Name: 通过流式细胞术分离、固定和表征幼年 Gilthead 海鲷头肾白细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-09T14:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: 学习使用流式细胞术分离、固定和表征幼年金头鲷头肾白细胞的标准化方案，实现高通量样品处理并准确评估细胞活力。该方法为鱼类免疫学研究提供可靠技术支持。

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本工作由葡萄牙科学技术基金会（FCT I.P.）在 Aqua-CLIMADAPT 项目（PTDC/CTA-AMB/0592/2021，https://doi.org/10.54499/PTDC/CTA-AMB/0592/2021）框架下资助。我们感谢由应用分子生物科学单元（UCIBIO）和绿色化学研究单元——LAQV 联合实验室支持的 BioLab，上述单位由 FCT/MCTES 的国家资金资助（编号分别为 UIDB/04378/2020 和 UIDB/50006/2020），同时也感谢健康与生物经济联合实验室——i4HB（LA/P/0140/2020）的支持。本工作还得到了欧盟委员会通过 GLYCOTwinning 项目（资助协议编号 101079417）以及 FCT 通过 InnoGlyco 项目（2022.04607.PTDC）的资助。Isa Marmelo 还感谢 FCT I.P. 提供的博士生奖学金资助（2020.04413.BD，https://doi.org/10.54499/2020.04413.BD）。

<ol><li>Samaï, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedures+for+leukocytes+isolation+from+lymphoid+tissues+and+consequences+on+immune+endpoints+used+to+evaluate+fish+immune+status%3A+A+case+study+on+roach+%28Rutilus+rutilus%29%5BTitle%5D)+AND+%22Fish+Shellfish+Immunol%22%5BJournal%5D)">Procedures for leukocytes isolation from lymphoid tissues and consequences on immune endpoints used to evaluate fish immune status: A case study on roach (Rutilus rutilus).</a> Fish Shellfish Immunol. 74, 190-204 (2018).</li>
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<li>Lulijwa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+Chinook+salmon+%28Oncorhynchus+tshawytscha%29+blood+and+validation+of+flow+cytometry+cell+count+and+viability+assay+kit%5BTitle%5D)+AND+%22Fish+Shellfish+Immunol%22%5BJournal%5D)">Characterisation of Chinook salmon (Oncorhynchus tshawytscha) blood and validation of flow cytometry cell count and viability assay kit.</a> Fish Shellfish Immunol. 88, 179-188 (2019).</li>
<li>Uribe, C., Folch, H., Enriquez, R., Moran, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+and+adaptive+immunity+in+teleost+fish%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Med%22%5BJournal%5D)">Innate and adaptive immunity in teleost fish: a review.</a> Vet Med. 56 (10), 486-503 (2011).</li>
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<li>Witeska, M., Kondera, E., Ługowska, K., Bojarski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematological+methods+in+fish+-+Not+only+for+beginners%5BTitle%5D)+AND+%22Aquaculture%22%5BJournal%5D)">Hematological methods in fish - Not only for beginners.</a> Aquaculture. 547, 737498(2022).</li>
<li>Titus, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+a+flow+cytometry+method+to+examine+circulating+leukocyte+subpopulations+in+barramundi+%28Lates+calcarifer%29%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Immunol+Rep%22%5BJournal%5D)">Development and validation of a flow cytometry method to examine circulating leukocyte subpopulations in barramundi (Lates calcarifer).</a> Comp Immunol Rep. 6, 200142(2024).</li>
<li>Marmelo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eco-innovative+aquafeeds+biofortified+with+Asparagopsis+taxiformis+to+improve+the+resilience+of+farmed+white+seabream+%28Diplodus+sargus%29+to+marine+heatwave+events%5BTitle%5D)+AND+%22Heliyon%22%5BJournal%5D)">Eco-innovative aquafeeds biofortified with Asparagopsis taxiformis to improve the resilience of farmed white seabream (Diplodus sargus) to marine heatwave events.</a> Heliyon. 10 (15), e35135(2024).</li>
<li>Seibel, H., Baßmann, B., Rebl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+Will+Tell%3A+What+Hematological+Analyses+Can+Reveal+About+Fish+Welfare%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Vet+Sci%22%5BJournal%5D)">Blood Will Tell: What Hematological Analyses Can Reveal About Fish Welfare.</a> Front Vet Sci. 8, 616955(2021).</li>
<li>Franke, A., Beemelmanns, A., Miest, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+fish+immunocompetent+enough+to+face+climate+change%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Lett%22%5BJournal%5D)">Are fish immunocompetent enough to face climate change.</a> Biol Lett. 20 (2), 20230346(2024).</li>
<li>Fazio, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fish+hematology+analysis+as+an+important+tool+of+aquaculture%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Aquaculture%22%5BJournal%5D)">Fish hematology analysis as an important tool of aquaculture: A review.</a> Aquaculture. 500, 237-242 (2019).</li>
<li>Fazio, F., Saoca, C., Costa, G., Zumbo, A., Piccione, G., Parrino, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+and+automatic+blood+cell+analysis+in+striped+bass+Morone+saxatilis+%28Walbaum%2C+1792%29%3A+A+new+hematological+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Aquaculture%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry and automatic blood cell analysis in striped bass Morone saxatilis (Walbaum, 1792): A new hematological approach.</a> Aquaculture. 513, 734398(2019).</li>
<li>Lulijwa, R., Alfaro, A. C., Merien, F., Meyer, J., Young, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+salmonid+fish+immunology%3A+A+review+of+methods+and+techniques+for+lymphoid+tissue+and+peripheral+blood+leucocyte+isolation+and+application%5BTitle%5D)+AND+%22Fish+Shellfish+Immunol%22%5BJournal%5D)">Advances in salmonid fish immunology: A review of methods and techniques for lymphoid tissue and peripheral blood leucocyte isolation and application.</a> Fish Shellfish Immunol. 95, 44-80 (2019).</li>
<li>Esteban, M. Á, Muñoz, J., Meseguer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+cells+of+sea+bass+%28Dicentrarchus+labrax+l.%29.+Flow+cytometric+and+microscopic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Blood cells of sea bass (Dicentrarchus labrax l.). Flow cytometric and microscopic studies.</a> Anat Rec. 258 (1), 80-89 (2000).</li>
<li>Inoue, T., Moritomo, T., Tamura, Y., Mamiya, S., Fujino, H., Nakanishi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+fish+leucocyte+counting+and+partial+differentiation+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Fish+Shellfish+Immunol%22%5BJournal%5D)">A new method for fish leucocyte counting and partial differentiation by flow cytometry.</a> Fish Shellfish Immunol. 13 (5), 379-390 (2002).</li>
<li>Ye, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+competence+assessment+in+marine+medaka+%28Orzyias+melastigma%29-a+holistic+approach+for+immunotoxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Sci+Pollut+Res%22%5BJournal%5D)">Immune competence assessment in marine medaka (Orzyias melastigma)-a holistic approach for immunotoxicology.</a> Environ Sci Pollut Res. 24 (36), 27687-27701 (2017).</li>
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 <a target="_blank" href="https://www.bdbiosciences.com/en-us/products/software/flowjo-v10-software">https://www.bdbiosciences.com/en-us/products/software/flowjo-v10-software</a> (2023).</li>
<li>Mhalhel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+on+Gilthead+Seabream+%28Sparus+aurata%29+aquaculture%3A+Life+cycle%2C+growth%2C+aquaculture+practices+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mar+Sci+Eng%22%5BJournal%5D)">Review on Gilthead Seabream (Sparus aurata) aquaculture: Life cycle, growth, aquaculture practices and challenges.</a> J Mar Sci Eng. 11 (10), 2008(2023).</li>
<li>Toni, M., Manciocco, A., Angiulli, E., Alleva, E., Cioni, C., Malavasi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+Assessing+fish+welfare+in+research+and+aquaculture%2C+with+a+focus+on+European+directives%5BTitle%5D)+AND+%22Animal%22%5BJournal%5D)">Review: Assessing fish welfare in research and aquaculture, with a focus on European directives.</a> Animal. 13 (1), 161-170 (2018).</li>
<li>Kır, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+tolerance+and+standard+metabolic+rate+of+juvenile+gilthead+seabream+%28Sparus+aurata%29+acclimated+to+four+temperatures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Therm+Biol%22%5BJournal%5D)">Thermal tolerance and standard metabolic rate of juvenile gilthead seabream (Sparus aurata) acclimated to four temperatures.</a> J Therm Biol. 93, 102739(2020).</li>
<li>Esteban, M. Á, Meseguer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytic+defence+mechanism+in+sea+bass+%28Dicentrarchus+labrax+L.%29%3A+An+ultrastructural+study%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Phagocytic defence mechanism in sea bass (Dicentrarchus labrax L.): An ultrastructural study.</a> Anat Rec. 240 (4), 589-597 (1994).</li>
<li>Esteban, M. Á, Mulero, V., Muñoz, J., Meseguer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+aspects+of+assessing+phagocytosis+of+Vibrio+anguillarum+by+leucocytes+of+gilthead+seabream+%28Sparus+aurata+L.%29+by+flow+cytometry+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Methodological aspects of assessing phagocytosis of Vibrio anguillarum by leucocytes of gilthead seabream (Sparus aurata L.) by flow cytometry and electron microscopy.</a> Cell Tissue Res. 293 (1), 133-141 (1998).</li>
<li>Rodríguez, A., Esteban, M. Á, Meseguer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis+and+peroxidase+release+by+seabream+%28Sparus+aurata+L.%29+leucocytes+in+response+to+yeast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec+A+Discov+Mol+Cell+Evol+Biol%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis and peroxidase release by seabream (Sparus aurata L.) leucocytes in response to yeast cells.</a> Anat Rec A Discov Mol Cell Evol Biol. 272 (1), 415-423 (2002).</li>
<li>Hamoutene, D., Payne, J. F., Volkoff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+tebufenozide+on+some+aspects+of+lake+trout+%28Salvelinus+namaycush%29+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicol+Environ+Saf%22%5BJournal%5D)">Effects of tebufenozide on some aspects of lake trout (Salvelinus namaycush) immune response.</a> Ecotoxicol Environ Saf. 69 (2), 173-179 (2007).</li>
<li>Pierrard, M. -A., Roland, K., Kestemont, P., Dieu, M., Raes, M., Silvestre, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fish+peripheral+blood+mononuclear+cells+preparation+for+future+monitoring+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Fish peripheral blood mononuclear cells preparation for future monitoring applications.</a> Anal Biochem. 426 (2), 153-165 (2012).</li>
<li>Guardiola, F. A., Logothetis, P., Meseguer, J., Esteban, M. Á <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+silver+nanospheres+on+viability+and+innate+cellular+parameters+of+gilthead+seabream+%28Sparus+aurata+L.%29+head-kidney+leucocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Fish+Shellfish+Immunol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of silver nanospheres on viability and innate cellular parameters of gilthead seabream (Sparus aurata L.) head-kidney leucocytes.</a> Fish Shellfish Immunol. 69, 99-107 (2017).</li>
<li>Campos-Sánchez, J. C., Guardiola, F. A., Esteban, M. Á <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+effects+of+cantharidin+on+gilthead+seabream+%28Sparus+aurata%29+head-kidney+leucocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Fish+Shellfish+Immunol%22%5BJournal%5D)">In vitro effects of cantharidin on gilthead seabream (Sparus aurata) head-kidney leucocytes.</a> Fish Shellfish Immunol. 123, 20-35 (2022).</li>
<li>Korytář, T., Dang Thi, H., Takizawa, F., Köllner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multicolour+flow+cytometry+identifying+defined+leukocyte+subsets+of+rainbow+trout+%28Oncorhynchus+mykiss%29%5BTitle%5D)+AND+%22Fish+Shellfish+Immunol%22%5BJournal%5D)">A multicolour flow cytometry identifying defined leukocyte subsets of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss).</a> Fish Shellfish Immunol. 35 (6), 2017-2019 (2013).</li>
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作者声明不存在可能影响本研究、分析、数据解释、论文撰写或投稿发表决定的财务、个人或专业利益冲突。

本研究开发的方法代表了鱼类免疫学研究的重要进展，有望加深对鱼类免疫反应的理解，并促进海洋资源的可持续利用。S. aurata 是鲷科一种具有重要价值的海洋鱼类，因其生态和经济意义，以及在生理学、免疫学、毒理学和水产养殖等多个研究领域的实验室研究适用性，成为理想的模式生物20。使用 S. aurata 的主要优势之一是其在实验室中易于操作和饲养，且已有成熟的养殖方案，可确保实验条件的一致性和可重复性21。此外，该物种具有较强的环境适应能力（即对温度和盐度波动等多种环境条件具有高度耐受性），使其成为改进养殖技术及评估环境因素对海洋生物影响研究的理想对象22。由于 S. aurata 的免疫系统已得到充分表征，且基因组数据可及，因此有助于揭示鱼类免疫反应、病原体抗性、疫苗有效性及整体健康状况20。鉴于其在水产养殖业以及南欧人群饮食习惯中的重要地位，对该物种的研究可直接影响养殖实践，提高其产量和可持续性...

免疫在生物体的生理调节中起着核心作用，是抵御多种病原体和环境应激因素的主要防御机制1。与其他脊椎动物一样，鱼类拥有复杂、动态且协调的免疫系统，对其整体健康和生存至关重要1。
硬骨鱼类具有先天性和适应性免疫系统，二者协同作用以识别、应对并中和有害入侵者2。先天性免疫系统作为第一道防线，对病原体提供即时且非特异性的反应2，而适应性免疫系统则随着时间推移逐步发展，提供更特异的免疫应答，使鱼类能够识别特定病原体并建立免疫记忆3。鱼类的免疫系统依赖于特化的初级淋巴器官（即胸腺和头肾）以及次级淋巴器官（如脾脏和黏膜相关淋巴组织（MALT））来支持免疫防御并维持整体健康4。头肾是硬骨鱼类主要的造血器官，在免疫细胞（包括白细胞）的发育与成熟过程中发挥关键作用5。
近年来，在研究多种鱼类的免疫反应方面已取得显著进展2。其中一个关键研究领域是了解白细胞群体及其活性。白细胞也称为白血球，通常分为单核细胞、淋巴细胞和粒细胞，在鱼类的免疫防御中发挥着至关重要的作用。白细胞中含有吞噬细胞，负责吞噬并清除病原体，并释放杀菌性的活性氧物种，有助于消除入侵的微生物6。白细胞还参与炎症过程，在隔离和清除感染的同时促进组织修复6。白细胞群体的数量和活性是评估动物健康与疾病状态下免疫状况的重要指标7,8。
一些研究表明，压力因素（如不利的环境条件）可以改变红细胞的数量和形态以及循环白细胞的组成9,10。例如，Franke 等人（2024年）综述指出，在气候变化情景下研究鱼类免疫系统至关重要，因为环境应激源可能损害鱼类免疫力，增加患病易感性，并增强某些病原体的感染性，最终加速疾病进展11。此外，了解鱼类免疫不仅对推动基础生物学研究具有重要意义，也有助于支持社会多个领域，例如水产养殖业。随着全球水产养殖业持续扩张，保障养殖鱼类物种的健康与福利正变得日益重要。然而，鱼类福利仍是一个相对较新的研究领域，养殖鱼类的免疫反应仍需进行系统且标准化的评估。优先开展免疫反应研究至关重要，因为所获得的信息可通过有效且针对性的方法提高养殖动物的福利和抗逆能力，从而提升水产养殖的可持续性和生产效率。
白细胞的定量与鉴定通常采用血液学方法，例如使用Bürker、Neubauer或Thoma血细胞计数板进行人工计数，以及染色血涂片分析7,10。为了辅助观察和区分血细胞，常使用Wright、May-Grünwald-Giemsa和Hemacolor等染色试剂盒7,12。然而，这些人工细胞计数技术繁琐、耗时，且容易引入人为误差8,10。常见的误差来源包括血液混合或稀释不充分、染色问题以及血细胞计数板加样不当，这些因素均可能导致细胞计数结果不准确12。此外，人工血液学分析需要操作者具备较高的专业水平和丰富经验，以确保结果的可靠性和可重复性7。随着对精确高效诊断工具需求的不断增长，开发能够深入理解鱼类群体免疫状态的创新方法，已成为推动该领域发展的重要步骤。
流式细胞术已成为该领域的一项强大工具，可高通量、定量地分析白细胞群体和细胞活力8这项现代诊断技术能够以极高的精确度对混合群体中的单个细胞进行快速检测、计数和表征13此外，流式细胞术可对表型和功能特征进行同步多参数测量。尽管该技术已广泛应用于人类临床和兽医学领域，但在鱼类白细胞研究中的应用仍非常有限8. 尽管已针对不同鱼类物种开展了一些研究1,6,8,13,14,15,16,17，仍需解决若干关键挑战。其中一项主要挑战是在分析过程中必须获得从外周血或淋巴组织（如头肾）中提取的活体白细胞悬液1白细胞分离&#160;由于硬骨鱼类具有一个独特的特征——存在有核红细胞，因此常常难以进行分析。红细胞的意外污染会因其大小、卵圆形形态以及细胞核的存在而干扰白细胞的分析1因此，必须从白细胞悬液中去除红细胞，以获得高纯度的白细胞，并通过流式细胞术分析白细胞的表型和功能特性。在哺乳动物中，白细胞分离通常采用红细胞渗透性裂解法或利用Ficoll或Percoll进行密度梯度离心分离。1然而，由于海洋鱼类和淡水鱼类的红细胞具有细胞核，无法被有效裂解，因此渗透裂解法对这两类鱼类均无效1相反，密度梯度分离法更适用于鱼类，因其能有效维持细胞在长时间内的稳定性1尽管一些研究已成功从幼鱼中分离出白细胞，但大多数研究仍主要集中于成年群体17然而，生命早期阶段不仅更容易暴发疾病，而且个体体型更小，使得取样过程更加复杂和困难。另一个局限性在于，现有方法通常一次只能处理有限数量的样本或重复组，因为白细胞活性的评估需要立即进行样本处理。样本处理的延迟会不利地影响细胞活性，从而进一步增加取样过程的复杂性，并可能危及整个研究工作。
据我们所知，目前尚未有已发表的方法能够成功固定白细胞，以用于后续的流式细胞术活力分析。本研究具有开创性意义，建立了一种高效分离欧洲南部国家主要养殖鱼类——幼年大西洋鲷（Sparus aurata）头肾中白细胞的方法，该方法采用Percoll密度梯度离心技术。我们还提出了一种改进的基于染色的技术，可在通过流式细胞术鉴定主要白细胞群体（淋巴细胞、单核细胞和粒细胞）的同时，区分活细胞与死细胞。改进后的实验流程包含细胞固定步骤，使得细胞活力分析可在操作后长达一个月内进行。该流式细胞术方案的实施有望显著减少免疫评估通常所需的时间和工作量，因此对水产养殖领域的科研及实际应用均具有重要价值。该方法的应用优势在于可处理大量样本、保存细胞，并允许在后续时间点进行流式细胞术分析。因此，该方法有助于深入理解鱼类免疫机制，以及不同环境或实验条件对细胞活力的影响。此外，该细胞活力检测方法可与特定免疫细胞群体的多参数表型及功能特征分析相结合。这一综合策略能够更全面地分析多种免疫学参数，将其直接关联至相应的细胞类型，从而更清晰地揭示免疫应答机制。这些发现有望推动更有效策略的制定，包括改进水产养殖中的疾病管理方法。

<table><tbody><tr><td>气石</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>水产饲料&amp;nbsp;</td><td>SPAROS, Lda., Portugal</td><td>N/A</td><td>高品质饲料&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>自动细胞计数设备&amp;nbsp;</td><td>NanoEnteK, Korea</td><td>N/A</td><td>EVE自动细胞计数器（NanoEnteK）</td></tr><tr><td>自动水冷系统&amp;nbsp;</td><td>佛山市唯诺制冷设备有限公司，中国</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>生物球 1.5&quot; 水族池过滤器</td><td>TMC Iberia, Portugal</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>桶（3 L）</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>用于准备和实施安乐死&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>桶（5 L）</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>用于运输动物&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>细胞筛</td><td>Jetbiofil, 中国</td><td>CSS-013-100</td><td>细胞筛，100 &amp;mu;m 尼龙网，无菌，黄色</td></tr><tr><td>离心机</td><td>Fisher Scientific, Germany</td><td>N/A</td><td>accuSpin Micro 17 R</td></tr><tr><td>氨（NH₄⁺/NH₃）比色检测试剂盒</td><td>Tropic Marin, USA</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>硝酸盐（NO₃⁻）比色检测试剂盒</td><td>Tropic Marin, USA</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>亚硝酸盐（NO₂⁻）比色检测试剂盒</td><td>Tropic Marin, USA</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>计算机&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>用于获取和分析流式细胞仪所得数据</td></tr><tr><td>计算机化控制系统（Profilux）</td><td>GHL, Germany</td><td>N/A</td><td>ProfiLux 3 Outdoor</td></tr><tr><td>去离子水&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>用于清洁流式细胞仪</td></tr><tr><td>密度梯度介质：Percoll</td><td>Cytiva, Sigma-Aldrich, Germany</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>电子天平</td><td>KERN &amp;amp; Sohn GmbH, Germany</td><td>N/A</td><td>KERN EMS 300-3</td></tr><tr><td>70%乙醇</td><td>Millipore, Supelco, Portugal</td><td>EX0281</td><td>用于保持工作区清洁</td></tr><tr><td>EVE细胞计数载片&amp;nbsp;</td><td>NanoEnteK, Korea</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Falcon管（15 mL）</td><td>pluriSelect生命科学，德国</td><td>05-00002-01</td><td>无菌</td></tr><tr><td>滤袋&amp;nbsp;</td><td>TMC Iberia, Portugal</td><td>N/A</td><td>400微米</td></tr><tr><td>过滤海绵</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>流式细胞仪&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific, USA</td><td>N/A</td><td>Attune流式细胞仪</td></tr><tr><td>FlowJo v10.8.1 软件</td><td>BD Life Sciences</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>37%甲醛</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>8.18708</td><td></td></tr><tr><td>玻璃棉</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Hanks'平衡盐溶液&amp;nbsp;</td><td>Merck生命科学S.L, 葡萄牙</td><td>H6648</td><td>改良型，含碳酸氢钠，不含酚红、氯化钙和硫酸镁，液体，经无菌过滤，适用于细胞培养</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD可固定死细胞染色试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies Europe, Netherlands</td><td>L10119</td><td>近红外荧光反应性染料 + DMSO</td></tr><tr><td>主水泵</td><td>EHEIM, Germany</td><td></td><td>Universal 1200</td></tr><tr><td>微量离心管（2 mL）</td><td>BRAND, Merck, Germany</td><td>Z628034</td><td>无菌</td></tr><tr><td>移液器吸头&amp;nbsp;</td><td>Sartorius, Germany</td><td>790010, 790200, 791000</td><td>适用于Sartorius，1-10 &amp;micro;L, 2-20 &amp;micro;L, 20-200 &amp;micro;L, 100-1000 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>移液器</td><td>Sartorius, Germany</td><td>728020, 728030, 728060, 728070</td><td>Sartorius ProlinePlus 1-10 &amp;micro;L, 2-20 &amp;micro;L, 20-200 &amp;micro;L, 100-1000 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>小型细胞筛&amp;nbsp;</td><td>pluriSelect生命科学全球总部，德国</td><td>43-10100-50</td><td>PluriStrainer 100 &amp;micro;m 尼龙网，无菌</td></tr><tr><td>多参数测量仪&amp;nbsp;</td><td>WTW, Germany</td><td></td><td>Multi 3420 SET G + IDS数字电导池（TetraCon 925）+ 光学IDS溶氧传感器（FDO 925）+ IDS pH电极（SenTix 940）</td></tr><tr><td>巴斯德移液管（1 mL, 5 mL）</td><td>Humeau Expert du laboratoire, France</td><td>248295</td><td>无菌</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Sarstedt, Germany</td><td>82.1194.500</td><td>60 x 15 mm，聚苯乙烯，无菌</td></tr><tr><td>pH计</td><td>Hanna Instruments Inc., Romania</td><td></td><td>HANNA HI2211</td></tr><tr><td>聚苯乙烯圆底Falcon管（5 mL）</td><td>Fisher Scientific, Germany</td><td>14-959-2A</td><td>无菌</td></tr><tr><td>便携式精密温度计&amp;nbsp;</td><td>Ebro Electronic, Germany</td><td>N/A</td><td>TFX 430</td></tr><tr><td>蛋白质分离器</td><td>Mantis</td><td>N/A</td><td>Tornado 120</td></tr><tr><td>质控微球/性能测试微球</td><td>Thermofisher Scientific, USA</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>隔离箱&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>总容积为660 L的水箱</td></tr><tr><td>矩形玻璃水箱/水族箱</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>总容积为200 L的水箱</td></tr><tr><td>冰箱</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>用于在4 &amp;deg;C下储存样品</td></tr><tr><td>30 cm直尺</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>用于测量鱼的体长</td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Honeywell Fluka, Germany</td><td>31437</td><td>碳酸氢钠（NaHCO₃）</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>无菌解剖工具&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>（例如手术刀、剪刀、尖头镊子、解剖盘/板）</td></tr><tr><td>浸入式数字加热器&amp;nbsp;</td><td>TMC Iberia, Portugal</td><td></td><td>300 W，V2Therm数字加热器</td></tr><tr><td>1 mL注射器</td><td>IVFSTORE, USA</td><td>8300014579-MEA</td><td>无菌，HSW Soft-Ject注射器&amp;nbsp;用于研磨头肾</td></tr><tr><td>温度传感器</td><td>GHL, Germany</td><td></td><td>PT 1000</td></tr><tr><td>三卡因（MS-222）&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific, Germany</td><td>118000500</td><td>3-氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐，98%（C₁₀H₁₅NO₅S）</td></tr><tr><td>紫外线水体灭菌器&amp;nbsp;</td><td>EHEIM, Germany</td><td>5305010</td><td>ClearUVC-36</td></tr><tr><td>水浴锅&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific, Germany</td><td>N/A</td><td>Fisherbrand IsotempTM（货号 U01318）</td></tr><tr><td>防水灯具</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

分离、固定及通过流式细胞术表征幼年金头鲷头肾白细胞

Isolation, Fixation and Characterization of Juvenile Gilthead Seabream Head Kidney Leukocytes by Flow Cytometry

免疫对于生物体的生理调节至关重要，是抵御病原体和环境应激的主要防御机制。免疫细胞的分离与分析为了解机体对外界压力的免疫应答提供了关键见解。然而，对于诸如海洋鱼类等研究较少的物种，缺乏统一的实验方案常常导致技术和分析上的挑战，从而阻碍数据的解读以及对物种特异性免疫反应的深入理解。本研究旨在建立一种基于流式细胞术的优化分析流程，用于表征并测定幼年大西洋鲷（Sparus aurata）头肾（硬骨鱼类主要的造血器官）中白细胞的活力状态。该流程首先通过汉克斯平衡盐溶液（Hanks' balanced salt solution）进行组织匀浆以分离白细胞，随后采用优化的Percoll密度梯度离心法，确保获得高回收率的白细胞，并最大限度减少红细胞污染，从而满足后续高效流式细胞术分析的要求。此外，本研究应用了一种新型细胞活性染料技术（LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit），根据荧光染色模式区分活细胞与死细胞。细胞固定采用3.7%甲醛处理，以保持细胞形态、活性及染色效率。流式细胞术成功鉴定了三种主要的白细胞群体：淋巴细胞、单核细胞和粒细胞。该方法不仅可用于细胞活力检测，还可实现细胞类型的准确区分。流式细胞术方案的改进推动了鱼类免疫学的发展，提高了免疫细胞分析的准确性与效率。此外，由于该方案允许细胞固定后进行后续分析，显著减少了免疫评估所需的时间和工作量，因此在多个研究领域中均具有重要的科研与应用价值。

图6展示了代表性的流式细胞术数据，显示了从幼年金头鲷（Sparus aurata）头肾中分离的白细胞群体及其细胞活力，所用方法为本研究中描述的实验方案。该图比较了两个样本：一个是细胞活力较高的样本，其中鱼类处于最佳培养条件（图6A）；另一个是细胞活力较低的样本，其中细胞经历了热应激处理（图6B）。
在两个样本中，本方法均有效鉴定了三种主要的白细胞群体：淋巴细胞（LY）、单核细胞（MO）和粒细胞（GR）。这些群体根据细胞大小和复杂性的差异进行区分，该差异由前向散射（FSC-A）和侧向散射（SSC-A）图示出。前向散射（FSC-A）反映细胞的相对大小，而侧向散射（SSC-A）反映细胞内部的复杂性或颗粒度，从而实现各群体的清晰分离。在最佳条件下（<strong c...

本文描述了从黑鲷头肾中提取的白细胞的分离与固定方法，并通过流式细胞术评估其活力。本研究有助于实验方案的标准化，能够在不损害样品质量的前提下处理更多数量的样品，从而推动鱼类免疫学知识的进步。

免疫对于生物体的生理调节至关重要，是抵御病原体和环境应激因素的主要防御机制。

本方案通过流式细胞术对欧洲 seabream 头肾中的白细胞进行标准化的分离、固定和活力评估，能够在不降低样品质量的前提下实现高通量样本处理。在鱼类免疫学研究中，常用的传统技术包括使用血细胞计数板进行人工细胞计数以及染色血涂片。流式细胞术正逐渐普及，但其在鱼类研究中的应用仍有限。传统的鱼类免疫学方法劳动强度大，且容易产生误差。由于难以从幼年动物中获得纯净的白细胞，且需要立即评估细胞活性，限制了样本通量，因此针对幼年动物的研究受到制约。该方案通过鉴定关键的白细胞群体并区分活细胞与死细胞，实现对免疫细胞的详细分析。固定处理可将细胞活性保存一个月，从而支持可扩展、灵活且高效的流式细胞术工作流程。我们的研究通过揭示免疫机制及环境因素对细胞活力的影响，推动了鱼类免疫学的发展，有助于水产养殖中疾病管理策略的改进。[旁白] 首先，将幼年黑鲷（Sparus aurata）置于循环水养殖系统中进行适应，该系统通过持续过滤和循环水体以维持稳定的环境。确保系统配备机械过滤、生物过滤、增氧装置和温度控制，以维持最佳的非生物参数。根据具体实验需求，调节光照周期、温度、盐度、pH值和溶解氧水平等环境因素。使用网具将幼年黑鲷轻柔地转移至盛有养殖缸水的临时暂养容器中。在处死鱼类后，将其一侧朝下放置于无菌解剖托盘上。用解剖刀从肛门向鳃部沿腹侧中线小心切开。使用解剖剪延长切口，暴露内部器官。找到头肾，其位于鳃后方、体腔前背侧区域，并沿脊柱下方顶部延伸。使用精细镊子和剪刀小心清除周围组织，以更清晰地暴露头肾。随后提起头肾，精确剪下其周围组织，将其从周围结构中分离。立即将切除的头肾置于置于无菌培养皿中的细胞筛网上。用移液器向无菌培养皿中加入2毫升Hanks平衡盐溶液（HBSS）。在细胞筛网上使用注射器活塞研磨切除的头肾，使细胞释放到溶液中。接下来，准备密度梯度介质溶液。用移液器将600微升密度梯度介质溶液加入5毫升聚苯乙烯圆底管中。缓慢将2毫升细胞悬液从培养皿转移至每根试管中。在4°C条件下以400×g离心45分钟，离心时关闭刹车。离心结束后取出试管，观察白细胞环。然后使用无菌巴斯德移液器轻柔转移约100微升白细胞环至2毫升微量离心管中。用HBSS补足体积至2毫升，并轻柔重悬细胞。在4°C条件下以400×g离心10分钟。离心后，小心弃去上清液，避免扰动管底沉淀。随后将纯化的沉淀重悬于1毫升HBSS中，使最终细胞浓度介于每毫升10,000至100万个细胞之间。向含有活性染料的小瓶中加入50微升二甲基亚砜。在将细胞密度调整至每毫升100万个细胞后，将1毫升细胞悬液转移至2毫升微量离心管中。按说明制备活力对照样品。通过将第3和第4管置于70°C水浴中7分钟，诱导细胞死亡。为染色细胞，向含有1毫升细胞悬液的第2和第4管中各加入1微升重构后的荧光染料，并充分混匀。将染色后的试管在室温下避光孵育30分钟。接下来，用1毫升HBSS洗涤细胞两次，并将最终沉淀重悬于900微升相同缓冲液中。然后加入100微升37%甲醛固定细胞，在室温下孵育15分钟。用含1% BSA的1毫升HBSS洗涤细胞两次后，重悬于1毫升相同溶液中。将样品置于4°C冰箱中保存，最长可保存一个月。将固定后的样品管放入流式细胞仪的样品进样口进行分析。在单细胞门控范围内，每份样品至少记录10,000个事件。保存所有数据，并备份至外部硬盘或云存储。通过绘制前向散射面积（FSC-A）对侧向散射面积（SSC-A）的图谱，可视化流式细胞术数据，以评估细胞大小和颗粒度。通过绘制前向散射面积（FSC-A）对前向散射高度（FSC-H）进行单细胞门控，排除多重体。根据前向散射与侧向散射的图谱特征，识别三种白细胞群体。在相应的荧光通道中设定活力染料染色的阈值，以区分活细胞与死细胞。在最佳条件下，淋巴细胞、单核细胞和粒细胞分别占白细胞群体的31%、38%和31%；而在热应激条件下，淋巴细胞比例下降至21.3%，单核细胞上升至45.6%，粒细胞保持稳定在33.1%。处于最佳条件下的样品表现出更高的细胞活力，所有白细胞群体中均以活细胞为主。相比之下，热应激样品显示出显著增加的细胞死亡率。

isolation-fixation-characterization-juvenile-gilthead-seabream-head

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

通过流式细胞术分离、固定和表征幼年 Gilthead 海鲷头肾白细胞

介绍了一种从小鼠脑组织中快速获取浸润性白细胞的方法。该方法利用连续Percoll梯度和不连续Ficoll梯度，选择并纯化富含白细胞的组分层。分离得到的白细胞随后可通过流式细胞术进行表征分析。...

脑浸润性白细胞的分离

脑卒中后脑内髓系细胞的表征可通过体视学结合光学分数器方法，或通过脑白细胞悬液的流式细胞分析来实现。这两种技术均有助于对缺血性脑组织中主要髓系细胞亚群进行准确的表型区分。...

短暂性或永久性脑缺血模型中白细胞亚群的体视学与流式细胞术表征

炎症在缺血性脑卒中的发病机制中起着核心作用。越来越多的证据表明，炎症具有双重作用：一方面会加剧早期脑损伤，另一方面也参与后期的修复过程。本方案描述了从缺血脑组织中分离免疫细胞，并对其进行后续流式细胞术表型分析的方法。...

从小鼠缺血脑组织中分离免疫细胞及其流式细胞术分析

本方案描述了一种从斑马鱼胚胎中分离单个细胞、富集目标细胞、在基于微流控的单细胞多重系统中捕获斑马鱼细胞，以及检测单个细胞基因表达的方法。...

斑马鱼胚胎单细胞的分离与表征

数百万人患有导致不可逆失明的视网膜退行性疾病。这些疾病的一个共同特征是视网膜神经节细胞（RGCs）的丧失。本详细实验方案描述了通过流式细胞术结合阳性与阴性筛选方法分离原代小鼠RGCs的技术。...

通过流式细胞术分离原代小鼠视网膜神经节细胞（RGCs）

从 lck:eGFP 斑马鱼中分离恶性与非恶性B细胞

获得成纤维细胞的纯种群体对于研究其在伤口修复和纤维化中的作用至关重要。本文详细描述了一种从正常和损伤的小鼠心脏中分离成纤维细胞和肌成纤维细胞的方法，并通过免疫荧光、逆转录PCR（RTPCR）、荧光辅助细胞分选以及胶原凝胶收缩实验对细胞的纯度和功能特性进行表征。...

成年心脏成纤维细胞与肌成纤维细胞的分离与鉴定

病毒感染后，肾脏中含有相对大量的CD8+...

小鼠肾脏驻留型CD8+ T细胞的分离及其流式细胞术分析

这是一种从妊娠和非妊娠小鼠中分离子宫淋巴样细胞的方法。该方法可用于多种下游应用，如流式细胞术表型分析、细胞分选、功能检测、RNA测序和蛋白质组学。本方案展示了如何通过流式细胞术对子宫第一组天然淋巴细胞进行表型分析。...

子宫固有淋巴细胞的分离及其流式细胞术分析

为获得满足单细胞RNA测序（scRNA-seq）要求的小鼠脑皮层周细胞，我们提出了一种基于CD13⁺/CD31⁻筛选的 critically...

使用FACS从鼠脑皮层组织中分离周细胞用于单细胞测序

学习使用流式细胞术分离、固定和表征幼年金头鲷头肾白细胞的标准化方案，实现高通量样品处理并准确评估细胞活力。该方法为鱼类免疫学研究提供可靠技术支持。

分离、固定及通过流式细胞术表征幼年金头鲷头肾白细胞

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