使用 U2 OS 细胞培养物进行活细胞荧光显微镜检查的电穿孔流式细胞术方案

本研究的范围侧重于脉冲电场对细胞行为的影响，特别是电穿孔如何影响细胞周期。

该协议的主要优点是能够使用哺乳动物细胞培养物进行长达72小时的连续活细胞电穿孔实验。我们的实验室专注于将这些技术应用于微流体，这将允许更小的样品量，减少试剂需求，并为未来的方案提供更好的样品控制。

[旁白]首先，在含有 10% FBS 和 1% 青霉素链霉素的 10 毫升 DMEM 高葡萄糖的 10 厘米板中培养 U2OS FUCCI CA5 细胞。将板在 37 摄氏度下在 5% 二氧化碳环境中孵育。当培养物达到80%汇合度时，从板中吸出培养基。用PBS洗涤细胞，然后加入一毫升0.25%胰蛋白酶并孵育1.5分钟以解离细胞。通过将解离的细胞重悬于五毫升DMEM高葡萄糖中来中和胰蛋白酶。从重悬的培养物中获取 100 微升样品，并将其放在电穿孔细胞术系统室内的底部玻璃盖玻片上。确保引入样品后腔室汇合 30%。将四毫升DMEM高葡萄糖缓慢加入腔室的远端，防止液体冲出样品。将标准显微镜载玻片放在腔室上，并将腔室在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 24 小时。打开带有环境控制室的倒置荧光显微镜，使系统在电穿孔前稳定。当环境室稳定时，使用鳄鱼夹电缆将数字万用表连接到脉冲发生器电容器和高压开关，以便与电穿孔室快速设置。现在，在显微镜上选择 20 倍放大倍率。在显微镜软件中，确保选择与 FUCCI CA5 系统中的两种荧光蛋白相对应的 FITC/GFP 和 A594 Texas Red M Cherry 通道。使用低曝光设置（通常小于 0.05 秒），以防止在长期成像过程中损坏照片。在开始延时成像之前，拍摄测试图像以优化图像焦点和质量。对延时进行编程，在 24 小时内每 10 分钟从三个到六个不同的视角捕获图像，以获得每个延时的大量细胞周期数据，同时减轻光损伤。确保为 A594 通道启用自动对焦，以优化延时期间文化的跟踪。保持软件打开状态，直到电穿孔完成。将电穿孔细胞术室放入配备适当环境室的显微镜中。在电穿孔之前，保持腔室关闭并确保环境系统保持运行以保持适当的细胞周期条件。打开环境室，将数字万用表连接到脉冲发生器上，然后使用鳄鱼夹电缆将脉冲发生器连接到腔室电极。将脉冲发生器电容器充电至 180 伏。将脉冲快速放电到腔室中，直到数字万用表显示零伏。从腔室中拆下所有电气连接并立即更换腔室盖，以确保最佳培养条件。环境室牢固就位后，立即激活延时成像。延时摄影完成后，使用显微镜软件将所有捕获的图像保存为单个视频。调整视觉质量以增强细胞特征的清晰度，以便手动定量。最后，观察FITC和A594信号随时间的变化，以跟踪延时视频中的细胞相位。使用 Fuji 系统，通过跟踪与蛋白质表达和泛素化相关的颜色变化来收集视觉数据，从而可以清楚地区分 G1、S、G2、M 相。这使得能够直接观察不同条件下的细胞周期进程。该图总结了从使用非同步和 S 期同步细胞培养物的两组实验中收集的关键数据。在不同步的电池中，脉冲电场暴露显著增加了G1、G2和M相的平均长度，而S相保持不变。 在同步细胞中，脉冲电场暴露导致 G1、S 和 G2 相持续时间缩短，尽管只有 S 和 G2 具有统计学意义，而 M 相不受影响。