分离、固定及通过流式细胞术表征幼年金头鲷头肾白细胞

本方案通过流式细胞术对欧洲 seabream 头肾中的白细胞进行标准化的分离、固定和活力评估，能够在不降低样品质量的前提下实现高通量样本处理。

在鱼类免疫学研究中，常用的传统技术包括使用血细胞计数板进行人工细胞计数以及染色血涂片。流式细胞术正逐渐普及，但其在鱼类研究中的应用仍有限。传统的鱼类免疫学方法劳动强度大，且容易产生误差。由于难以从幼年动物中获得纯净的白细胞，且需要立即评估细胞活性，限制了样本通量，因此针对幼年动物的研究受到制约。

该方案通过鉴定关键的白细胞群体并区分活细胞与死细胞，实现对免疫细胞的详细分析。固定处理可将细胞活性保存一个月，从而支持可扩展、灵活且高效的流式细胞术工作流程。

我们的研究通过揭示免疫机制及环境因素对细胞活力的影响，推动了鱼类免疫学的发展，有助于水产养殖中疾病管理策略的改进。

[旁白] 首先，将幼年黑鲷（Sparus aurata）置于循环水养殖系统中进行适应，该系统通过持续过滤和循环水体以维持稳定的环境。确保系统配备机械过滤、生物过滤、增氧装置和温度控制，以维持最佳的非生物参数。根据具体实验需求，调节光照周期、温度、盐度、pH值和溶解氧水平等环境因素。使用网具将幼年黑鲷轻柔地转移至盛有养殖缸水的临时暂养容器中。在处死鱼类后，将其一侧朝下放置于无菌解剖托盘上。用解剖刀从肛门向鳃部沿腹侧中线小心切开。使用解剖剪延长切口，暴露内部器官。找到头肾，其位于鳃后方、体腔前背侧区域，并沿脊柱下方顶部延伸。使用精细镊子和剪刀小心清除周围组织，以更清晰地暴露头肾。随后提起头肾，精确剪下其周围组织，将其从周围结构中分离。立即将切除的头肾置于置于无菌培养皿中的细胞筛网上。用移液器向无菌培养皿中加入2毫升Hanks平衡盐溶液（HBSS）。在细胞筛网上使用注射器活塞研磨切除的头肾，使细胞释放到溶液中。接下来，准备密度梯度介质溶液。用移液器将600微升密度梯度介质溶液加入5毫升聚苯乙烯圆底管中。缓慢将2毫升细胞悬液从培养皿转移至每根试管中。在4°C条件下以400×g离心45分钟，离心时关闭刹车。离心结束后取出试管，观察白细胞环。然后使用无菌巴斯德移液器轻柔转移约100微升白细胞环至2毫升微量离心管中。用HBSS补足体积至2毫升，并轻柔重悬细胞。在4°C条件下以400×g离心10分钟。离心后，小心弃去上清液，避免扰动管底沉淀。随后将纯化的沉淀重悬于1毫升HBSS中，使最终细胞浓度介于每毫升10,000至100万个细胞之间。向含有活性染料的小瓶中加入50微升二甲基亚砜。在将细胞密度调整至每毫升100万个细胞后，将1毫升细胞悬液转移至2毫升微量离心管中。按说明制备活力对照样品。通过将第3和第4管置于70°C水浴中7分钟，诱导细胞死亡。为染色细胞，向含有1毫升细胞悬液的第2和第4管中各加入1微升重构后的荧光染料，并充分混匀。将染色后的试管在室温下避光孵育30分钟。接下来，用1毫升HBSS洗涤细胞两次，并将最终沉淀重悬于900微升相同缓冲液中。然后加入100微升37%甲醛固定细胞，在室温下孵育15分钟。用含1% BSA的1毫升HBSS洗涤细胞两次后，重悬于1毫升相同溶液中。将样品置于4°C冰箱中保存，最长可保存一个月。将固定后的样品管放入流式细胞仪的样品进样口进行分析。在单细胞门控范围内，每份样品至少记录10,000个事件。保存所有数据，并备份至外部硬盘或云存储。通过绘制前向散射面积（FSC-A）对侧向散射面积（SSC-A）的图谱，可视化流式细胞术数据，以评估细胞大小和颗粒度。通过绘制前向散射面积（FSC-A）对前向散射高度（FSC-H）进行单细胞门控，排除多重体。根据前向散射与侧向散射的图谱特征，识别三种白细胞群体。在相应的荧光通道中设定活力染料染色的阈值，以区分活细胞与死细胞。在最佳条件下，淋巴细胞、单核细胞和粒细胞分别占白细胞群体的31%、38%和31%；而在热应激条件下，淋巴细胞比例下降至21.3%，单核细胞上升至45.6%，粒细胞保持稳定在33.1%。处于最佳条件下的样品表现出更高的细胞活力，所有白细胞群体中均以活细胞为主。相比之下，热应激样品显示出显著增加的细胞死亡率。