Name: 离体胰岛治疗和细胞凋亡测量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-02T13:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: 了解离体胰岛治疗和细胞凋亡测量方法，利用多色荧光染色和共聚焦显微镜技术，在小鼠胰岛中研究细胞因子诱导的β细胞死亡机制，为1型糖尿病治疗提供新思路。

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以下基金为本工作提供了资助：NIDDK 资助项目 R01 DK137221，JDRF 3-SRA-2023-1367-S-B（授予 N.L.F.），以及 ADA 7-20-JDF-020（授予 N.L.F.）。作者感谢科罗拉多大学安舒茨医学校区糖尿病研究中心（P30-DK116073）及其相关核心设施对本研究提供的支持。

所有涉及小鼠的实验均经科罗拉多大学丹佛分校机构动物护理和使用委员会批准（方案编号 000929）。本实验所用的 C57Bl/6 小鼠购自杰克逊实验室，在温度受控的设施中饲养，光照/黑暗周期为 12 小时，可自由获取食物和水。ad libitum。小鼠胰岛的分离采用胶原酶消化法，该方法此前已有描述5,18。
1. 溶液与培养基的制备
注意：培养基、细胞因子储备液及其他试剂均应在无菌条件下配制。
<ol>
	<li>通过添加10%胎牛血清（FBS）、10,000 U/mL 青霉素和10,000 &#181;g/mL 链霉素加入 500 mL 1640 RPMI 培养基中。</li>
	<li>配制1×磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4。配制小鼠细胞因子混合物的1000×储存液，10 &#181;g/mL TNF-α&#945; 10&#181;g/mL, 5 &#181;g/mL IL-1&#946;，以及100 &#181;g/mL IFN-γ&#947; 在含有0.1%牛血清白蛋白（BSA）的无菌PBS中溶解，并将溶液分装于10 &#181;L 样品在 -20 &#176;C.</li>
	<li>准备46 &#181;M (50x) FDA 储存液于丙酮中，分装为 1 mL 等份，于 -20 ℃ 保存&#176;C. 在 PBS 中配制 1.434 mM（50 倍）PI 储存液，分装为每份 1 mL，于 4 ℃ 保存 &#176;C.</li>
	<li>配制 500 mL 含有 125 mM NaCl、5.7 mM KCl、2.5 mM CaCl₂ 的碳酸氢盐改良克雷布斯-亨塞莱特-HEPES（BMHH）缓冲液2，1.2 mM MgCl2，以及在500 mL去离子水中加入10 mM HEPES2O. 调节pH至7.4。</li>
	<li>用 10 mM HEPES、140 mM NaCl 和 2.5 mM CaCl₂ 配制 100 mL Annexin-V 结合缓冲液2 在 100 mL 的 dH₂O 中2O. 将pH值调整至7.4。</li>
	<li>配制1 mM Zn2+ DMSO 中的指示剂储备液，并在 10 保存 &#181;L 样品在 -20 &#176;C. 
	注意：荧光染料对光敏感，因此储存和孵育过程必须避光。</li>
</ol>
2. 使用细胞因子处理分离的胰岛
<ol>
	<li>使用10 µL微量移液器将小鼠胰岛分离至培养基中，并在37 °C、5% CO2条件下过夜培养，以使胰岛从分离应激中恢复，随后进行细胞因子处理。</li>
	<li>向35 mm未经组织培养处理的培养皿中加入2 mL无菌胰岛培养基，并正确标记，以区分经细胞因子处理和未经细胞因子处理的培养皿。</li>
	<li>对于细胞因子处理组，移除6 µL培养基，加入2 µL来自储备液的每种细胞因子，使最终相对细胞因子浓度为10 ng/mL TNF-α、5 ng/mL IL-1β和100 ng/mL IFN-γ（1x RCC）。 
	注意：可通过将储备液分别用含0.1% BSA的无菌PBS按1:1和1:9稀释，制备0.5x和0.1x的较低RCC。</li>
	<li>在分离后12 h至24 h内，在光学显微镜下使用微量移液器挑取10–20个胰岛，转移至培养皿中，并在湿润、37 °C、5% CO2的培养箱中孵育24 h。 
	注意：孵育时间可根据具体实验目的进行调整。</li>
</ol>
3. 使用FDA/PI检测胰岛细胞活力
<ol>
	<li>将 FDA 和 PI 储存液各 20 µL 加入含 0.1% BSA 的 960 µL BMHH 缓冲液中，使荧光染料的终浓度分别为 0.46 µM 和 14.34 µM。</li>
	<li>取 100 µL 染色液分装至 7 mm 玻璃底、非组织培养处理的培养皿中。</li>
	<li>在细胞因子孵育 24 小时后，小心地将每组处理中的至少 6 个胰岛转移至玻璃底培养皿中。室温避光孵育 5 - 10 分钟（用铝箔覆盖）。</li>
	<li>使用 40 倍水浸物镜的荧光显微镜成像，并在 FDA/PI 染色后 15 分钟内完成图像采集。</li>
	<li>分别使用 488 nm 和 514 nm 激光激发，检测 FDA（发射波长 520 nm）和 PI（发射波长 620 nm）的荧光信号。</li>
	<li>以 z 轴堆栈方式对胰岛成像，共采集三层图像，每层间隔 10 µm。仅对胰岛底部的下 ⅓ 至 ½ 区域成像，以减少因胰岛内部光散射导致的信号损失。</li>
	<li>使用 ImageJ（NIH）软件手动计数每只小鼠至少 5 个胰岛中的活细胞（绿色，FDA 阳性）和死细胞（红色，PI 阳性）。按以下公式计算细胞死亡百分比： 
	胰岛死亡百分比 = 死亡细胞数 /（死亡细胞数 + 活细胞数）× 100%</li>
</ol>
4. 利用染色法检测细胞凋亡
<ol>
	<li>将 8 µL YOPRO-1（1 mM 溶液）加入 992 µL BMHH 成像缓冲液中，终浓度为 0.8 µM。</li>
	<li>将 500 µL 染色液分装至一个 14 mm 玻璃底非组织培养处理的培养皿中。</li>
	<li>在细胞因子孵育 24 小时后，小心地将每组处理中的至少 6 个胰岛转移至玻璃底培养皿中，并在 37 °C 避光条件下孵育 1 小时（用铝箔覆盖）。</li>
	<li>在孵育 20 分钟后，向每个玻璃底培养皿中加入一滴 NucBlue（核染料，20 µL），继续孵育。YOPRO-1 总孵育时间为 1 小时，核染料总孵育时间为 40 分钟。</li>
	<li>孵育 1 小时后，将胰岛转移至含有 0.1% BSA 的新鲜 BMHH 成像缓冲液（100 µL）中，置于 7 mm 玻璃底非组织培养处理的培养皿中。</li>
	<li>使用配备 40x 水浸物镜的荧光显微镜进行成像。采用 405 nm 和 488 nm 激光激发，分别检测核染料（460 nm）和 YOPRO-1（509 nm）的荧光发射信号。</li>
	<li>以 z 轴堆叠方式对胰岛成像，共采集三层图像，层间间隔 10 µm。仅对胰岛底部的下 ⅓ 至 ½ 区域成像，以减少因胰岛内部光散射导致的信号损失。</li>
	<li>在 ImageJ（NIH）软件中手动计数至少每只小鼠 5 个胰岛中的活细胞（核染料阳性，蓝色）和凋亡细胞（YOPRO-1 阳性，绿色）。按以下公式计算胰岛细胞凋亡百分比： 
	胰岛细胞凋亡百分比 = 凋亡细胞数 /（凋亡细胞数 + 活细胞数）× 100%</li>
</ol>
5. 使用Annexin V/核染色法检测细胞凋亡
<ol>
	<li>向 1 mL Annexin 结合缓冲液中加入 2 滴核染料（40 µL）。取 100 µL 该溶液加入到 7 mm 玻璃底、非组织培养处理的培养皿中。</li>
	<li>在细胞因子孵育 24 小时后，使用 10 µL 微量移液器在 PBS 中轻轻吹打至少 6 个来自每组处理的胰岛，重复 3 次进行清洗。将胰岛转移至含有核染料溶液的玻璃底培养皿中，并在 37 °C 避光条件下孵育 40 分钟（用铝箔覆盖）。</li>
	<li>在孵育 25 分钟后，向每个玻璃底培养皿中加入 5 µL Annexin V Alexa Fluor 488 偶联物，继续孵育。核染料总孵育时间为 40 分钟，Annexin V 孵育时间为 15 分钟。</li>
	<li>孵育 40 分钟后，将胰岛转移至新的 BMHH 成像缓冲液（不含 Annexin V 或核染料）中，置于 7 mm 玻璃底培养皿内。</li>
	<li>使用荧光显微镜配合 40 倍水浸物镜进行成像。采用 405 nm 和 488 nm 激光激发，分别检测核染料（460 nm）和 Annexin V 偶联物（515 nm）的荧光发射信号。</li>
	<li>以 z 轴堆栈方式对胰岛成像，共采集三层图像，层间间隔 10 µm。仅对胰岛底部的下 ⅓ 至 ½ 区域成像，以减少因胰岛内部光散射导致的信号损失。</li>
	<li>使用 ImageJ（NIH）软件手动计数至少每只小鼠 5 个胰岛中的活细胞（核染料阳性，蓝色）和凋亡细胞（Annexin V 阳性，绿色）数量（n = 3）。按以下公式计算胰岛细胞凋亡百分比： 
	凋亡细胞百分比 = 凋亡细胞数 /（凋亡细胞数 + 活细胞数）× 100%</li>
</ol>
6. 使用 Zn2+ 选择性指示剂/核染色/PI 测量 β 细胞死亡
<ol>
	<li>加入2 &#181;Zn的L2+ 选择性指示剂AM储备液至998 &#181;L BMHH 成像缓冲液，使终浓度为 0.2 &#181;M. 分装 500 &#181;将染色液 L 加入直径为 14 mm 的玻璃底非组织培养处理的培养皿中。</li>
	<li>在细胞因子孵育24小时后，小心地将每种处理组至少6个胰岛转移至玻璃底培养皿中，在37℃下孵育1小时。 &#176;在避光条件下与 Zn2+ 选择性指示剂AM溶液（用锡箔覆盖）。</li>
	<li>孵育20分钟后，加入一滴核染料（20 &#181;l) 按照制造商说明加入每块玻璃底培养皿，并继续孵育。Zn的总孵育时间为1 h2+ 选择性指示剂染色40分钟，以及细胞核染色40分钟。</li>
	<li>孵育1小时后，将胰岛转移至含有0.1% BSA的新鲜BMHH成像缓冲液中（100 &#181;L）加入到一个7 mm玻璃底、未经组织培养处理的培养皿中。加入2 &#181;L 的 PI 储存液孵育 10 分钟，使终浓度为 20 &#181;g/mL</li>
	<li>在PI染色后的15分钟内，使用40倍水浸物镜的荧光显微镜进行成像。采用405 nm、488 nm和514 nm的激发激光，分别检测核染料（460 nm）、Zn²⁺特异性指示剂（535 nm）和PI（617 nm）的荧光发射信号。2+ 选择性指示剂（516 nm）和PI（620 nm）。</li>
	<li>将胰岛以由三幅图像组成的z轴堆栈形式进行成像，10 &#181;m 间隔。仅对底部成像 &#8531; - &#189; 通过减少胰岛内光散射问题导致的信号丢失，优化胰岛成像效果。</li>
	<li>计数活细胞：蓝色（核染色阳性）、锌绿色（Zn2+ 在 ImageJ（NIH）中手动计数每只小鼠至少 5 个胰岛（n = 3）的选择性指示剂阳性（selective indicator-positive）和死细胞红色（PI-positive）细胞，计算其百分比 &#946;β-细胞死亡如下： 
	百分比 &#946;β-细胞死亡率 =（锌阳性且PI阳性细胞数）/（死亡与存活胰岛细胞总数）× 100% 
	或 
	百分比 &#946;β-细胞死亡率 = （锌阳性且PI阳性细胞数 / 锌阳性细胞总数）× 100%</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

本研究展示了利用荧光染料多染法结合共聚焦显微镜，在细胞因子诱导的应激条件下评估胰岛细胞活力、凋亡及β细胞存活的有效性。FDA/PI染色显示，暴露于细胞因子的胰岛中细胞死亡呈剂量依赖性增加，表现为膜完整性受损细胞出现红色荧光，证实了细胞因子对细胞活力的细胞毒性作用。FDA/PI染色还可识别人胰岛中的活细胞与死细胞，为人胰岛制备物活力提供快速的定性评估7。因此，该染色方法在炎症条件下评估细胞活力具有可靠性。该结果也进一步支持了细胞因子在糖尿病发病机制中的作用，即长期暴露于细胞因子将损害β细胞的功能与存活5,19。
YO-PRO-1/核染料和Annexin-V/核染料为细胞因子诱导的细胞凋亡提供了进一步的证据。经细胞因子处理的胰岛显示出增强的绿色荧光，提示存在与凋亡细胞相关的死亡细胞。Annexin-V还证实了早期及进展期凋亡细胞的存在。综上所述，这些染色技术可有效表征β细胞中的细胞凋亡，验证了在暴露于促炎性细胞因子时，细胞...

胰岛，也称为朗格汉斯岛，是位于胰腺内的一群内分泌细胞。其中产生胰岛素的β细胞是胰岛中最丰富且功能上最重要的组成部分。这些β细胞分泌胰岛素，这是一种在维持葡萄糖稳态中起关键作用的激素1。在1型糖尿病（T1D）中，免疫系统会靶向并浸润胰岛，破坏产生胰岛素的β细胞。这种自身免疫攻击主要由促炎性细胞因子介导，包括白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和干扰素-γ（IFN-γ）2。这些细胞因子在β细胞内引发一系列信号传导事件，最终触发细胞凋亡3。细胞凋亡即程序性细胞死亡，是一个受到严密调控的过程，涉及caspase的激活、DNA断裂以及细胞解体。这一过程导致T1D发病过程中β细胞质量和功能的逐渐丧失3。
阐明驱动β细胞凋亡的分子机制，对于确定预防或减轻1型糖尿病（T1D）中β细胞破坏的策略至关重要。为实现这一目标，来自动物实验模型或人类遗体的分离胰岛是一种研究β细胞病理的可靠且成熟的模型系统2,3。通过对这些分离的胰岛施加促炎性细胞因子，研究人员可以模拟早期T1D的微环境，从而在体外（in vitro）深入研究β细胞功能障碍和死亡过程4,5。这些实验为了解β细胞在疾病相关条件下的易损性和存活机制提供了关键见解，同时也为测试旨在保护或挽救β细胞免受细胞因子诱导凋亡的治疗干预措施提供了平台。通过利用这种体外（in vitro）系统，我们可以有效分析来自不同物种的胰岛在各种条件下的反应，从而更深入地理解不同物种间功能和凋亡特性的差异。
既往研究表明，分别用细胞因子混合物（1x = 10 ng/mL TNF-α、5 ng/mL IL-1β 和 100 ng/mL IFN-γ）处理小鼠和人胰岛24小时后，会导致胰岛细胞显著死亡4,5,6。通过荧光素二乙酸酯（FDA）和碘化丙啶（PI）染色细胞，可确认胰岛的活力5,6。目前，胰岛活力的评估普遍采用标准的脱氧核糖核酸（DNA）结合染料排除法，即使用FDA和PI进行检测7。荧光染料或染料偶联底物通过细胞膜完整性和通透性来评估细胞活力。FDA是一种可穿透细胞膜的染料，活细胞可将其转化为绿色荧光物质（荧光素）。相反，PI是一种不能穿透细胞膜的染料，仅能对膜结构受损的死亡细胞的细胞核进行染色7。随后通过共聚焦显微镜进行双色成像分析，其中绿色荧光标记活细胞，红色荧光标记死细胞。
FDA/PI 染色法的局限性在于，碘化丙啶（PI）只能进入细胞膜选择性丧失的细胞，因此无法区分早期凋亡细胞。此外，该方法无法区分不同的细胞亚群，因而不适用于选择性评估β细胞的存活率。Annexin V/PI 染色法常用于研究凋亡细胞，且该方法已经过改进以提高其准确性8。细胞凋亡的早期阶段涉及磷脂酰丝氨酸从细胞质膜内层向外层的转位。Annexin V 是一种钙依赖性蛋白，可高亲和力地结合暴露在外的磷脂酰丝氨酸。通过与 PI 共同染色，可将凋亡细胞（仅 Annexin V 阳性）与坏死细胞（Annexin V 和 PI 均为阳性）区分开来，因为坏死细胞由于膜完整性受损也会暴露磷脂酰丝氨酸9。其他染料如 YOPRO-1 也用于量化胰岛细胞的凋亡。活细胞的细胞膜对 YOPRO-1 不通透，而与 Annexin V 不同的是，YOPRO-1 无法定量正在发生凋亡的活细胞。
为了评估胰腺β细胞的死亡情况，需要使用仅靶向胰岛素分泌细胞的特异性染料。胰腺β细胞的一个显著特征是，部分细胞内Zn2+以Zn2+-胰岛素复合物（2:1比例）的形式储存在囊泡中10。在β细胞周围的胞外颗粒空间中也存在游离的Zn2+，作为储备库。利用锌结合染料可以可视化分泌颗粒中游离的Zn2+以及与胰岛素松散结合的Zn2+。二硫腙（Dithizone）是一种常用的锌结合染料，常用于评估胰岛纯度，但其无法与用于评估β细胞活力和功能的荧光染料联合使用11。已开发出对Zn2+具有高度选择性的紫外探针（如TSQ和Zinquin），通过成像和检测细胞内游离Zn2+&#160;来定量β细胞12,13。然而，这些探针的应用受限于溶解性差、细胞摄取不均、需要紫外激发以及在酸性囊泡中的区室化分布14。为克服这些局限性，已开发出可见光波长的荧光探针，如Newport green和Zn2+选择性指示剂，目前已被广泛用于检测分离的人胰岛中的β细胞15,16。FluoZin-3（Zn2+选择性指示剂）相比Newport Green具有更高的Zn2+亲和力和更优的量子产率，已被证实可有效成像在分离胰岛中与胰岛素共释放的Zn2+14,17。
使用荧光染料（如FDA、PI、Annexin V、YOPRO-1以及Zn2+选择性指示剂）可实现对活细胞、凋亡细胞和总死亡细胞的检测与区分。联合使用兼容且高选择性的探针，还可为评估和定量β细胞的存活率与凋亡提供靶向方法，这对于理解并减轻糖尿病研究和药物开发中的β细胞破坏至关重要。

<table><tbody><tr><td>14 mm 玻璃底培养皿</td><td>Mattek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>1640 RPMI</td><td>Corning</td><td>10-041-CV</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 培养皿</td><td>Celltreat</td><td>229638</td><td></td></tr><tr><td>7 mm 玻璃底培养皿</td><td>Mattek</td><td>P35G-1.5-7-C</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V, Alexa Flour 488</td><td>Thermo Fisher (Invitrogen)</td><td>A13201</td><td>ex488/em515</td></tr><tr><td>氯化钙二水合物</td><td>Fisher</td><td>C79</td><td></td></tr><tr><td>无水二甲基亚砜</td><td>Sigma</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Flouzin-3, AM</td><td>Thermo Fisher (Invitrogen)</td><td>F24195</td><td>ex488/em516</td></tr><tr><td>荧光素二乙酸酯 (FDA)</td><td>Thermo Fisher (Invitrogen)</td><td>F1303</td><td>ex488/em520</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>54457</td><td></td></tr><tr><td>图像处理软件</td><td>NIH</td><td>ImageJ</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>NucBlue Live ReadyProbes 试剂 (Hoechst 33342)</td><td>Thermo Fisher (Invitrogen)</td><td>R37605</td><td>ex360/em460</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td><td>15-140-122&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液片剂</td><td>Fisher</td><td>BP2944-100</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾，颗粒状</td><td>Macron</td><td>6858-04</td><td></td></tr><tr><td>碘化丙啶</td><td>Thermo Fisher (Invitrogen)</td><td>P1304MP</td><td>ex535/em620</td></tr><tr><td>重组小鼠 IFN-gamma 蛋白</td><td>R&amp;D Systems</td><td>485-MI-100/CF</td><td></td></tr><tr><td>重组小鼠 IL-1 beta/IL-1F2&amp;nbsp;</td><td>R&amp;D Systems</td><td>401-ML-100/CF</td><td></td></tr><tr><td>重组小鼠 TNF-alpha (aa 80-235) 蛋白</td><td>R&amp;D Systems</td><td>410-MT-100/CF</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠，晶体</td><td>Macron</td><td>7581-12</td><td></td></tr><tr><td>配备光谱检测器的 Stellaris 共聚焦显微镜</td><td>Leica</td><td>DMI-8</td><td>&amp;nbsp;40x 水浸物镜。</td></tr><tr><td>Yopro-1 碘化物</td><td>Thermo Fisher (Invitrogen)</td><td>Y3603</td><td>ex488/em509</td></tr></tbody></table>

分离胰岛的处理与凋亡检测

Isolated Pancreatic Islet Treatment and Apoptosis Measurement

本研究利用荧光染色技术与共聚焦显微镜相结合的方法，探讨促炎性细胞因子对胰腺胰岛（特别是胰岛素生成性β细胞）的影响，以评估细胞活力、凋亡及β细胞特异性死亡情况。分离的小鼠胰岛经不同浓度的细胞因子混合物处理，包括TNF-α、IL-1β和IFN-γ，以模拟1型糖尿病发展过程中免疫介导的细胞凋亡。通过FDA/PI双染法评估胰岛细胞的活力，其中FDA转化为荧光素指示活细胞，PI则标记细胞膜受损的细胞。YOPRO-1染色与核染色进一步提供有关凋亡的信息，Annexin-V用于确认早期凋亡细胞。定量分析显示，经细胞因子处理的胰岛中，细胞凋亡率和细胞死亡率显著升高。为特异性评估对β细胞的影响，采用Zn2+选择性指示剂染色，通过胰岛素颗粒中锌的结合来标记胰岛素生成细胞，结果显示胰岛经促炎性细胞因子处理24小时后，β细胞大量丢失。这些多重染色方案可有效捕捉并量化细胞因子诱导的胰岛损伤程度，可用于评估旨在预防1型糖尿病早期β细胞凋亡的治疗手段。

采用FDA与PI双染法评估经细胞因子处理的胰岛细胞活力。所有实验均设置三个重复（n = 3），数据来源于间隔10 µm的多层z轴图像，每个重复包含5至6个胰岛的平均数据，以确保处理组与未处理组胰岛之间结果的可重复性及统计学比较。图1A显示来自未处理对照组的健康胰岛，由于具有酶活性的细胞将FDA转化为荧光素，呈现出明显的绿色荧光。红色荧光的缺失或极少存在证实了这些胰岛的活性，表明细胞膜完整。相比之下，图1B显示经细胞因子处理的胰岛出现显著的红色荧光，提示细胞膜完整性受损，存在大量死亡或濒死细胞。红色荧光的增强反映了PI对膜结构破坏的非活性细胞核的染色。细胞因子浓度对胰岛活力的影响见于图1C。定量数据显示，胰岛死亡率与细胞因子浓度（0.1x–1x RCC）呈正相关。这种剂量依赖性反应凸显了细胞因子对胰岛细胞的细胞毒性作用，表现为随着细胞因子暴露浓度升高，PI染色细胞的红色荧光增强。
为了检测细胞因子诱导的细胞...

本研究利用基于多染色荧光的细胞死亡和凋亡标志物，结合共聚焦显微镜技术，评估细胞因子诱导的凋亡及胰岛β细胞特异性死亡，揭示细胞对外源性刺激所引发的细胞死亡与凋亡在空间和时间上的动态变化。

本研究利用多种方法相结合的方式，探讨促炎性细胞因子对胰岛（特别是胰岛素生成β细胞）的影响。

我的研究重点是了解导致1型糖尿病发生和发展的因素，并设计新的治疗方法，为1型糖尿病（T1D）患者提供治疗选择。我们实验室利用设计型生物材料作为工具，在人体组织中研究1型糖尿病，并针对T1D的各个阶段开发个性化的药物递送疗法。我们的实验方案提供了关于完整胰岛中细胞死亡机制及其空间定位的详细信息，有助于我们更深入地理解T1D中胰岛死亡的原因。[旁白] 首先，获取小鼠胰岛，并使用10微升微量移液器将其分离至培养基中。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下过夜培养，使胰岛从分离应激中恢复，然后再进行细胞因子处理。向35毫米非组织培养处理的培养皿中加入2毫升无菌胰岛培养基。正确标记培养皿，以区分经细胞因子处理与未处理的样品。对于经细胞因子处理的培养皿，移除6微升培养基，然后分别加入2微升来自储备液的每种细胞因子，以达到所需的终浓度。在分离后12至24小时，于光学显微镜下使用微量移液器挑取10至20个胰岛。将胰岛转移至已准备好的培养皿中，并在37摄氏度、5%二氧化碳、加湿的培养箱中孵育24小时。为使用FDA和PI进行胰岛活力检测，将FDA和PI储备液各20微升分别加入含0.1%牛血清白蛋白的960微升BMHH缓冲液中。将100微升染色液分装至7毫米玻璃底、非组织培养处理的培养皿中。在细胞因子孵育后24小时，小心地将每组处理中的至少6个胰岛转移至玻璃底培养皿中。用铝箔覆盖培养皿，在室温避光条件下孵育5至10分钟。使用40倍水浸物镜通过荧光显微镜采集图像。在荧光素二乙酸酯（fluorescein diacetate）和碘化丙啶（propidium iodide）染色后15分钟内获取图像。为通过染色法检测细胞凋亡，首先将1毫摩尔储备液中的8微升YOPRO-1加入992微升BMHH成像缓冲液中。将5份各500微升的染色液分装至14毫米玻璃底、非组织培养处理的培养皿中。在细胞因子孵育后24小时，小心地将每组处理中的至少6个胰岛转移至玻璃底培养皿中。用铝箔覆盖培养皿，在37摄氏度避光条件下孵育1小时。在孵育20分钟后，向每个玻璃底培养皿中加入20微升NucBlue核染料。继续孵育，使YOPRO-1的总孵育时间达到1小时，核染料的孵育时间为40分钟。随后，将胰岛转移至含有100微升新鲜BMHH成像缓冲液（含0.1% BSA）的7毫米玻璃底、非组织培养处理的培养皿中。使用40倍水浸物镜通过荧光显微镜采集图像。使用指定波长的激发激光检测染料的荧光发射。向1毫升Annexin结合缓冲液中加入两滴或40微升核染料。将100微升该溶液分装至7毫米玻璃底、非组织培养处理的培养皿中。在细胞因子孵育后24小时，使用10微升微量移液器，通过在PBS中上下吹打三次，小心清洗每组处理中的至少6个胰岛。将胰岛转移至含有核染料溶液的玻璃底培养皿中，并用铝箔覆盖，在37摄氏度避光条件下孵育40分钟。在孵育25分钟后，

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生物学

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