重编程干细胞衍生前体细胞的化学遗传学调控治疗神经退行性疾病
May 2nd, 2025
在这里，我们描述了一种方案，通过将这些细胞分化为多巴胺能前体细胞，将它们移植到帕金森病的小鼠模型中，并评估行为和电生理结果以确认移植细胞的成功整合和功能有效性，从而改造化学重编程干细胞以实现精确的神经元调节。
我们的研究重点是阐明神经退行性疾病的致病机制，同时整合先进技术，开发有效的细胞治疗技术以应用于临床应用。我们最近的工作在帕金森病小鼠模型中移植了化学基因修饰干细胞。我们用设计药物调节一个细胞的神经元活动，因此进行电生理监测和行为评估。我们主要利用CRISPR进行基因工程，利用电生理学监测神经活动，利用行为测定来评估帕金森病模型的功能恢复。在基于干细胞的治疗、治疗神经退行性疾病中，移植细胞的效率取决于适当的适应症、存活和对宿主组织的功能贡献。与负面后果（包括肿瘤发生）相关的不受控制的细胞活动。
利用人类重编程干细胞和驱动神经元的技术，提供了通过施用设计药物 CNO 来精确控制神经元活动的方法。
[导师]首先，以 1 到 3 到 3 摩尔的比例轻轻混合 50 至 100 纳克线性化载体，片段 1 和片段 2，以及 2X 克隆混合物。将混合物在 55 摄氏度下孵育一小时，以促进使用 Gibson 组装的同源重组。将靶向AAVS1位点的引导RNA插入PX458载体的BBS1位点。将重新编程的干细胞维持在培养基中，目标是细胞密度在每毫升 2 至 500 万个细胞之间。现在，将 2 至 500 万个细胞、2 微克每个供体质粒和 2 微克 GRNA 质粒混合在 100 微升电穿孔缓冲液中。将细胞和质粒混合物转移到比色皿中进行电穿孔。接下来，将电穿孔细胞转移到涂有聚-D-赖氨酸和层粘连蛋白的六孔板中。将每孔约 500,000 个细胞分布在两毫升培养基中。电穿孔72小时后，使用流式细胞仪对荧光阳性细胞进行分选。使用 FITC 通道配置排序器以进行 ZsGreen 检测。将未经处理的诱导神经干细胞作为阴性对照，以定义基线荧光。将单个 ZsGreen 阳性细胞接种到预涂有聚 D-赖氨酸和层粘连蛋白的 96 孔板中，每孔加入 200 微升培养基。保持培养物 7 至 14 天。使用配备绿色荧光蛋白滤光片组的倒置荧光显微镜分离表现出荧光的单克隆。在包被的48孔板上扩增阳性细胞后，将它们分成两部分，一部分用于继续培养，另一部分用于基因分型。从候选克隆中提取基因组 DNA。使用两种初免修复制备PCR混合物，一种用于确认目标基因的插入，另一种用于区分纯合克隆和杂合克隆。消化细胞，在PBS中洗涤，然后以250G离心三分钟。在麻醉动物身上单侧立体定向注射3微升6-羟基多巴胺，浓度为每微升5微克。使用正确的坐标瞄准正确的纹状体。手术后 4 周，使用溶解在生理盐水中的每毫升 0.5 毫克溶液以每公斤 1 毫克的速度腹腔注射阿扑吗啡，以验证病变。将四微升制备的细胞悬液立体定向注射到帕金森病小鼠模型中。在细胞移植后的多个时间点进行圆柱体测试。将直径 20 厘米、高度 30 厘米的玻璃烧杯放在平坦、不反光的表面上。然后，将俯视相机放置在圆柱体上方以捕获整个直径。将每只鼠标放在圆柱体的中心，并开始每次会话同时录制三分钟的视频。会话结束后，将鼠标放回其主笼中。在三分钟的疗程中评估小鼠的上肢运动。计算受损前肢进行的墙壁接触次数相对于两个前肢进行的总接触次数。通过腹腔注射以每公斤 1.2 毫克的剂量施用生理盐水或氯氮平 N-氧化物。再次进行圆柱体测试以评估氯氮平N-氧化物给药后帕金森病小鼠模型的行为调节。从麻醉动物身上提取大脑后，立即将其放入冰冷的蔗糖基人工脑脊液中，以保持细胞完整性使用振动切片机将大脑切成 300 至 400 微米厚的切片。调整气体输入设置以在 34 摄氏度下与 95% 的氧气和 5% 的二氧化碳平衡。将脑切片转移到充满人工脑脊液的腔室中。 用冰镇的细胞内溶液加载玻璃移液器，确保电极电阻在 7 至 10 兆欧之间。将切片安装在以每分钟 2 毫升的速度与 34 摄氏度的含氧人工脑脊液超融合的浸没记录室中。在红外微分干涉对比显微镜下使用电动显微纵器定位移液器。使用轻柔的吸力建立全细胞配置，以修补电阻大于 1 吉欧姆的神经元。使用膜片钳放大器将细胞钳制在负 70 毫伏，并以 10 kHz 采样率获取基线自发兴奋性突触后电流 8 分钟。基线测量后立即将 50 微摩尔氯氮平 N-氧化物添加到记录室中。继续记录数据 16 分钟，并监测自发兴奋性突触后电流频率或幅度的变化。最后，通过用新鲜的人工脑脊液代替氯氮平 N-氧化物溶液来执行清除程序，并继续记录以评估突触活动的恢复。与生理盐水治疗相比，使用氯氮平 N-氧化物进行血液发生调节减少了 hM4Di 移植小鼠的对侧前肢运动，并增加了 hM3Dq 移植小鼠的对侧前肢运动，证明了双向行为控制。电生理记录显示，hM4Di移植的细胞在自发兴奋性突触后电流中具有更长的间隔和更小的峰值幅度，而hM3Dq移植的细胞具有更短的间隔和更大的幅度，表明突触活性分别受到抑制和增强。免疫荧光分析证实了酪氨酸羟化酶和ZsGreen在移植的hM4Di和hM3Dq细胞中的体内表达，支持移植物的成功整合。
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概述
本研究详细介绍了一种将化学重编程干细胞工程化为多巴胺能前体细胞的协议，以用于帕金森病的潜在治疗应用。通过使用小鼠模型，研究评估了移植细胞的行为影响和电生理特性，以评估其功能性和对宿主神经环境的整合。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 干细胞疗法
- 神经退行性疾病
背景
- 研究探索了基因工程干细胞在调节神经元活动中的作用。
- 帕金森病是重点，特别是治疗性细胞在受影响的神经电路中的整合。
- 目前利用基因编辑（例如CRISPR）的方法旨在提高细胞治疗的有效性。
- 理解这些机制对于推进神经退行性疾病治疗方法至关重要。
研究目的
- 开发一种用于帕金森病模型的化学重编程干细胞移植协议。
- 评估这些细胞在恢复神经元活动中的功能效果。
- 利用先进的监测技术评估行为和电生理学结果。
使用的方法
- 主要平台涉及将改造后的干细胞移植到小鼠模型中。
- 特别利用帕金森病小鼠模型来评估多巴胺能前体细胞的治疗潜力。
- 关键方法包括用于基因修饰的CRISPR和用于神经活动监测的电生理记录。
- 采用柱试验等行为测定来评估随时间推移的运动功能恢复。
- 关键步骤包括电穿孔引入基因材料，以及各种手术后功能整合的评估。
主要结果
- 展示了移植干细胞成功整合到宿主的神经解剖结构中，导致功能恢复。
- 电生理学监测显示细胞移植后神经元活动的显著变化。
- 行为测定表明在实验时间线上经治疗的小鼠运动功能得到改善，表明有效的神经调节。
- 协议的关键验证确认了基于干细胞的方法在治疗神经退行性疾病中的可靠性。
结论
- 本研究展示了一种针对神经退行性疾病的细胞疗法开发的有前景的途径。
- 研究结果突出了使用工程化干细胞精确控制神经元活动的潜力。
- 研究显著地为理解神经调节和疾病模型中的恢复机制做出了贡献。
常见问题
Executive Industry Relevance
Precise chemogenetic regulation of reprogrammed stem cell-derived dopaminergic precursors enables controlled interrogation of neuronal integration and function in neurodegenerative disease models. This approach addresses a critical discovery-stage challenge: establishing predictive confidence in cell-based therapies by linking engineered cell activity to quantifiable behavioral and electrophysiological outcomes. The method supports risk-adjusted advancement of regenerative strategies for Parkinson's disease and related disorders.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional validation of engineered neuronal precursors in disease-relevant systems.
- Supports mechanistic de-risking by linking chemogenetic modulation to behavioral and synaptic outputs.
- Facilitates portfolio triage by providing quantitative evidence of graft integration and activity.
Screening & Assay Development
- Establishes reproducible behavioral and electrophysiological assays for evaluating cell therapy candidates.
- Standardizes quantitative readouts for motor function and synaptic activity in preclinical models.
- Prepares validated systems for downstream compound or cell-based screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns functional outputs with disease-relevant behavioral endpoints in Parkinson's models.
- Enables continuity from discovery-stage engineering to preclinical validation of cell integration and modulation.
- Supports risk-adjusted decisions for advancing cell therapy candidates toward translational studies.
Pipeline & Workflow Integration
This chemogenetic modulation workflow bridges early discovery, target validation, and preclinical assessment in regenerative neuroscience pipelines.
- Discovery Biology: Provides a platform for hypothesis testing on neuronal integration and functional contribution of engineered cells.
- Screening: Delivers standardized, reproducible behavioral and electrophysiological assays for candidate evaluation.
- Analytics: Generates quantitative measurements of synaptic activity and motor behavior for comparative analysis.
- Translational Research: Connects engineered cell function to disease-relevant endpoints, supporting biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable chemogenetic and behavioral assessment platform for diverse neurodegenerative models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in cell therapy integration and function.
- Operational Value: Enables standardized, scalable, and reproducible assessment of engineered cell candidates.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in regenerative portfolios.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of cell therapy assets for neurodegenerative indications.
Implementation Considerations
- Requires expertise in CRISPR engineering, stem cell differentiation, and chemogenetic modulation.
- Demands access to electrophysiology platforms, behavioral assay infrastructure, and advanced imaging.
- Necessitates cross-team standardization of behavioral and synaptic readouts for comparability.
- Adaptation across disease models may require protocol optimization for cell type and host environment.
- Practical limitations include the need for rigorous validation of functional integration and safety in translational models.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:43
Construction of Non-Fusion Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs (DREADD) Stem Cell-Based Cell Lines
4:33
Transplanting DREADD Stem Cell-Derived Precursor Cells into Parkinson's Disease (PD) Model Mice
6:29
In Vivo Electrophysiological Profiling of Chemogenetically Modulated Cells
8:36
Results
