化学遗传学调控重编程干细胞来源的前体细胞在治疗神经退行性疾病中的应用

我们的研究致力于阐明神经退行性疾病的致病机制，同时整合先进技术，开发可用于临床的高效细胞治疗技术。近期工作中，我们在帕金森病小鼠模型中移植了经化学遗传学修饰的干细胞。我们利用设计药物调控特定细胞的神经元活性，并结合电生理监测与行为学评估。我们主要采用CRISPR技术进行基因工程改造，利用电生理学监测神经活动，并通过行为学检测评估帕金森病模型中的功能恢复情况。在基于干细胞的神经退行性疾病治疗中，移植物细胞的效率取决于其正确的定位、存活能力及其对宿主组织的功能性贡献。细胞活动失控可能导致包括肿瘤发生在内的不良后果。

利用人类重编程干细胞和驱动神经元技术，可通过给予设计药物CNO精确调控神经元活动。

[讲师] 首先，将50至100纳克线性化载体、片段一和片段二以1:3:3的摩尔比与2X克隆混合液轻柔混匀。在55摄氏度孵育一小时，以通过Gibson组装法促进同源重组。将靶向AAVS1位点的引导RNA插入PX458载体的BBS1位点。将重编程的干细胞维持在培养基中，目标细胞密度为每毫升200万至500万个细胞。现在，将200万至500万个细胞、每种供体质粒各2微克以及2微克GRNA质粒加入100微升电穿孔缓冲液中混匀。将细胞与质粒混合物转移至电穿孔杯中进行电穿孔。接下来，将电穿孔后的细胞转移至预先包被多聚-D-赖氨酸和层粘连蛋白的六孔板中。每孔加入约50万个细胞，并加入2毫升培养基。电穿孔72小时后，使用流式细胞仪分选荧光阳性细胞。使用FITC通道配置分选仪以检测ZsGreen。将未经处理的诱导性神经干细胞作为阴性对照，以确定基础荧光水平。将单个ZsGreen阳性细胞接种至预先包被多聚-D-赖氨酸和层粘连蛋白的96孔板中，每孔加入200微升培养基。维持培养7至14天。使用配备绿色荧光蛋白滤光片组的倒置荧光显微镜分离表现出荧光的单克隆。在将阳性细胞扩增至包被的48孔板后，将其分为两部分，一部分用于继续培养，另一部分用于基因型鉴定。从候选克隆中提取基因组DNA。使用两对引物配制PCR反应体系：一对用于确认目的基因的插入，另一对用于区分纯合子与杂合子克隆。消化细胞，用PBS洗涤，并在250 × g离心3分钟。对麻醉动物进行单侧立体定位注射，向右侧纹状体靶区注射3微升浓度为每微升5微克的6-羟基多巴胺。手术四周后，使用生理盐水溶解的0.5毫克/毫升溶液，按每公斤体重1毫克的剂量腹腔注射阿扑吗啡，以验证损伤效果。向帕金森病小鼠模型立体定位注射4微升制备好的细胞悬液。在细胞移植后的多个时间点进行圆筒实验。将一个直径20厘米、高30厘米的玻璃烧杯放置在平坦无反光的表面上。然后，在圆筒正上方架设俯视摄像机，以完整捕捉其直径范围。将每只小鼠置于圆筒中心，并开始同步录像，每次持续三分钟。实验结束后，将小鼠放回其原饲养笼。在三分钟实验期间评估小鼠的上肢运动行为。计算受损前肢接触筒壁的次数占双侧前肢总接触次数的比例。通过腹腔注射给予生理盐水或氯氮平N-氧化物（Clozapine N-oxide），剂量为每公斤体重1.2毫克。再次进行圆筒实验，以评估给予氯氮平N-氧化物后帕金森病小鼠模型的行为调节情况。从麻醉动物体内取出脑组织后，立即将其置于冰上预冷的蔗糖基人工脑脊液中，以保持细胞完整性。使用振动切片机将脑组织切成300至400微米厚的切片。调节气体输入参数，使环境与34摄氏度下95%氧气和5%二氧化碳平衡。将脑切片转移至充满人工脑脊液的孵育室中。用冰冻的细胞内液填充玻璃移液管，确保电极电阻在7至10兆欧之间。将切片置于浸没式记录室中，以每分钟2毫升的速度持续灌注含氧人工脑脊液，温度维持在34摄氏度。在红外微分干涉差显微镜下，使用电动显微操作器定位移液管。通过轻柔抽吸建立全细胞记录模式，使神经元封接电阻大于1吉欧。使用膜片钳放大器将细胞钳制在-70毫伏，以10千赫兹采样率记录8分钟的基础自发性兴奋性突触后电流。在完成基础记录后，立即向记录室中加入50微摩尔的氯氮平N-氧化物。继续记录16分钟，监测自发性兴奋性突触后电流频率或振幅的变化。最后，通过更换为新鲜人工脑脊液进行洗脱，继续记录以评估突触活动的恢复情况。使用氯氮平N-氧化物进行化学遗传学调控后，与生理盐水处理组相比，移植hM4Di细胞的小鼠对侧前肢运动减少，而移植hM3Dq细胞的小鼠前肢运动增加，表明实现了双向行为控制。电生理记录显示，移植hM4Di细胞的小鼠其自发性兴奋性突触后电流的间隔更长、峰值振幅更小，而移植hM3Dq细胞的小鼠则间隔更短、振幅更大，提示突触活动分别受到抑制和增强。免疫荧光分析证实，移植的hM4Di和hM3Dq细胞在体内表达了酪氨酸羟化酶和ZsGreen，支持移植物成功整合。