤维素膜上标记最外圈的位置，作为点样后裁剪膜的参考依据。</li>
	<li>将血清样本用 1× 磷酸盐缓冲液（pH 7.4）稀释至 1/10。使用微量移液器将每个样本的 0.4 μL 体积以三份重复点样至硝酸纤维素膜上预定的网格位置。每点点样时间约为 15 秒。 
	注意：每次检测均需包含阴性与阳性对照样本，以便后续结果分析。</li>
	<li>在室温下静置 10 分钟，使点样的样本充分结合并干燥。使用镊子小心取出硝酸纤维素膜，并沿标记的外圈进行裁剪。</li>
	<li>将膜置于盛有 10 mL 封闭液（含 5% 脱脂奶粉的 TBST）的 10 cm 培养皿中，在室温下轻轻振荡（100 RPM）封闭 30 分钟。</li>
	<li>解冻后，取 50 μL 无细胞抗原表达混合物加入 5 mL 封闭液中，置于 10 cm 培养皿内。直接将膜转移至该含抗原溶液中，在室温下振荡（100 RPM）孵育 1 小时。 
	注意：此为一抗检测步骤，若样本中含有相应抗体，SpyTag 标记的抗原将结合至膜上的相应点位。</li>
	<li>用 TBST 对膜进行一次漂洗，洗涤 5 分钟，再进行一次漂洗，随后进入二抗检测步骤。</li>
	<li>将膜置于含 10 μg/mL 纯化的 SpyCatcher2-Apex2 蛋白的 10 mL 封闭缓冲液中，在 100 RPM 振荡条件下孵育 1 小时。</li>
	<li>用 TBST 漂洗膜，并洗涤两次，每次 5 分钟，最后用 TBS 进行一次终末漂洗。</li>
	<li>在靠近印迹成像仪的清洁工作区贴附并固定一片 Parafilm。用镊子轻敲膜以去除多余液体，然后将膜放置于 Parafilm 上。</li>
	<li>立即在膜表面加入 3 mL（100 μL/cm2）ECL 溶液，在室温下精确孵育 90 秒。</li>
	<li>立即轻拍干燥膜，并转移至化学发光兼容的成像仪中进行结果可视化。 
	注意：最佳成像时间可能因仪器而异。建议使用仪器默认的自动采集时间设置；若无此功能，可使用已知特征的血清样本优化图像采集时间。</li>
	<li>使用仪器的图像分析功能获取各点的信号强度，包括硝酸纤维素膜上的三个空白（背景）位置；保持每个点的测量体积一致。将数据导出至电子表格，并准确标注每个点的位置。</li>
	<li>计算三份重复点信号强度的平均值和标准差（SD），然后从所有样本中减去硝酸纤维素膜的背景值。</li>
	<li>使用以下公式计算阴阳性结果判读的临界值： 
	（阴性对照平均值）+（3 × 阴性对照标准差）。若样本的平均信号强度高于临界值，则判为阳性；若低于临界值，则判为阴性。 
	​注意：图 3 提供了 CFDB 实验流程的示意图。</li>
</ol>
<img alt="NC膜上的主网格覆盖示意图；用于研究分析的组装过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67973/67973fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：CFDB组装示意图。 CFDB主网格与NC膜组装设置的示意图。主网格覆盖在NC膜上，为血清样本的点样和固定提供规则且可寻址的阵列模式。缩写：CFDB = 无细胞点印迹；NC = 硝酸纤维素膜。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67973/67973fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示抗体、抗原及蛋白质相互作用过程的硝酸纤维素膜检测示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67973/67973fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：CFDB工作流程的示意图。 在CFDB检测中，将少量（&lt;0.4 μL）10倍稀释的血清样本手动点样到预先切割的硝酸纤维素膜上（左图），形成离散且可定位的位置（中图）。每个位点重复点样三次，每点一个血清样本，并将包括血清中全部抗体库在内的蛋白质成分固定在固相NC基质上（中图中的米色位点）。在此示例中，血清样本中的抗NP抗体首先与CFDB一抗检测试剂SpyTag-NP结合，最终由CFDB二抗检测试剂SpyCatcher2-Apex2检测（右图——放大气泡图）。该图引自Norouzi等人的研究5。缩写：CFDB = 无细胞点印迹法；NP = 核衣壳蛋白；LET = 线性表达模板。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67973/67973fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

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</ol>

M.N. 和 K.P. 是无细胞点印迹法的共同发明人。与此工作相关的临时专利申请已提交（PCT/CA2024/050097，提交于2024年1月）。

新冠肺炎凸显了便捷且可靠的诊断技术在控制疫情暴发和优化全球卫生策略中的重要性。用于检测保护性抗体的血清学检测被证明对于追踪新变异株的传播模式、识别疫情热点、指导疫苗研发、对疑似病例进行分诊以及保护易感人群至关重要14。此次大流行也暴露了检测可及性方面的不平等问题，检测积压以及对配备复杂设备的检测设施的需求进一步加剧了这一问题15。因此，当前的重点是加强全球对今后疫情暴发的应对能力，这需要开发新的创新技术以降低检测门槛，并能够快速适应不可预测的威胁。
CFDB 是一种基于纸张的免疫测定方法，通过将患者样本固定在固相上，并使用液相中无细胞表达的抗原检测抗病毒抗体，从而简化了传统上由 ELISA 或侧向流动测定法进行的血清学检测5。该检测可在具备蛋白质印迹技术条件的基础实验室环境中进行。同时，CFDB 所需试剂可在基础研究条件下本地制备，并可快速替换，从而将该检测方法重新用于新病原体的检测。嵌合型 SpyCatcher2-Apex2 通用检测试剂...

新型冠状病毒肺炎（COVID-19）大流行暴露出对经济实惠、可大规模推广的诊断工具的迫切需求，尤其是在资源有限的地区1。传统的免疫检测方法，如酶联免疫吸附试验（ELISA），已被证明在检测免疫反应方面至关重要2,3。然而，由于其成本高昂、依赖复杂的试剂以及需要专用设备，这些方法的可及性受到限制，特别是在全球公共卫生危机期间。为应对这些挑战，我们开发了无细胞点印迹法（Cell-Free Dot Blot, CFDB），这是一种低成本、可灵活调整的免疫检测平台，旨在检测人和动物血清中的抗SARS-CoV-2抗体。
CFDB 利用无细胞合成生物学，通过线性 DNA 模板快速按需生产病毒抗原4,5。该方法无需传统的基于细胞的克隆、表达和纯化流程，显著加快了抗原生产速度并降低了成本。CFDB 方法采用点印迹（dot blot）格式简化抗体检测，将血清直接点样到硝酸纤维素膜上。该系统无需昂贵的多孔板和专用实验设备，孵育和洗涤步骤可通过简单的“浸入”操作完成。该平台还采用了 SpyCatcher-SpyTag 系统，其中 SpyCatcher2-Apex2 过氧化物酶嵌合体作为通用的二抗检测试剂5,6。该试剂通过标准的 Escherichia coli 表达系统生产，避免了对昂贵商用抗体偶联物的依赖。因此，CFDB 系统进行血清学检测的性能与 ELISA 相当，但成本显著降低——每 96 样本检测成本约为 3 美元，而商用 ELISA 试剂盒则超过 300 美元5。
为验证CFDB的有效性，我们测试了其检测已知特征的人类和动物血清中抗体的能力。我们的结果与ELISA在识别新冠病毒阳性与阴性样本方面高度一致。除了人类诊断外，我们还评估了CFDB在动物模型中的应用价值，检测了感染SARS-CoV-2的仓鼠以及接种重组核衣壳蛋白疫苗的仓鼠血清。这些实验验证了CFDB在人类和兽医诊断中的应用潜力，使其成为跨物种监测免疫反应的多功能工具。CFDB的一个关键优势在于其灵活性。通过简单修改编码目标抗原的DNA模板，该平台可快速适应以检测针对不同病原体的抗体，因此在应对未来大流行的准备中具有重要价值。其低成本、操作流程简便以及对基础设施要求极低的特点，使其特别适用于商业诊断资源有限的分散式实验室和资源匮乏的环境。
在本研究中，我们将提供制备和实施CFDB检测的逐步操作说明。首先，介绍用于无细胞生产抗原的线性DNA模板的设计与合成方法，这些抗原是该检测的主要检测试剂。接着，描述该检测的第二检测试剂SpyCatcher2-Apex2的制备步骤。随后，提供抗原本身的无细胞生产及其质量检测的操作指南。最后，详细说明在人或动物血清样本上进行CFDB检测的完整流程。

<table><tbody><tr><td>1 kb DNA 标准分子量标记</td><td>NEB</td><td>N3232</td><td>用作琼脂糖凝胶的大小标记</td></tr><tr><td>20 种氨基酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>LAA21-1KT</td><td>无细胞反应液 B 的组分</td></tr><tr><td>2 mm 活检打孔器&amp;nbsp;</td><td>Integra Miltex&amp;nbsp;</td><td>33-31-P/25</td><td>用于制备 CFDB 主网格</td></tr><tr><td>5-氨基乙酰丙酸盐酸盐&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3785</td><td>用于诱导 SpyCatcher2-Apex2 的血红素前体</td></tr><tr><td>琼脂糖粉末</td><td>BioShop</td><td>AGA002</td><td>用于 DNA 的电泳分析</td></tr><tr><td>抗 SARS-CoV-2 核衣壳蛋白抗体</td><td>Sinobiological</td><td>40588-T62</td><td>用于检测无细胞体系产生的 NP 抗原（WB）</td></tr><tr><td>Bio-Rad ChemiDoc&amp;nbsp; XRS+</td><td>Bio-Rad</td><td>N/A</td><td>凝胶成像仪</td></tr><tr><td>离心浓缩管</td><td>Cytiva</td><td>28-9323-60</td><td>用于蛋白质的浓缩和缓冲液置换</td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>EP022628257</td><td>用于收集细菌培养物</td></tr><tr><td>辅酶 A 钠盐水合物（CoA）&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3144</td><td>无细胞反应液 A 的组分</td></tr><tr><td>预染色蛋白标准品（宽范围）</td><td>NEB</td><td>P7719</td><td>用作 SDS-PAGE 凝胶的大小标记</td></tr><tr><td>新冠病毒血清样本组</td><td>RayBiotech</td><td>CoV-PosSet</td><td>经预先表征的血清，用于验证和优化 CFDB 试剂/条件</td></tr><tr><td>D-(&amp;minus;)-3-磷酸甘油酸二钠盐（3-PGA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8877</td><td>无细胞反应液 B 的组分</td></tr><tr><td>二硫苏糖醇（DTT）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10197777001</td><td>缓冲液组分</td></tr><tr><td>E. coli 5-alpha</td><td>NEB</td><td>C2987&amp;nbsp;</td><td>用于质粒制备</td></tr><tr><td>E. coli BL21&amp;nbsp;</td><td>NEB</td><td>C2530&amp;nbsp;</td><td>用于制备无细胞裂解液</td></tr><tr><td>E. coli BL21 (DE3)</td><td>NEB</td><td>C2527&amp;nbsp;</td><td>用于表达 SpyCatcher2-Apex2</td></tr><tr><td>不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂片剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11836153001</td><td>大肠杆菌裂解缓冲液的组分</td></tr><tr><td>Eppendorf&amp;nbsp;New Brunswick&amp;nbsp;Innova 43/43R 恒温摇床</td><td>Eppendorf</td><td>EPM1320</td><td>用于培养大肠杆菌以进行蛋白表达和无细胞裂解液制备的恒温培养设备</td></tr><tr><td>亚叶酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47612</td><td>无细胞反应液 A 的组分</td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012</td><td>SpyCatcher2-Apex2 储存缓冲液的组分</td></tr><tr><td>氯化血红素&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9039&amp;nbsp;</td><td>用于 SpyCatcher2-Apex2 的血红素补充</td></tr><tr><td>30% 过氧化氢</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009</td><td>用于配制 ECL 试剂</td></tr><tr><td>Image Lab 软件</td><td>Bio-Rad</td><td>1709690</td><td>ChemiDoc 凝胶成像仪&amp;nbsp;专用软件</td></tr><tr><td>异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷&amp;nbsp;</td><td>Bioshop</td><td>IPT001</td><td>用于诱导 SpyCatcher2-Apex2 表达</td></tr><tr><td>硫酸卡那霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60615</td><td>用于制备 SpyCatcher2-Apex2 细菌培养物</td></tr><tr><td>LB 琼脂</td><td>BioShop</td><td>LBL406</td><td>用于大肠杆菌生长</td></tr><tr><td>LB 肉汤</td><td>BioShop</td><td>LBL407</td><td>用于大肠杆菌生长</td></tr><tr><td>鲁米诺&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4685</td><td>用于配制 ECL 试剂</td></tr><tr><td>溶菌酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td>用于裂解细菌细胞</td></tr><tr><td>乙酸镁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5661</td><td>无细胞反应液 B 的组分</td></tr><tr><td>NEBExpress Ni 树脂&amp;nbsp;</td><td>NEB</td><td>S1428S</td><td>用于纯化 SpyCatcher2-Apex2</td></tr><tr><td>脱脂奶粉</td><td>Bioshop</td><td>SKI400</td><td>用于 WB 和 CFDB 膜的封闭</td></tr><tr><td>封口膜（Parafilm）</td><td>Bemis</td><td>2099-1337410</td><td>用于 CFDB 印迹的 ECL 孵育</td></tr><tr><td>对香豆酸&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9008</td><td>用于配制 ECL 试剂</td></tr><tr><td>pET24b-SpyCatcher2-Apex2 质粒</td><td>Pardee 实验室</td><td>N/A</td><td>用于表达 SpyCatcher2-Apex2 蛋白</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Fisherbrand</td><td>FB0875712</td><td>用于 WB 和 CFDB 膜孵育的容器&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>10% 磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>BioShop</td><td>PBS405</td><td>缓冲液组分</td></tr><tr><td>谷氨酸钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1501</td><td>无细胞反应液 B 的组分</td></tr><tr><td>草酸钾一水合物（草酸）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223425</td><td>无细胞反应液 A 的组分</td></tr><tr><td>预制 SDS-PAGE 凝胶</td><td>BioRad</td><td>4561036EDU</td><td>用于蛋白质的电泳分析</td></tr><tr><td>Q5 高保真 DNA 聚合酶&amp;nbsp;</td><td>NEB</td><td>M0491&amp;nbsp;</td><td>用于 LETs 的 PCR 扩增</td></tr><tr><td>QIAquick PCR 纯化试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td>用于纯化 LETs</td></tr><tr><td>核糖核苷酸溶液套装</td><td>NEB</td><td>N0450S</td><td>无细胞反应液 A 的组分</td></tr><tr><td>脱脂乳粉</td><td>BioShop</td><td>SKI400</td><td>用作 Western blot 和 CFDB 的封闭剂</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9625</td><td>蛋白纯化缓冲液的组分</td></tr><tr><td>超声破碎仪</td><td>Qsonica</td><td>Q500</td><td>用于裂解细菌细胞</td></tr><tr><td>亚精胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2626</td><td>无细胞反应液 A 的组分</td></tr><tr><td>注射器滤器</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLGSR33SS</td><td>用于缓冲液和溶液的除菌</td></tr><tr><td>PCR 仪</td><td>BioRad</td><td>T100</td><td>用于孵育 PCR 反应的仪器</td></tr><tr><td>转移 RNA（tRNA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8759</td><td>无细胞反应液 A 的组分</td></tr><tr><td>Tris 缓冲盐水</td><td>Thermo Scientific</td><td>J60764.K2</td><td>WB 和 CFDB 洗涤缓冲液的组分</td></tr><tr><td>Trizma 碱基</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>用于配制 Tris 缓冲液</td></tr><tr><td>Tunair SS-5012 半挡板摇瓶，2.5 L</td><td>Cole-Parmer</td><td>RK-01835-39</td><td>用于培养大肠杆菌以进行蛋白表达和无细胞裂解液制备的容器</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>BioShop</td><td>TWN510</td><td>WB 和 CFDB 洗涤缓冲液的组分</td></tr><tr><td>镊子</td><td>Almedic</td><td>7728-A10-100</td><td>用于操作 CFDB NC 膜</td></tr><tr><td>紫外-可见分光光度计</td><td>Thermo Scientific</td><td>13400518</td><td>用于测定核酸、DNA 浓度及细菌培养物的 OD 值</td></tr><tr><td>世界卫生组织抗 SARS-CoV-2 免疫球蛋白国际参考血清组</td><td>NISBC</td><td>20/268</td><td>经预先表征的血清，用于验证和优化 CFDB 试剂/条件</td></tr><tr><td>&amp;beta;-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水合物（NAD）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10127965001</td><td>无细胞反应液 A 的组分</td></tr></tbody></table>

无细胞点印迹法作为一种实用且可灵活调整的免疫检测平台，用于检测人和动物血清中的抗体反应

Cell-Free Dot Blot as a Practical and Adaptable Immunoassay Platform for the Detection of Antibody Response in Human and Animal Sera

过去二十年中全球一系列致病性疫情的暴发凸显了血清学监测策略的重要性。用于检测患者血清中疾病特异性抗体的免疫分析平台是血清学监测的核心。常见的例子包括酶联免疫吸附试验和侧向流动试验；然而，尽管这些方法是金标准，但它们需要病原体特异性的耗材和专用设备，限制了其在资源充足实验室之外的应用。
我们近期开发了一种名为无细胞点印迹法（Cell-Free Dot-Blot, CFDB）的新型免疫检测平台，并利用人和动物血清针对SARS-CoV-2对该方法进行了验证。与传统免疫检测不同，在CFDB中，患者血清样本被固定在固相（硝酸纤维素膜）上，而目标抗原则悬浮于检测的流动相中。为了提高血清学监测的可及性，CFDB抗原通过体外（in vitro）蛋白表达技术按需制备，且仅需低负担的基础设施。在此方法中，抗原与一段肽标签融合，可利用单一通用报告蛋白对任意CFDB检测进行识别。因此，CFDB无需依赖多孔板读数仪或商业化的纯化分子检测组分。基于上述设计，CFDB克服了现有免疫检测平台的局限性，使非中心化实验室更易获取检测能力，适应新发病原体的快速响应需求，并为低收入社区提供经济可行的解决方案。
本文将提供一份逐步操作方案，用于制备并实施CFDB免疫检测。以我们近期关于SARS-CoV-2 CFDB的研究为例，内容涵盖用于按需无细胞生产的抗原DNA设计、CFDB报告蛋白的制备、血清样本在固相上的固定，以及最终的抗原结合与检测步骤。我们预期，研究人员通过遵循本操作指南，可将CFDB检测技术应用于检测人和动物血清中针对任意特定病原体的免疫应答。

目的抗原线性表达模板的PCR扩增 
为PCR扩增SARS-CoV-2核衣壳蛋白（NP）线性表达模板（LET），使用如方案第1.2节所述的通用终止子（Ter）正向和反向引物，并取1 μL扩增产物在琼脂糖凝胶上进行检测（图4），随后进行PCR产物的纯化。
<img alt="凝胶电泳结果，DNA分离，条带阶梯，分子量（kb）" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67973/67973fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4：线性表达模板的PCR结果。1%琼脂糖凝胶电泳图显示：第1道：1 kb DNA Ladder；第2道：扩增得到的用于His-SpyTag-SARS-CoV-2...

我们介绍一种基于无细胞合成生物学原理和点印迹技术的新型免疫检测平台，可用于定制化检测人和动物血清中的抗体反应。

过去二十年间全球一系列致病性疫情的暴发凸显了血清学监测策略的重要性。免疫测定平台……

本方案展示了无细胞点印迹血液技术，这是一种为应对 COVID-19 大流行而开发的具有适应性、可及性和经济性的免疫检测平台。现有的免疫检测金标准方法包括 ELISA 技术及其变体和侧向流动检测。目前在开发新型免疫检测方面存在广泛兴趣，所用技术包括分裂报告蛋白、电化学界面和胶体纳米颗粒。挑战在于，大多数金标准免疫测定方法由于依赖昂贵且复杂的分子组分和设备，难以在非中心化社区中获得。这种新型的CFDB免疫测定技术可快速适应新发疫情，仅需使用基本的实验设备，并完全依赖可在内部以及资源有限的环境中自行生产的分子组分。首先，使用登录号 P0DTC9 从 UniProt 数据库中获取蛋白质序列。利用 IDT 密码子优化工具，针对大肠杆菌表达系统对该序列进行密码子优化。将优化后的序列插入 SnapGene 模板中用于表达载体的骨架，然后将优化序列作为单链 DNA 片段订购商业合成，并溶于水中。在PCR管中，通过向大肠杆菌BL21无细胞反应体系中加入10%的PCR产物，进行初始的5微升规模表达测试。在30°C条件下静置孵育反应体系15小时。取1微升无细胞反应产物上样至12% SDS-PAGE凝胶，通过蛋白质印迹法（Western blot）检测核衣壳蛋白（NP抗原）的表达质量，并将其转移至硝酸纤维素膜上。使用15纳摩尔纯化的线性表达模板产物，在1毫升规模下组装无细胞反应体系，用于无细胞点印迹检测。将表达混合物置于15毫升锥形管中，在30摄氏度下以80转/分钟振荡孵育15小时。通过蛋白质印迹法评估表达质量后，将50微升表达混合物分装，并于-20摄氏度保存。使用如图所示的主网格图像，其包含一个6厘米×6厘米的阵列，由12×12个直径为2毫米的圆圈组成，设计用于匹配96孔板的点样容量。打印主网格后，将印有网格的一面朝下，紧密夹在两层粘性PCR板封膜之间，并沿网格外缘裁剪至合适大小。使用2毫米活检打孔器，在网格上每个标记的圆圈处打孔。裁取一块6.5厘米×6.5厘米的硝酸纤维素膜，将其置于洁净表面的主网格下方，并用胶带固定。使用记号笔在硝酸纤维素膜上标记最外圈的位置，作为点样后裁剪膜的参考指引。用 PBS 将血清样本稀释至 1:10。使用微量移液器，将每份样本 0.4 微升的体积以三复孔形式点加到硝酸纤维素膜上预先确定的网格位置。将点样的样品在室温下孵育并干燥10分钟。使用镊子小心取出硝酸纤维素膜，并沿标记的外圈剪下。将膜转移至含有10毫升封闭液的10厘米培养皿中。在室温下轻轻振荡孵育30分钟，转速为100 RPM。从冷冻保存中取出50微升无细胞抗原表达混合物，待其解冻后，加入含有5毫升封闭液的10厘米培养皿中。将膜直接转移至该含抗原的溶液中，在室温下孵育1小时，同时以100 RPM振荡。一小时后，用含0.05% Tween 20的TBST缓冲液冲洗并洗涤膜。接着，向膜中加入10毫升封闭缓冲液，其中含有每毫升10微克纯化的SpyCatcher、apex、two protein，然后将膜放入含有SpyCatcher apex的培养皿中。在100 RPM振荡条件下孵育一小时。孵育后，用Tris缓冲盐水（TBS）冲洗膜，再用TBST洗涤两次，每次五分钟，最后用TBS进行一次终洗。在靠近印迹成像仪的洁净工作面上贴附并固定一块封口膜。用镊子夹取膜，轻拍去除多余液体后，将其放置在封口膜上。立即在膜上加入三毫升增强型化学发光液（ECL 溶液），于室温下准确孵育 90 秒。轻拍干燥膜后，将其转移至适用于化学发光成像的仪器中。使用仪器的图像分析功能获取各点的信号强度，包括硝酸纤维素膜上三个空白位置的信号强度。每个点的测量体积应保持恒定。将数据导出至电子表格，确保每个点样位置均正确标注。计算三份重复点样信号强度的平均值和标准差。从所有样品的测量值中减去硝酸纤维素膜的背景值。然后，使用给定的方程计算出用于判断结果为阳性或阴性的临界值。最后，将减去临界值后的数据绘制成柱状图。本图展示了对已知特征的商用人类Sarah进行的无细胞点印迹实验，包括印迹图像及其对应的信号强度图表。无细胞点印迹法成功鉴定了所有阴性对照样本和大多数阳性样本。在国家微生物实验室对该无细胞点印迹法进行的独立测试中，正确识别了全部12份阴性患者样本和12份阳性患者样本，证实了该方法的稳健性。无细胞点印迹法还检测到SARS-CoV-2感染的仓鼠Sarah体内的抗体反应，在再次感染后第五天采集的24份感染后样本中，有18份检测出阳性信号，而所有感染前样本均保持阴性。

cell-free-dot-blot-as-practical-adaptable-immunoassay-platform-for

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科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

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利用酶联免疫吸附测定法表征小鼠胸腺依赖性和非胸腺依赖性免疫球蛋白同种型应答

本文介绍了一种便捷的方法，可同时监测针对SARS-CoV-2感染或疫苗接种所引发的免疫反应中两种免疫球蛋白亚型（IgA、IgM或IgG）抗体滴度的动态变化。该“多重分析物新冠免疫反应检测组”采用基于编码微球的三种间接免疫测定法，使用具备“双通道”功能的流式多重读数仪进行检测。...

使用多指标免疫磁珠检测法对新冠血清转化进行动态监测

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通过双重共刺激的全血检测法用于抗原特异性分析宿主对真菌和病毒病原体的免疫应答

我们介绍一种经过验证的夹心ELISA检测方法，该方法使用新型抗HER2单克隆抗体，可实现对细胞结合型及释放型HER2蛋白的精确定量 体外...

经验证的免疫化学检测法用于全面测定细胞释放及细胞结合的人表皮生长因子受体2

学习无细胞斑点印迹技术，用于人和动物血清中的抗体检测。该方法成本低、适应性强，可在资源有限的环境中快速部署，适用于新发传染病的诊断需求。

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