Name: 重编程干细胞衍生前体细胞的化学遗传学调控治疗神经退行性疾病 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: 学习利用化学遗传学重编程干细胞分化为多巴胺能前体细胞，通过CRISPR基因编辑和电生理记录，在小鼠帕金森病模型中评估移植细胞的功能整合与行为恢复效果。

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本工作得到北京市自然科学基金（7242068）、国家自然科学基金（82171250）、北京市卫生健康委员会基金（PXM2020_026283_000005）以及北京市属医学研究机构科技发展项目（11000023T000002036310）的资助。

所有动物实验均按照北京实验动物科学协会和美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）颁布的《实验动物护理与使用指南》进行。人外周血单个核细胞（PBMCs）来自一位健康供体，已获得书面知情同意，具体方法见先前研究17。
1. 构建非融合型 DREADD 干细胞系
<ol>
	<li>构建DREADD供体质粒。 
	注意：酶切位点应根据载体序列设计。片段应通过合成并扩增，两端设计20-30 bp与相邻片段末端匹配的重叠序列，以提高组装效率。
	<ol>
		<li>设计并合成T2A-ZsGreen片段（片段I）。</li>
		<li>使用PCR从原始质粒中扩增hM3Dq/hM4Di-T2A片段（片段II）。设置PCR反应体系（总体积50 µL），包含1× PCR缓冲液、每种dNTP混合物200 µM、正向和反向引物各0.5 µM、质粒DNA模板10-50 ng，以及1.25 U高保真DNA聚合酶。进行如下热循环程序：98 °C预变性2.75分钟以充分解链模板；32个扩增循环，每个循环包括98 °C变性15秒、60 °C退火30秒、72 °C延伸60秒；最后72 °C延伸7分钟。</li>
		<li>使用适当的限制性内切酶对载体质粒进行消化，获得线性化载体。通过琼脂糖凝胶电泳纯化所有片段，并使用分光光度计定量。 
		注意：此处原始质粒使用MluI和SalI进行消化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将50-100 ng线性化载体、片段I和片段II按1:3:3的摩尔比与2×克隆混合液轻柔混匀。在55 °C孵育1小时，以通过Gibson组装实现同源重组。</li>
	<li>将靶向AAVS1位点的引导RNA插入pX458载体的BbsI位点。 
	注意：使用Sanger测序对所有构建的质粒进行序列验证。</li>
	<li>将重编程干细胞维持在培养基中，目标细胞密度为2-5 × 106 个细胞/mL。 
	注意：本实验所用的重编程干细胞系由人外周血单个核细胞（PBMCs）诱导而来，具体方法见先前研究17。监测细胞健康状态至关重要，因为细胞状态显著影响电穿孔效率。参见材料表以比较不同培养基。</li>
	<li>将2-5 × 106个细胞、每种供体质粒（hM4Di-T2A-ZsGreen或hM3Dq-T2A-ZsGreen）各2 µg，以及gRNA质粒2 µg加入100 µL电穿孔缓冲液中混匀，转移至电穿孔杯中进行电穿孔。 
	注意：进行电穿孔前，确保混合物充分混匀且无气泡。根据细胞类型优化电穿孔参数以最大化转染效率，不同设备可能需要特定调整。</li>
	<li>将核转染仪设置为B16程序，并启动电穿孔，以实现对目标诱导神经干细胞（iNSCs）的高效转染。</li>
	<li>向6孔板的每孔加入1 mL 50 µg/mL多聚-D-赖氨酸（PDL），室温孵育至少2小时。吸除所有PDL后，向每孔加入1.5 mL 5 µg/mL层粘连蛋白，37 °C孵育2-4小时。包被后的培养板应立即使用，或于2-8 °C保存1周。</li>
	<li>将电穿孔后的细胞转移至已包被PDL和层粘连蛋白的6孔板中。每孔接种约500,000个细胞，每孔培养体积为2 mL培养基。</li>
	<li>电穿孔72小时后，使用流式细胞仪分选荧光阳性细胞。
	<ol>
		<li>将解离后的细胞重悬于DPBS中，并通过70 µm细胞筛过滤。</li>
		<li>设置分选仪的FITC通道用于检测ZsGreen信号。以未处理的iNSCs作为阴性对照，以确定背景荧光水平。</li>
		<li>使用100 µm喷嘴、鞘液压力20 psi校准仪器。采用四路纯度分选模式，并确认单细胞分选。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将单个ZsGreen+细胞接种于预先包被PDL和层粘连蛋白的96孔板中，每孔加入200 µL培养基以支持初始生长。在培养基中维持培养7-14天。 
	注意：每日观察各孔，记录生长迹象和荧光信号，以判断是否成功整合，并标记阳性孔。</li>
	<li>使用配备GFP滤光片组的倒置荧光显微镜分离显示荧光的单克隆。在10×放大倍数下筛选克隆。标记含有持续、均一ZsGreen信号的单克隆孔。拍摄明场和荧光图像，以记录细胞形态和荧光强度。 
	注意：成像前更换新鲜培养基以降低背景荧光。排除形态不规则或存在自发荧光的克隆。</li>
	<li>将阳性细胞在包被的48孔板中扩增，随后分为两部分，一部分用于继续培养，另一部分用于基因型鉴定。</li>
	<li>从候选克隆中提取基因组DNA。使用两对引物配制PCR反应：一对用于确认目的基因的插入，另一对用于区分纯合子和杂合子克隆。进行如下热循环程序：95 °C预变性5分钟；38个循环，每个循环包括95 °C变性30秒、60 °C退火30秒、72 °C延伸45秒；最后72 °C延伸7分钟。将PCR产物在2%琼脂糖凝胶上电泳分离。 
	注意：引物信息见材料表。通过出现单一650 bp条带（引物1）确认目的基因插入。通过是否存在630 bp条带来判断：存在该条带为杂合子克隆，缺失该条带为纯合子克隆（引物2）。</li>
	<li>将阳性细胞在包被的6孔板中进一步扩增。</li>
	<li>将细胞消化后，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，250 × g离心3分钟。以每管2.5 × 106个细胞的密度，用含10% DMSO的冻存液冷冻保存细胞。</li>
</ol>
2. 将DREADD干细胞来源的前体细胞移植到帕金森病模型小鼠中
<ol>
	<li>手术前30分钟，对免疫缺陷小鼠腹腔注射去甲替林（浓度为5 mg/mL，剂量为10 mg/kg）。使用2%异氟烷对小鼠进行麻醉。</li>
	<li>对右侧纹状体进行单侧立体定位注射6-羟基多巴胺（6-OHDA，5 µg/µL）3 µL。靶向坐标如下：前后位 = 0.5 mm，外侧位 = 2.1 mm，垂直位 = -3.2 mm。 
	注意：6-OHDA应溶于含0.2%抗坏血酸的生理盐水中。确保精确定位，以尽量减少损伤程度的变异性。 
	警告：6-OHDA具有细胞毒性，可产生活性氧，诱导细胞应激。操作时需谨慎。</li>
	<li>术后4周，腹腔注射阿扑吗啡（1 mg/kg，0.5 mg/mL溶于生理盐水）以验证损伤效果。选择在30分钟观察期内出现超过100次对侧旋转的小鼠用于后续实验。 
	注意：阿扑吗啡是一种多巴胺受体激动剂，可直接激活去神经支配纹状体中超敏的突触后受体，导致双侧黑质-纹状体环路活动失衡。阿扑吗啡诱导的旋转行为可用于评估6-OHDA所致单侧多巴胺能损伤的严重程度。</li>
	<li>将细胞接种并培养于包被的六孔板中（每孔150,000个细胞）。在第一阶段分化培养基中孵育10天，每2天更换一次培养基。第11天起转换至第二阶段分化培养基，并继续孵育至第13天，每天更换培养基。 
	注意：参见材料表中关于分化培养基的比较。</li>
	<li>在分化第10天和第13天收集细胞，按1:7的比例混合。将混合细胞悬浮于移植缓冲液中，浓度为100,000个细胞/µL。 
	注意：参见材料表中关于移植缓冲液的比较。</li>
	<li>将制备好的细胞悬液总量4 µL，通过立体定位注射至帕金森病（PD）小鼠脑内。</li>
	<li>在细胞移植后的不同时间点进行圆筒实验。将一个玻璃烧杯（直径：20 cm，高度：30 cm）置于平坦、无反光的表面上。在圆筒正上方放置顶部摄像机，以完整捕捉其直径范围。 
	注意：用黑色帘布包围圆筒，以消除外部视觉刺激。</li>
	<li>将每只小鼠置于圆筒中心，并开始同步视频记录（每次3分钟）。实验结束后，将小鼠放回其饲养笼。 
	注意：实验前让小鼠在光照条件下适应测试房间30分钟。每次实验之间用70%乙醇清洁圆筒，以消除嗅觉线索。</li>
	<li>评估小鼠3分钟内的上肢运动能力。计算受损前肢接触筒壁的次数占双侧前肢总接触次数的比例。</li>
	<li>通过腹腔注射给予生理盐水或CNO（剂量为1.2 mg/kg）。在给予CNO后进行圆筒实验，以评估帕金森病小鼠模型的行为调节情况。 
	注意：评估前应给予约40分钟的恢复期。</li>
</ol>
3.&#160;化学遗传学调控细胞的体内电生理特征分析
<ol>
	<li>通过腹腔注射 250 mg/kg 戊巴比妥麻醉小鼠。取出脑组织并立即置于冰上预冷的蔗糖基人工脑脊液（s-ACSF）中，以维持细胞完整性。使用振动切片机将脑组织切成 300–400 µm 厚的切片。 
	注意：操作过程应迅速，以保持脑组织处于低温状态，从而保护细胞功能。有关用于新鲜脑切片制备的 s-ACSF，请参见材料表。</li>
	<li>将样本转移至含有经 95% O2 和 5% CO2 平衡的 ACSF 的孵育槽中，温度维持在 34 °C，并确保整个实验过程中保持该温度。 
	注意：有关 ACSF 的组成，请参见材料表。</li>
	<li>用冰冷新鲜的细胞内液填充玻璃移液管，电极电阻应控制在 7 至 10 MΩ 之间。 
	注意：细胞内液的配方请参见材料表。玻璃移液管由玻璃毛细管经微电极拉制仪拉制而成18。实验开始前应检查玻璃移液管是否存在泄漏，并确保其尖端足够锐利以穿透细胞膜。移液管制备应迅速完成，以尽量减少细胞内液的温度波动。</li>
	<li>将脑片置于浸没式记录槽中，以 34 °C、持续通氧的 ACSF 以 2 mL/min 的流速进行灌流。在红外差分干涉显微镜下，使用电动显微操作器定位移液管。对移植物区域内的神经元施加轻柔负压（电阻 &#62; 1 GΩ），建立全细胞记录模式。使用膜片钳放大器将细胞钳制在 -70 mV，以 10 kHz 采样率（2 kHz 滤波）连续记录 8 分钟的基础 sEPSCs，并持续监测接入电阻（目标值：&#60;20 MΩ；若接入电阻 &#62;25 MΩ 或波动幅度超过 &#62;10%，则舍弃该记录）。 
	注意：施加负压时应使用适当压力，避免细胞发生不期望的位移或破裂，并仔细调整移液管位置以获得良好的封接。若封接质量不佳，应弃用该移液管并重新尝试。</li>
	<li>完成基础记录后，立即向记录槽中加入 50 µM CNO，并继续记录 16 分钟，观察 sEPSC 频率或振幅的变化。</li>
	<li>通过将含 CNO 的溶液更换为新鲜 ACSF 进行洗脱，以有效清除记录槽中的 CNO。继续记录实验剩余时间的数据，以评估突触活动是否恢复。</li>
</ol>

<ol><li>Thiel, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aThiel%2C+G+%22Designer+receptors+exclusively+activated+by+designer+drugs%22">Designer receptors exclusively activated by designer drugs</a>. , Humana Press. (2015).</li>
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<li>Stachniak, T. J., Ghosh, A., Sternson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemogenetic+synaptic+silencing+of+neural+circuits+localizes+a+hypothalamus+midbrain+pathway+for+feeding+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Chemogenetic synaptic silencing of neural circuits localizes a hypothalamus midbrain pathway for feeding behavior.</a> Neuron. 82 (4), 797-808 (2014).</li>
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<li>Xiong, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+stem+cell-derived+neurons+repair+circuits+and+restore+neural+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Human stem cell-derived neurons repair circuits and restore neural function.</a> Cell Stem Cell. 28 (1), 112-126.e6 (2021).</li>
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<li>Surmeier, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+dopamine+in+modulating+the+structure+and+function+of+striatal+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The role of dopamine in modulating the structure and function of striatal circuits.</a> Prog Brain Res. 183, 148-167 (2010).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案利用CRISPR技术对人类重编程干细胞进行基因改造，使其表达兴奋性hM3Dq和抑制性hM4Di受体。通过将细胞移植到帕金森病小鼠模型中，并结合行为学评估和电生理记录，评估CNO对神经元活性的调控作用。
在化学遗传重编程干细胞中生成稳定表达的非融合DREADD构建体的第一步，涉及T2A-ZsGreen双顺反子表达盒。然而，表达融合蛋白的质粒（如hM3Dq-mCherry和hM4Di-mCherry7）对此诱导性神经干细胞系无效。为克服这一问题，我们通过Gibson组装方法构建了供体质粒，具体步骤详见方案1.1–1.2。
通过向免疫缺陷小鼠的纹状体单侧立体定位注射6-OHDA建立帕金森病模型，对于实现精确的体内调控至关重要。在整个研究过程中，包括细胞移植和药物治疗阶段，部分动物可能会出现意外死亡。因此，应仔细规划初始样本量，以确保各实验组有足够的动物数量15,<sup class='xref...

仅由设计药物激活的设计受体（DREADD）是一类经过改造的G蛋白偶联受体，可通过原本无活性的合成配体进行选择性激活1。化学遗传学方法通过实现对特定脑区或细胞类型的精确激活或抑制，使研究人员能够高精度地研究神经回路的连接性，并加深了我们对细胞功能在体内和体外活动机制的理解，已成为神经科学领域的一项重要工具2,3。
基于干细胞的治疗为神经退行性疾病的治疗提供了一种前景广阔的策略。移植物细胞的疗效依赖于其在宿主组织中的适当整合、存活以及功能上的贡献。细胞活动若不受控制，可能导致包括肿瘤发生在内的不良后果4，因此需要在移植后对这些细胞进行精确调控。利用DREADD技术对人类重编程干细胞及其衍生神经元进行改造，可通过给予设计药物CNO实现对神经元活动的精确控制2,5。在帕金森病（PD）研究中，由于该疾病以多巴胺能神经元的丧失为特征，调控干细胞来源的多巴胺能神经元的活动对于在啮齿类动物模型中研究其突触输入和投射模式至关重要6,7,8,9,10。将兴奋性受体hM3Dq和抑制性受体hM4Di引入这些模型，可实现对神经元活动的精准调节11,12。
动物行为学评估与电生理记录相结合，可对化学遗传学调控对移植细胞的影响进行全面评价 体内13行为学评估，包括阿扑吗啡诱导的旋转实验、圆筒实验和转棒实验，可评估运动协调性，并为帕金森病（PD）实验模型相关的运动功能变化提供见解。14电生理学技术（如膜片钳记录）能够实时监测突触反应和动作电位，从而全面揭示移植细胞如何整合到现有神经网络中的过程。15通过将行为学评估与电生理学评价相结合，我们可以研究化学遗传学调控如何影响这些细胞在宿主神经环路中的整合及其功能。16初步研究结果表明，CNO 给药可有效调节移植细胞中的神经元活性，从而在动物模型中改善功能学结果。
在本实验方案中，利用成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）技术，对人类重编程干细胞进行基因改造，使其表达 hM3Dq 或 hM4Di 受体。将经修饰的重编程干细胞分化为中脑多巴胺能前体细胞后，将其移植到帕金森病（PD）小鼠模型中，通过行为学评估和电生理记录，评估这些细胞在宿主神经回路中的整合能力与功能调控作用。

<table><tbody><tr><td>2 × Rapid Taq Master Mix</td><td>Vazyme</td><td>P222-01</td><td>用于基因分型分析</td></tr><tr><td>2&amp;times;Seamless Cloning Mix</td><td>Biomed Gene Tech.</td><td>CL117-01</td><td>用于质粒构建</td></tr><tr><td>6-OHDA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4381</td><td>用于建立帕金森病小鼠模型</td></tr><tr><td>AAVS1-Pur-CAG-EGFP</td><td>Addgene</td><td>80945</td><td>作为对照&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>AAVS1-Pur-CAG-hM4Di-mCherry</td><td>Addgene</td><td>80947</td><td>构建 hM4Di-T2A-ZsGreen 的原始质粒</td></tr><tr><td>AAVS1-Pur-CAG-hM3Dq-mCherry</td><td>Addgene</td><td>80948</td><td>构建 hM3Dq-T2A-ZsGreen 的原始质粒</td></tr><tr><td>AAVS1-CAG-hM4Di-T2A-ZsGreen</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>基于 #80947 构建的供体质粒</td></tr><tr><td>AAVS1-CAG-hM3Dq-T2A-ZsGreen</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>基于 #80948 构建的供体质粒</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Invitrogen</td><td>A11105-01</td><td>用于细胞消化</td></tr><tr><td>AMAXA Nucleofector</td><td>Lonza</td><td>AAD-1001S</td><td></td></tr><tr><td>阿扑吗啡</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4393</td><td></td></tr><tr><td>人工脑脊液 (ACSF)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>125 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 2 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 1.25 mM NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 1 mM MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 25 mM 葡萄糖, 以及&amp;nbsp; 26 mM NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>抗坏血酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1043003</td><td></td></tr><tr><td>B-27 添加剂</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Peprotech</td><td>450-02</td><td></td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0627</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Yeasen</td><td>53003ES10</td><td></td></tr><tr><td>氯氮平-N-氧化物</td><td>Enzo</td><td>BML-NS105</td><td></td></tr><tr><td>DAPT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5942</td><td></td></tr><tr><td>去甲丙咪嗪&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D3900</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>FGF8</td><td>Peprotech</td><td>100-25</td><td></td></tr><tr><td>GDNF</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s 平衡盐溶液 (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>人白血病抑制因子 (hrLIF)</td><td>Millipore</td><td>LIF1010</td><td></td></tr><tr><td>冰冻细胞内液</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>130 mM K-葡萄糖酸盐, 16 mM KCl, 0.2 mM EGTA, 2 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 10 mM HEPES, 4 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-ATP, 0.4 mM Na3-GTP, 0.3% 神经生物素</td></tr><tr><td>KnockOut 血清替代物</td><td>Gibco</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>层粘连蛋白</td><td>Roche</td><td>11243217001</td><td></td></tr><tr><td>微电极拉制仪</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>N-2 添加剂</td><td>Thermo Fisher</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal-A 培养基</td><td>Gibco</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>非必需氨基酸 (NEAA)</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>pCLAMP 11 软件套件</td><td>Molecular Devices</td><td>N/A</td><td>膜片钳电生理数据采集与分析软件</td></tr><tr><td>第一阶段分化培养基</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>96% DMEM/F12 (Gibco, 11320-033), 1% B-27 添加剂, 1% N-2 添加剂, 1% NEAA, 1% GlutaMax, 1 &amp;micro;M SAG1, 以及 100 ng/mL FGF8&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>第二阶段分化培养基&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>96% DMEM/F12 (Gibco, 11320-033), 1% B-27 添加剂, 1% N-2 添加剂, 1% NEAA, 1% GlutaMax, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL GDNF, 1 ng/mL TGF-&amp;beta;III, 10 &amp;micro;M DAPT, 0.2 mM 抗坏血酸, 以及 0.5 mM cAMP</td></tr><tr><td>聚-D-赖氨酸氢溴酸盐 (PDL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7886</td><td></td></tr><tr><td>基因分型引物</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>插入正向引物：TCTTCACTCGCTGGGTTCCCTT；&lt;br/&gt; 插入反向引物：CCTGTGGGAGGAAGAGAAGAGGT；&lt;br/&gt; 纯合子正向引物：CGTCTCCCTGGCTTTAGCCA；纯合子反向引物：GATCCTCTCTGGCTCCATCG</td></tr><tr><td>pX458</td><td>Addgene</td><td>152199</td><td></td></tr><tr><td>SAG1</td><td>Enzo</td><td>ALX-270-426-M01</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Yeasen</td><td>53004ES50</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖型人工脑脊液 (s-ACSF)</td><td></td><td></td><td>234 mM 蔗糖, 2.5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1.25 mM NaH2PO4, 11 mM D-葡萄糖, 0.5 mM CaCl2, 以及 10 mM MgSO4</td></tr><tr><td>干细胞培养基</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>&amp;nbsp;48% DMEM/F12 (Gibco, 11330-032) 和 48% Neurobasal，添加 1% B27, 1% N2, 1% NEAA, 1% GlutaMax, 10 ng/mL hrLIF, 2 &amp;micro;M SB431542, 以及 3 &amp;micro;M CHIR99021</td></tr><tr><td>TGF-&amp;beta;III</td><td>Peprotech</td><td>100-36E</td><td></td></tr><tr><td>移植缓冲液</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>含 5 g/L D-葡萄糖、100 ng/mL BDNF、100 ng/mL GDNF 和 0.2 mM 抗坏血酸的 HBSS 缓冲液</td></tr><tr><td>振动切片机</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>全细胞膜片钳系统</td><td>Molecular Devices</td><td>&amp;nbsp;MultiClamp700B</td><td></td></tr></tbody></table>

化学遗传学调控重编程干细胞来源的前体细胞在治疗神经退行性疾病中的应用

Chemogenetic Regulation in Reprogrammed Stem Cell-derived Precursor Cells in Treating Neurodegenerative Diseases

将仅由设计药物激活的设计受体（DREADD）与基于干细胞的疗法相结合，为实现精确的神经元调控提供了一种先进的策略。在此研究中，我们利用CRISPR技术改造的人类重编程干细胞，使其表达兴奋性（hM3Dq）或抑制性（hM4Di）DREADD受体，以评估在帕金森病（PD）小鼠模型中移植的多巴胺能前体细胞的功能整合与调控能力。关键步骤包括构建非融合型DREADD表达干细胞系，将其分化为中脑多巴胺能前体细胞，并将这些细胞移植至6-羟基多巴胺（6-OHDA）损毁小鼠的纹状体中。我们通过行为学评估和电生理记录分析移植细胞的作用效果。行为学测试（如圆筒实验）显示，在给予氯氮平-N-氧化物（CNO）后，运动功能出现显著调控：激活hM4Di可减少对侧前肢运动，而激活hM3Dq则与运动行为增强相关。电生理记录揭示了不同的突触反应：hM4Di激活使自发性兴奋性突触后电流（sEPSCs）的事件间歇延长、峰值幅度降低；而hM3Dq激活则使事件间歇缩短、峰值幅度升高，反映出兴奋性信号增强。综上所述，结合行为学与电生理评估，验证了经化学重编程的工程化干细胞能够精确地整合入宿主神经回路并发挥功能。

图1展示了该方法学的关键步骤，即利用表达兴奋性（hM3Dq）或抑制性（hM4Di）DREADD受体的工程化人重编程干细胞，在帕金森病（PD）小鼠模型中评估所衍生的多巴胺能前体细胞的功能性整合与调控。图2概述了通过CRISPR/Cas9介导的基因敲入策略，将非融合型hM4Di-T2A-ZsGreen和hM3Dq-T2A-ZsGreen构建体导入重编程干细胞，并通过基因型鉴定进行验证。
图3 表征了化学遗传学调控对移植细胞功能及突触效应的影响。我们通过行为学评估和电生理记录分析了移植的DREADD细胞的作用效果。 图3A 显示了在生理盐水、CNO及CNO洗脱后条件下，对照组、hM4Di组和hM3Dq组在圆筒实验中对侧前肢运动结果的统计分析。CNO给药后，hM4Di移植动物的对侧前肢使用减少，而hM3Dq组的运动表现较生理盐水对照组增强。 <stron...

本文介绍了一种工程化化学重编程干细胞的方案，通过将这些细胞分化为多巴胺能前体细胞，移植到帕金森病小鼠模型中，并评估其行为学和电生理学结果，以验证移植细胞的成功整合及其功能有效性。

将仅由设计药物激活的设计受体（DREADD）与基于干细胞的疗法相结合，为……提供了一种先进的策略。

我们的研究致力于阐明神经退行性疾病的致病机制，同时整合先进技术，开发可用于临床的高效细胞治疗技术。近期工作中，我们在帕金森病小鼠模型中移植了经化学遗传学修饰的干细胞。我们利用设计药物调控特定细胞的神经元活性，并结合电生理监测与行为学评估。我们主要采用CRISPR技术进行基因工程改造，利用电生理学监测神经活动，并通过行为学检测评估帕金森病模型中的功能恢复情况。在基于干细胞的神经退行性疾病治疗中，移植物细胞的效率取决于其正确的定位、存活能力及其对宿主组织的功能性贡献。细胞活动失控可能导致包括肿瘤发生在内的不良后果。利用人类重编程干细胞和驱动神经元技术，可通过给予设计药物CNO精确调控神经元活动。[讲师] 首先，将50至100纳克线性化载体、片段一和片段二以1:3:3的摩尔比与2X克隆混合液轻柔混匀。在55摄氏度孵育一小时，以通过Gibson组装法促进同源重组。将靶向AAVS1位点的引导RNA插入PX458载体的BBS1位点。将重编程的干细胞维持在培养基中，目标细胞密度为每毫升200万至500万个细胞。现在，将200万至500万个细胞、每种供体质粒各2微克以及2微克GRNA质粒加入100微升电穿孔缓冲液中混匀。将细胞与质粒混合物转移至电穿孔杯中进行电穿孔。接下来，将电穿孔后的细胞转移至预先包被多聚-D-赖氨酸和层粘连蛋白的六孔板中。每孔加入约50万个细胞，并加入2毫升培养基。电穿孔72小时后，使用流式细胞仪分选荧光阳性细胞。使用FITC通道配置分选仪以检测ZsGreen。将未经处理的诱导性神经干细胞作为阴性对照，以确定基础荧光水平。将单个ZsGreen阳性细胞接种至预先包被多聚-D-赖氨酸和层粘连蛋白的96孔板中，每孔加入200微升培养基。维持培养7至14天。使用配备绿色荧光蛋白滤光片组的倒置荧光显微镜分离表现出荧光的单克隆。在将阳性细胞扩增至包被的48孔板后，将其分为两部分，一部分用于继续培养，另一部分用于基因型鉴定。从候选克隆中提取基因组DNA。使用两对引物配制PCR反应体系：一对用于确认目的基因的插入，另一对用于区分纯合子与杂合子克隆。消化细胞，用PBS洗涤，并在250 × g离心3分钟。对麻醉动物进行单侧立体定位注射，向右侧纹状体靶区注射3微升浓度为每微升5微克的6-羟基多巴胺。手术四周后，使用生理盐水溶解的0.5毫克/毫升溶液，按每公斤体重1毫克的剂量腹腔注射阿扑吗啡，以验证损伤效果。向帕金森病小鼠模型立体定位注射4微升制备好的细胞悬液。在细胞移植后的多个时间点进行圆筒实验。将一个直径20厘米、高30厘米的玻璃烧杯放置在平坦无反光的表面上。然后，在圆筒正上方架设俯视摄像机，以完整捕捉其直径范围。将每只小鼠置于圆筒中心，并开始同步录像，每次持续三分钟。实验结束后，将小鼠放回其原饲养笼。在三分钟实验期间评估小鼠的上肢运动行为。计算受损前肢接触筒壁的次数占双侧前肢总接触次数的比例。通过腹腔注射给予生理盐水或氯氮平N-氧化物（Clozapine N-oxide），剂量为每公斤体重1.2毫克。再次进行圆筒实验，以评估给予氯氮平N-氧化物后帕金森病小鼠模型的行为调节情况。从麻醉动物体内取出脑组织后，立即将其置于冰上预冷的蔗糖基人工脑脊液中，以保持细胞完整性。使用振动切片机将脑组织切成300至400微米厚的切片。调节气体输入参数，使环境与34摄氏度下95%氧气和5%二氧化碳平衡。将脑切片转移至充满人工脑脊液的孵育室中。用冰冻的细胞内液填充玻璃移液管，确保电极电阻在7至10兆欧之间。将切片置于浸没式记录室中，以每分钟2毫升的速度持续灌注含氧人工脑脊液，温度维持在34摄氏度。在红外微分干涉差显微镜下，使用电动显微操作器定位移液管。通过轻柔抽吸建立全细胞记录模式，使神经元封接电阻大于1吉欧。使用膜片钳放大器将细胞钳制在-70毫伏，以10千赫兹采样率记录8分钟的基础自发性兴奋性突触后电流。在完成基础记录后，立即向记录室中加入50微摩尔的氯氮平N-氧化物。继续记录16分钟，监测自发性兴奋性突触后电流频率或振幅的变化。最后，通过更换为新鲜人工脑脊液进行洗脱，继续记录以评估突触活动的恢复情况。使用氯氮平N-氧化物进行化学遗传学调控后，与生理盐水处理组相比，移植hM4Di细胞的小鼠对侧前肢运动减少，而移植hM3Dq细胞的小鼠前肢运动增加，表明实现了双向行为控制。电生理记录显示，移植hM4Di细胞的小鼠其自发性兴奋性突触后电流的间隔更长、峰值振幅更小，而移植hM3Dq细胞的小鼠则间隔更短、振幅更大，提示突触活动分别受到抑制和增强。免疫荧光分析证实，移植的hM4Di和hM3Dq细胞在体内表达了酪氨酸羟化酶和ZsGreen，支持移植物成功整合。

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Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

重编程干细胞衍生前体细胞的化学遗传学调控治疗神经退行性疾病

皮层神经发生：从实验室进展到细胞治疗的转化

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造血祖细胞直接重编程为神经干细胞

来源：Sharma, A. D., et.al. 用于神经保护策略中治疗因子递送的成体干细胞的高通量表征。J. Vis. Exp.

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成年成人成纤维细胞的分离及其直接转化为可扩增的神经前体细胞

直接神经元重编程生成的神经元可保持起始体细胞的年龄特征。本文介绍了一种基于单载体的方法，用于从成年人类供体获取的皮肤成纤维细胞中诱导生成神经元。...

由成人皮肤成纤维细胞简单高效地生成诱导神经元的高产率培养方法

本方案介绍了通过仙台病毒感染将外周血单个核细胞重编程为诱导性神经干细胞，将iNSCs分化为多巴胺能神经元，将多巴胺能前体细胞移植到单侧损毁的帕金森病小鼠模型，并评估iNSC来源的多巴胺能前体细胞用于帕金森病治疗的安全性和有效性。...

从外周单个核细胞生成诱导性神经干细胞及其向多巴胺能神经元前体细胞的分化用于移植研究

我们提出一种无需基因改造（非转基因）的方法，通过重编程外周血细胞获得具有神经元表型的细胞。激活与一种新型人源GPI锚定蛋白相关的信号通路，揭示了一种高效、非转基因获取人多能干细胞的方法。...

无转基因方法生成血液来源神经元细胞

我们描述了一种将人皮肤来源的成纤维细胞重编程为诱导性神经前体细胞（iNPCs），并进一步将其分化为诱导性星形胶质细胞（iAs）的实验方案。该方法可快速、可重复地大量生成iNPCs和iAs。...

利用成纤维细胞直接转化为神经祖细胞并分化为星形胶质细胞的体外神经疾病建模

通过神经元编程方法获得的人多能干细胞来源的GABA能神经元移植，可能成为治疗神经发育障碍的一种潜在治疗策略。本方案描述了将人干细胞来源的GABA能神经前体细胞生成并移植至新生小鼠脑内的方法，可用于对移植物神经元进行长期研究，并评估其治疗潜力。...

将人干细胞来源的GABA能神经元移植至出生后早期小鼠海马以缓解神经发育障碍

学习利用化学遗传学重编程干细胞分化为多巴胺能前体细胞，通过CRISPR基因编辑和电生理记录，在小鼠帕金森病模型中评估移植细胞的功能整合与行为恢复效果。

化学遗传学调控重编程干细胞来源的前体细胞在治疗神经退行性疾病中的应用

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