Name: 用于复杂粪便群落连续培养的生物反应器组件 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: 学习组装微型生物反应器阵列用于复杂粪便群落的连续厌氧培养。该方法可在受控条件下培养微生物群落，支持平行实验以快速研究细菌代谢物对癌症治疗的影响。

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作者感谢Josee Gauthier在16S rRNA基因测序方面的协助。本研究部分得到了佛罗里达大学健康癌症中心基金（C.J.）和佛罗里达大学医学院Gatorade基金（C.J.）的支持。R.Z.G.由佛罗里达大学健康癌症中心基金资助。R.C.N.由佛罗里达大学国家卫生研究院TL1培训项目（TL1TR001428，UL1TR001427）、美国国家卫生研究院国家癌症研究所团队型跨学科癌症研究培训项目（T32CA257923）以及佛罗里达大学健康癌症中心资助。本出版物中报告的研究由佛罗里达大学健康癌症中心支持，该中心部分资金来自州政府拨款&#8239;佛罗里达州法规 § 381.915 及&#8239;美国国立卫生研究院下属的国家癌症研究所，资助号P30CA247796。本内容完全由作者负责，不代表美国国立卫生研究院或佛罗里达州的官方观点。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定以及稿件撰写过程中均未发挥任何作用。

本研究中使用的粪便样本来自经佛罗里达大学（UF）机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准的实验，并在UF动物照护设施中进行（IACUC方案编号：IACUC202300000005）。简言之，将混合性别的无菌野生型（GF WT；C57BL/6）小鼠（由UF动物照护服务部无菌动物部在隔离器中繁育并维持）从繁殖用隔离器转移至ISOcage P 生物排外系统，以便进行微生物操作。将来自人类供体粪便的等量菌落形成单位（CFU）混合后灌胃给予小鼠。接种后两周，从小鼠无菌采集粪便样本，用于储存及本方案后续使用。
注意：此处描述的粪便样本采集和制备仅作为正确操作流程的示例，因为根据所采集样本的类型（人类、小鼠或其他动物）以及样本的储存方式，该流程可能存在显著差异。研究人员应参考相关文献，根据自身研究需求设计适合的粪便样本采集与保存方案。
1. 粪便样本的常规制备及 -80 °C 保存
<ol>
	<li>选择一种厌氧存活保存培养基（此处使用 Cary Blair 培养基）。在生物安全柜中，将 1 mL 保存培养基分装至无菌的 2 mL 螺口管中，然后转移至厌氧培养箱。</li>
	<li>在接收粪便样本前，确保所有用品（经高压灭菌的刮勺、无菌生理盐水以及含有保存培养基的螺口冻存管）已在厌氧培养箱中预还原 24 小时。</li>
	<li>在生物安全柜中使用无菌 snap-cap 管、高压灭菌的粪便收集杯和镊子，无菌采集小鼠粪便样本。采集后立即用液氮速冻样本管。</li>
	<li>立即将样本连同便携式天平一起转移至厌氧培养箱进行称重。预先称量每根试管。对于小鼠粪便样本，可将单个粪便颗粒按管分装。若使用人源样本，则用无菌刮勺搅拌每个样本，并将其均等分装至冻存管中。重新称量每根试管后，按估计 1:10 的粪便与培养基质量比（质量:质量）向每管加入保存培养基，以实现最佳保存效果。 
	注意：建议在采集后立即对粪便样本进行厌氧保存。未立即保存的样本相比新鲜保存的样本可能出现存活率下降、组成改变等情况6,7,8。Cary Blair 保存培养基可在抑制进一步生长的同时维持细菌群落的存活能力，并可于 -80 °C 下长期保存。关于保存培养基与粪便的比例，尽管粪便样本的湿重变异较大，但该质量比是目前最合理的估算值。</li>
	<li>标记、密封，将冻存管从厌氧培养箱中取出，用液氮速冻后，于 -80 °C 保存一年或更长时间。</li>
</ol>
2. 构建6孔反应器阵列
<ol>
	<li>使用CAD文件（补充文件1）进行6孔反应器的3D打印。该文件可提交至任何3D打印公司进行生产。选用类ABS透明塑料作为打印材料，以便透过反应器观察内部情况，同时具备耐受多次高压灭菌循环的能力。 
	注意：我们委托通过立体光刻技术使用类ABS透明塑料制造6孔反应器阵列。建议在生产过程中将阵列倾斜（即以30%-45%的角度进行3D打印），以减少尺寸误差。此调整将导致阵列表面出现对角线方向的可见层纹，但不会影响反应器的性能。</li>
	<li>使用25-28 mm的丝锥工具，在反应器阵列的每个开口处加工螺纹。</li>
	<li>从1/8英寸PTFE管上切割12段25 mm长的管段，并将每段管的一端插入公端鲁尔接头转25-28螺纹接头的螺纹开口中。将这些接头牢固地拧入阵列上指定的废液和取样孔（图2B）。 
	注意：可使用剃刀刀片轻轻削切管端，使其呈锥形，以更便于插入。</li>
	<li>将微型搅拌子插入每个反应器孔中，然后将公端1/4-28螺纹接头拧入每个反应器孔的进液孔（图2B）。</li>
	<li>将母端鲁尔转1/8英寸软管接头适配器拧入每个反应器孔进液和废液通道的1/4-28螺纹接头中（图2C）。</li>
	<li>将母端鲁尔转3/32英寸软管接头适配器拧入每个反应器孔取样口的1/4-28螺纹接头中。在3/32英寸软管接头适配器上放置橡胶隔垫，并将顶部翻折覆盖（图2C）。</li>
	<li>按照以下长度，从E-LFL 2.06 mm管材上切割两组用于废液和进液管线的管段：14 cm、15.25 cm、16.5 cm、17.75 cm、19 cm和20.25 cm。 
	注意：可在管段中段缠绕彩色标签胶带，以区分不同长度的管段。</li>
	<li>将E-LFL 2.06 mm管连接至母端鲁尔1/8英寸软管接头适配器，用于进液和废液连接（图2D）。使用热水处理管材，使其更易弯曲。这将有助于管材顺利套接到接头。</li>
	<li>在管的另一端连接带锁环的公端鲁尔转1/8英寸软管接头适配器。再将母端鲁尔转1/16英寸软管接头适配器拧入该接头中（图2D）。</li>
	<li>将相应尺寸的双通道管连接至对应的废液和进液接口。废液管线使用内径1.14 mm的双通道管，进液管线使用内径1.02 mm的双通道管。在双通道管的另一端，连接另一个母端鲁尔转1/16英寸软管接头适配器（图2D）。</li>
	<li>切割20段5 cm长的E-LFL 2.06 mm管，并在每段管的两端安装带锁环的公端鲁尔转1/8英寸软管接头适配器。将其中一端通过该适配器连接至每段双通道管末端未使用的母端鲁尔转1/16英寸软管接头适配器。对剩余19段管重复此操作（图2D）。</li>
	<li>使用母端鲁尔三通接头的两端，连接第1和第2号反应器孔的E-LFL 2.06 mm进液管。将一段两端均装有带锁环公端鲁尔转1/8英寸适配器的5 cm管连接至三通中间出口，通向第二个三通连接点（图2E）。</li>
	<li>将第三个反应器的E-LFL 2.06 mm进液管连接至第二个三通的另一侧。在一端连接一段带锁环公端鲁尔转1/8英寸适配器的5 cm管，另一端则连接带锁环的母端鲁尔转1/8英寸适配器。对第4、5和6号反应器采用相同模式连接（图2E）。</li>
	<li>取一段25 cm长的E-LFL 2.06 mm管，在一端安装带锁环的公端鲁尔转1/8英寸软管接头适配器，用于连接最后一个剩余的母端鲁尔三通接头；在另一端安装母端鲁尔转1/8英寸软管接头适配器，并用铝箔封口（图2E）。 
	注意：在操作过程中，必须保持开放端无菌，因此建议在高压灭菌期间用铝箔封住开口，并用胶带固定。</li>
	<li>按照步骤2.12–2.14中所述进液管线的相同程序，准备废液管线（图2E）。</li>
	<li>组装废液收集瓶时，先将一个双孔瓶盖松松地旋在2 L的瓶子上。将两个公端1/4-28螺纹接头插入瓶盖的两个孔中。将母端鲁尔转1/8英寸软管接头适配器连接至瓶盖中未连接预装PTFE管的螺纹接头（图2F）。</li>
	<li>接着，切割一段5 cm长的E-LFL 2.06 mm管，将其连接至瓶上的软管接头。在该5 cm管的另一端连接带锁环的公端鲁尔转1/8英寸软管接头适配器，并用铝箔覆盖（此管作为通气管；高压灭菌后将加装0.22 µm注射器滤器以防止污染；图2F）。</li>
	<li>用铝箔完全覆盖整个瓶盖。使用慢排气程序（通常用于液体）在121 °C、至少15 psi条件下对反应器和废液瓶进行45分钟高压灭菌。待反应器冷却后，拧紧接头和铝箔密封，然后将其置于厌氧培养箱中48小时，再投入使用。</li>
</ol>
3. MEGA 培养基的配制
<ol>
	<li>根据补充表1、补充表2、补充表3、补充表4、补充表5、补充表6、补充表7、补充表8配制所有储备溶液。</li>
	<li>在一个2 L的玻璃瓶中，加入补充表9中的所有干燥成分，随后加入1640 mL超纯水，再加入补充表10中的其余液体成分。放入搅拌子，在搅拌器上中等加热（90 °C）使其完全溶解。培养基颜色将呈淡蓝色至紫色，不会完全透明，但不应有明显未溶解的颗粒。 
	注意：在肽类存在下对葡萄糖及其他糖类进行高压灭菌可能导致其发生修饰，并降低培养基中可利用的糖含量。如需要，所有糖溶液均可通过无菌过滤方式加入，并与补充表10中的其他组分一同添加，具体操作见步骤3.7。</li>
	<li>待溶液充分混合后，逐滴加入10 N氢氧化钠（NaOH）调节培养基pH至7.0，并准确记录所加体积。完成pH测定后，加入14.4 mL减去所加氢氧化钠体积的水，使总体积精确达到2 L。</li>
	<li>准备一个双孔瓶盖，在两个开口中均插入带有1/4-28 mm螺纹的公鲁尔接头。</li>
	<li>在瓶盖未预先连接聚四氟乙烯（PTFE）管的孔中，截取一段5 cm长的C-flex管，将其连接至母鲁尔接头的1/8英寸软管接头处。在5 cm管的另一端插入另一个带锁环的公鲁尔接头和1/8英寸软管接头适配器，并用铝箔包裹（该端后续将连接0.22 µm注射器滤器）。</li>
	<li>用铝箔完全包裹整个瓶盖，并旋紧于2 L MEGA培养基瓶上。在121 °C、至少15 psi条件下，使用液体慢速排气程序高压灭菌45分钟。</li>
	<li>从高压灭菌器中取出培养基，在搅拌条件下冷却至温热。在生物安全柜中将补充表10中的各组分加入2 L培养基瓶中，密封瓶盖后转移至搅拌器上混匀。待培养基完全冷却后，拧紧接头并密封铝箔，将其置于厌氧室中静置48小时后再使用。 
	注意：我们建议源泵流速设为16 µL/min（0.94 mL/h），以实现16小时的滞留时间。在此流速下，一个6孔反应器每天大约消耗0.135 L培养基。我们还建议废液泵流速设为40 µL/min，以防止废液管路发生堵塞。请持续监测管路及流速情况，若出现堵塞，可酌情提高废液流速。源液和废液流速均可调整，但研究人员应密切监测菌群组成和生长速率，因为流速变化可能会影响这些参数。若运行一个6孔反应器一周，建议至少配制2 L培养基（实际消耗略高于1 L）。</li>
</ol>
4. 厌氧室中阵列的设置
注意：组装前，必须使用3%过氧化氢清洁超净台内部及超净台手套，随后用三蒸水冲洗，以确保无表面污染。若在移除铝箔后迅速完成连接操作，且未直接接触接头内部和厌氧舱手套内表面，则污染风险极低。
<ol>
	<li>在厌氧培养箱内，将阵列置于磁力搅拌器上方并对齐。通过将搅拌器控制器调至最高速度（1600 rpm）并观察搅拌子转动，确保阵列位置正确。</li>
	<li>将双止位管路安装到对应蠕动泵的夹具上，分别用于进样端和废液端。如果在计划使用前不足24小时进行此操作，请将夹具锁紧；否则，应保持松动状态直至使用前，以减少管路磨损。</li>
	<li>取下进样管路和废液管路上的雌性鲁尔接头 × 1/8英寸软管接头适配器的铝箔盖帽，并将其拧入已旋紧在瓶盖上的雄性鲁尔转1/4-28螺纹接头中（确保该开口连接至内部的PTFE管路）。</li>
	<li>取下铝箔盖帽，并在进样瓶的5 cm通气管路和废液瓶的通气管路上各连接一个0.22 µm注射式滤器。</li>
	<li>以中等流速开始流动（进样泵设为1 mL/min，废液泵设为2 mL/min），开始向反应器中填充培养基。确保每个反应器孔中的废液管位置低于进样管，以防止各孔过度填充或排空。</li>
	<li>当反应器开始填充时，确保所有反应器达到相同体积，并且培养基流入废液管路。根据此处描述的参数，每个反应器的工作体积为15 mL。 
	注意：若个别反应器未能正常填充，请拧紧任何松动的接头，并检查进样管路是否存在异常，必要时更换为备用管路。若问题持续存在，可更换进样瓶。若反应器内液面高于内部废液管高度，请检查反应器废液口内部的PTFE管是否仍处于正确位置。</li>
	<li>当每个反应器完成填充后，调节泵的流速至16 µL/min，随后关闭泵。</li>
	<li>在接种前，让培养基在反应器和废液瓶中静置过夜。这可使培养基进一步进行厌氧预处理（总计约72小时），并允许操作者确认系统的无菌状态。</li>
	<li>在接种粪便样品前，为确认系统无菌性，应在初次填充后（步骤4.7）以及步骤4.8完成后，分别对每个反应器及进样培养基进行取样。请遵循步骤6中所述的反应器无菌取样程序。
	<ol>
		<li>确保所有样品的光密度值与进样培养基一致；若观察到光密度升高，则提示可能存在污染，应拆解整个系统，清洗并重新组装所有培养基和装置。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 粪便样本接种
<ol>
	<li>将无菌宽口移液器吸头、无菌生理盐水、50 mL 圆底离心管、25 mL 无菌刻度移液管、5 mL 注射器和 16 号针头放入厌氧培养箱中，在厌氧环境中平衡至少 24 小时。</li>
	<li>计算接种所需反应器数量所需的粪便材料量。每个反应器孔需要 3.8 mL 上清液，来自 25% m/v 的粪便悬液。对于六个反应器孔，总共需要 22.8 mL 的 25% m/v 粪便悬液，以提供足够的上清液用于接种，这需要 5.7 g 固体粪便物质。</li>
	<li>将保存在冻存管中的粪便样品转移至厌氧培养箱中，并使其解冻 15 分钟。</li>
	<li>使用宽口移液器吸头将粪便材料从冻存管转移至一个 50 mL 圆底离心管中，密封后在 200 × g 条件下离心 5 分钟，使颗粒物沉淀。</li>
	<li>将样品重新放回厌氧培养箱中，去除上清液。使用经高压灭菌的实验铲将粪便固体转移至一个新的 50 mL 圆底离心管中，总质量达到 5.7 g。向管中加入 17.1 mL 厌氧无菌生理盐水，并紧密密封。</li>
	<li>将离心管从培养箱中取出，涡旋振荡 5 分钟以均质化，然后在 200 × g 条件下离心 5 分钟，使颗粒物沉淀。</li>
	<li>在样品离心过程中，使用含 10% 次氯酸钠的实验室擦拭巾对每个反应器顶部的隔膜进行消毒，至少作用 2 分钟。</li>
	<li>将样品重新放回厌氧培养箱中，使用无菌刻度移液管将上清液转移至新的 50 mL 圆底离心管中。</li>
	<li>使用 16 G 1.5 英寸针头，将 3.8 mL 粪便悬液上清液分别装入六个独立的 5 mL 注射器中。</li>
	<li>移除擦拭巾，将针头穿过隔膜，缓慢将粪便悬液注入反应器中。</li>
	<li>在开始向反应器供液前，让粪便微生物群落在每个反应器中定植约 16–18 小时。从注入粪便悬液时起，将磁力搅拌器调至最高速度（1600 rpm）。</li>
</ol>
6. 反应器孔中样品的无菌采集
<ol>
	<li>用无菌的1 mL注射器和无菌的22G 3英寸针头各六个，刺穿其包装，并将它们放入厌氧室中脱气24小时。</li>
	<li>采样前立即使用含10%次氯酸钠的实验室擦拭巾对每个反应器顶部的隔垫进行消毒，至少作用2分钟。</li>
	<li>移除擦拭巾后，立即将一根针头连接至注射器，并将针头插入第一个反应器孔的隔垫中心位置。</li>
	<li>吸取1 mL样品，将针头从隔垫中取出，然后将注射器中的样品转移至预先标记的1.7 mL离心管中，用于后续实验。橡胶隔垫在针头拔出后会自动重新密封。每个反应器孔均需使用新的针头和注射器，以防止交叉污染。</li>
	<li>如需获取上清液，将离心管从厌氧室中取出，在20,000 × g 条件下离心1分钟，使菌体沉淀。</li>
	<li>将上清液转移至另一个单独标记的1.7 mL离心管中，并在-80 °C下保存。</li>
</ol>
7. 拆卸和清洗微型生物反应器系统
<ol>
	<li>断开源瓶与源端鲁尔三通接头的连接，调高流速（源泵流速设为 1 mL/min，废液泵流速设为 2 mL/min），开始排空管路。确保管路完全排空后，关闭搅拌板。</li>
	<li>管路排空后，断开废液瓶与废液端鲁尔三通接头的连接。随后，将反应器组件放入厌氧室气闸中，并从厌氧室内取出。</li>
	<li>拆下所有 E-LFL 2.06 mm 管路和 PTFE 管路段并予以废弃。拆下所有接头并将其放入 10% 次氯酸钠溶液中。</li>
	<li>从每个阵列孔中取出微型搅拌子，并将其放入次氯酸钠溶液中。将反应器阵列倒置，使培养基排入另一份 10% 次氯酸钠溶液中进行消毒。随后，将空的阵列完全浸入新鲜的次氯酸钠溶液中。</li>
	<li>让所有接头和反应器阵列在 10% 次氯酸钠溶液中浸泡 30 分钟（延长浸泡时间可能导致变色）。</li>
	<li>用去离子水冲洗接头和反应器阵列，然后根据制造商说明，将其在酶洗涤剂溶液中浸泡过夜。</li>
	<li>用去离子水对接头和反应器阵列进行三次冲洗，然后至少静置晾干 3 天，确保完全干燥。干燥后，反应器阵列和接头可再次用于组装。</li>
</ol>

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<li>Gościniak, A., Eder, P., Walkowiak, J., Cielecka-Piontek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+gastrointestinal+models+for+nutraceuticals+research-achievements+and+challenges%3A+A+practical+review%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Artificial gastrointestinal models for nutraceuticals research-achievements and challenges: A practical review.</a> Nutrients. 14 (13), 2560(2022).</li>
<li>Marrero, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut-on-a-chip%3A+Mimicking+and+monitoring+the+human+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Gut-on-a-chip: Mimicking and monitoring the human intestine.</a> Biosens Bioelectron. 181, 113156(2021).</li>
</ol>

作者无利益冲突。

本方案中描述的微型生物反应器系统能够实现独立粪便菌群的培养，从而进行平行实验。这种在排除宿主因素干扰的情况下研究微生物群落的能力，是理解微生物适应环境内在潜力的重要方法。如需要，该方案可轻松调整用于定义细菌群落甚至单一分离菌株的培养。本文所述的MEGA培养基是一种富含营养的厌氧液体培养基，专为培养难养厌氧微生物而设计，但培养基的选择可能是影响菌群组成最重要的因素。因此，研究者在设计实验前应仔细考虑培养基的选择。在本系统及其他系统中，已有多种其他类型的培养基成功应用，包括BRM、BDM和强化梭菌培养基4。
意义与潜在应用 
微型生物反应器系统是一种独特的工具，可用于研究药物、膳食成分及其他处理方式对微生物群的影响，或反之研究微生物群对这些因素的影响。这些成分可接种于起始培养基中，或直接注入反应器孔内，随后进行代谢组学和分类学分析。一种潜在的实验应用是利用噬菌体扰动细菌群落，以确定其对特定宿主的选择性，或评估该宿主缺失后对群落的后续影响。此外，可将对宿主具有靶向作用但对微生物群影响未知的药物加入...

肠道微生物群是由细菌、真菌、古菌和病毒组成的庞大微生物网络，其拥有的遗传和代谢能力远超人类宿主自身所含的基因组1。微生物组丰富的代谢能力包括：细菌对膳食营养物质加工产生的代谢物、宿主代谢物经细菌化学修饰后的产物，以及仅由微生物群独特合成的代谢物2。微生物群几乎参与宿主所有的生物学过程，同时也与炎症性肠病、癌症、代谢性疾病甚至神经系统疾病等病理状态密切相关2,3。要理解特定微生物或复杂微生物群落在健康与疾病中的作用，关键在于区分微生物群与宿主各自的贡献。实现这一目标的一种方法是使用微生物生物反应器，该装置可在动态条件下培养多种微生物群落。目前市面上已有多种商用生物反应器，可用于几乎任何目的的粪便细菌群落培养，例如大规模生物产物培养，或对特定营养因素进行精确控制以研究代谢过程。然而，这些系统成本极高，需要大量前期准备，且无法同时平行检测多种不同的实验条件。为提供一种更低成本、更灵活且可实现多条件平行实验的简化方法，本文介绍了基于Auchtung等人的研究4所改进的连续流式微型生物反应器阵列的构建与使用方案。
微型生物反应器系统的完整装置如图1A所示。该微型生物反应器系统采用由6个反应器孔组成的阵列，各反应器孔彼此完全独立，并在厌氧环境中通过蠕动流设置，以实现培养基的连续供给与移除（图1A）。每个反应器阵列置于一个60位磁力搅拌板上，配备两台48通道蠕动泵，分别使用双通道管路输送培养基和排出废液（图1A）。厌氧舱配备CAM-12厌氧监测仪用于检测氧气含量，配有加热功能的催化剂盒以去除氧气，以及硫化氢去除柱以吸收细菌代谢产生的过量气体。每个反应器孔均设有培养基进样口、废液出口和取样口，可用于单个反应器孔的接种或取样（图1B）。
如所述，该生物反应器系统能够对温度、培养基消耗和营养物质可利用性进行动态控制，以支持粪便菌群的培养与维持。温度通过具有加热能力的催化盒进行调节，可快速实现整个厌氧腔内温度的变化。培养基消耗由蠕动泵的流速控制，可通过调节流速改变反应器中的培养基更新速率。培养基更新速率可根据反应器中培养的菌群类型进行定制，例如，可针对生长缓慢或生长极为迅速的目标菌株进行调整。最后，可通过各个反应器孔的独立取样口添加组分，从而动态调节营养物质的可利用性。在实验开始时可设定但系统中无法进行动态调控的静态条件包括培养基类型、氧气含量以及同时运行的反应器数量。研究者可根据需要选择任意来源的培养基，尽管本文仅描述了一种培养基，但已有无数其他类型的培养基被成功应用。研究者可在有氧或微需氧条件下运行反应器（取决于是否具备微需氧培养箱）。最后，可根据实验需求设置任意数量的反应器。尽管反应器以每六个为一组排列，但每个反应器独立运行，且可根据需要连接至不同的培养基来源。
该模块化生物反应器系统的完整搭建成本约为 25,000 美元（不包括厌氧室或与厌氧室配套的组件），其中唯一不可重复使用的部分是管路，每次运行的管路更换成本低于 100 美元。该系统基本实现自动化，但仍需每日检查培养基液位，因为培养基储液瓶在用尽后需要更换。此外，所有取样操作必须手动完成，系统中任何动态条件的调整也需手动启动（例如，改变温度）。相较于 Auchtung 等人最初发表的系统方案，本研究进行了若干改进以提升整体性能和实用性4。首先，生物反应器阵列的 3D 打印材料改为类 ABS 透明塑料，以提高系统在反复高压灭菌过程中的结构完整性。其次，替代原方案中 1/8 英寸（3.2 mm）外径的聚四氟乙烯（PTFE）管路，改用 E-LFL 型号、内径 2.06 mm、长度 100 英尺的管路，因其材质更坚固，更耐塌陷，从而避免系统内流路堵塞。最后，新增使用 1/4 - 28 mm 螺纹转带倒刺的公端接头，以减少培养基储液瓶连接处管路滑脱的问题。根据 Han 等人的改良 MEGA 培养基配方，提供了一种成分未定义、复杂且营养丰富的培养基，可支持苛养厌氧微生物的培养5。由于原始配方中的组氨酸-血红素组分已不再商业化供应，本方案对其制备方法进行了替代性调整。同时使用氢氧化钠将培养基 pH 调至 7.0 或任意所需 pH 值。总体而言，该系统成本可控、操作友好、经过优化，是开展连续流培养系统的理想入门选择。
在本方案中，我们详细描述了该微型生物反应器阵列系统的构建过程，包括材料准备、系统的灭菌以及后续用于培养人源化小鼠粪便样本的操作步骤。本方法的总体目标是建立一种可调节且成本效益高的生物反应器系统，可在受控条件下用于培养微生物群落。微型生物反应器系统组装流程的详细示意图见图2，并在方案的相应步骤中予以引用。在本示例中，我们使用来自人源化肠道小鼠的同一样本接种两个反应器，并描述在连续灌注 MEGA 培养基条件下微生物群落的结构。
<img alt="厌氧生物反应器装置，配备 CAM-12 监测仪、磁力搅拌器；硫化氢去除系统。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68035/68035fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：厌氧培养箱内微型生物反应器阵列装置的示意图。（A）厌氧培养箱内组装完成的微型生物反应器阵列装置全貌。六孔生物反应器阵列置于60位磁力搅拌器上。左侧的源路路厄三通网络通过双孔瓶盖与左侧的培养基储液瓶相连。两个蠕动泵分别夹持左侧的源路和右侧的废液路中的双通道管路。右侧的废液路路厄三通网络将废液排入右侧的废液瓶中。厌氧培养箱内围绕反应器阵列系统布置了运行所需的关键设备，包括 CAM-12 监测仪、带加热功能的催化剂盒以及硫化氢去除柱。（B）连接至一个反应器孔的源路、取样口和废液口顶部视图，反应器内培养基处于适当高度。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68035/68035fig1v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="带有鲁尔接头和管路的微流控系统组装示意图；用于流体样品分配的设置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68035/68035fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：微型生物反应器阵列组装流程示意图。（A）微型生物反应器阵列的俯视图，显示了源端口、废液端口和样品端口的方位。（B）微型生物反应器阵列的侧视图，展示本方案步骤 2.3–2.4 的操作过程。将 1/8 英寸 PTFE 管路和接头（1）连接并插入废液端口和样品端口；无 PTFE 管的接头（1）插入源端口。（C）微型生物反应器阵列的侧视图，展示本方案步骤 2.5–2.6 的操作过程。将接头（2）连接至源端口和废液端口；将接头（3）连接至样品端口，并在其上方插入接头（4）。（D）微型生物反应器阵列的侧视图，展示本方案步骤 2.9–2.11 的操作过程。将 E-LFL 2.06 mm 管路连接至源端口和废液端口，另一端依次连接接头（5）和接头（6）。随后将适当直径的双止位管路连接至接头（6）。然后在双止位管路的另一端重复反向连接：接头（6）连接双止位管路，接头（5）再连接至其上。最后，将 E-LFL 2.06 mm 管路连接至接头（5），以便接入鲁尔三通网络。（E）微型生物反应器阵列的俯视图，展示步骤 2.12–2.15 中描述的源端和废液端鲁尔三通网络设置。使用末端带接头（5）的 E-LFL 2.06 mm 管路将每个反应器连接至多个接头（7），最后一个开口连接至源瓶或废液瓶的瓶盖。（F）双孔瓶盖组件的侧视图，对应步骤 2.16–2.17 的描述。瓶盖的一个开口连接插入瓶内的 PTFE 管路，该开口依次插入接头（1）、接头（2），并连接末端带接头（5）的 E-LFL 2.06 mm 管路；该接头连接至源端或废液端鲁尔网络。另一个未连接 PTFE 管路的开口插入接头（1），随后插入接头（2），并连接另一末端带接头（5）的 E-LFL 2.06 mm 管路；该端在高压灭菌时用铝箔封口，以便后续连接无菌 0.22 µM 注射式滤器。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68035/68035fig2v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>1 mL BD Slip Tip 注射器，无菌，一次性使用</td><td>Fisher Scientific</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>1/4-28 mm 螺纹转带倒钩的雄接头（3.2 mm），5个/包</td><td>Cole-Parmer</td><td>008NB32-KD5L</td><td>构建1个6孔阵列需要2包</td></tr><tr><td>10M NaOH（氢氧化钠）</td><td>Sigma</td><td>72068-100ML</td><td></td></tr><tr><td>2.0ml 螺口管，无滚花，带裙边，透明，电子束灭菌管，带附着盖</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-755-228</td><td></td></tr><tr><td>2mag MIXdrive 60 搅拌驱动器</td><td>2mag</td><td>40060</td><td>60位磁力搅拌板（可选加热功能，货号 40260）</td></tr><tr><td>6孔反应器阵列，类ABS透明塑料</td><td>Protolabs</td><td>Custom</td><td>参见补充文件中的.stl文件以进行3D打印</td></tr><tr><td>无水乙醇（200 proof）</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818</td><td></td></tr><tr><td>冰醋酸</td><td>Sigma</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>接头，尼龙材质，雄性鲁尔接头转1/4-28螺纹，25个/包</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45505-82</td><td>构建1个6孔阵列需要6个（1包）</td></tr><tr><td>铝箔</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-213-100</td><td></td></tr><tr><td>厌氧培养箱</td><td>Coy Lab Products</td><td>Type B</td><td></td></tr><tr><td>Bel-Art&amp;nbsp;SP Scienceware Flea Micro Spinbar 磁力搅拌子（1个/包）</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-261679</td><td>构建1个6孔阵列需要6个&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>II级生物安全柜</td><td>Nuaire</td><td></td><td></td></tr><tr><td>丁酸</td><td>Sigma</td><td>B103500&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 &amp;middot; 2H2O（二水合氯化钙）</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>Clorox Healthcare 含氯杀菌湿巾，无香型，6&quot; x 5&quot;，每包150片</td><td>Office Depot</td><td>129202</td><td></td></tr><tr><td>D-(-)-果糖</td><td>Sigma</td><td>F0127-100G</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-纤维二糖</td><td>Sigma</td><td>C7252-100G</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>G8270-100G</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-麦芽糖一水合物</td><td>Sigma</td><td>M5885-100G</td><td></td></tr><tr><td>Drill America Plug Hand Tap DWTP1/4-28</td><td>Home Depot</td><td>305699489</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's 磷酸盐缓冲液，1X，不含钙和镁，无菌</td><td>Genesee</td><td>25-508</td><td></td></tr><tr><td>雌性鲁尔接头 &amp;times; 1/16&amp;Prime; 软管倒钩接头，尼龙材质，25个/包</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45502-00</td><td>构建1个6孔阵列需要24个（1包）</td></tr><tr><td>雌性鲁尔接头 &amp;times; 1/8&amp;Prime; 软管倒钩接头，尼龙材质，25个/包</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45502-04</td><td>构建1个6孔阵列需要6个（1包）</td></tr><tr><td>雌性鲁尔接头 &amp;times; 3/32&amp;Prime; 软管倒钩接头，尼龙材质，25个/包</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45502-02</td><td>构建1个6孔阵列需要6个（1包）</td></tr><tr><td>雌性鲁尔三通接头，尼龙材质，25个/包</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45502-56</td><td>构建1个6孔阵列需要10个（1包）</td></tr><tr><td>FeSO4 &amp;middot; 7H2O（七水合硫酸亚铁）</td><td>Sigma</td><td>F8633</td><td></td></tr><tr><td>血红素</td><td>Sigma</td><td>H3281</td><td></td></tr><tr><td>组氨酸</td><td>Sigma</td><td>H7750</td><td></td></tr><tr><td>异戊酸</td><td>Sigma</td><td>129542</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4 二碱式（磷酸氢二钾）</td><td>Sigma</td><td>P2222-1KG</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4 单碱式（磷酸二氢钾）</td><td>Sigma</td><td>P0662-500G</td><td></td></tr><tr><td>大孔径移液器吸头</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-134</td><td></td></tr><tr><td>L-半胱氨酸盐酸盐</td><td>Sigma</td><td>C1276-10G</td><td></td></tr><tr><td>带锁环的雄性鲁尔接头 &amp;times; 1/8&amp;Prime; 软管倒钩接头，尼龙材质，25个/包</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45505-04</td><td>构建1个6孔阵列需要42个（2包）</td></tr><tr><td>肉浸膏</td><td>Sigma</td><td>70164-500G</td><td></td></tr><tr><td>Med Vet International&amp;nbsp;Exel 针头，20G × 1&quot;，皮下注射，100个/盒，26417</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-209-2532</td><td></td></tr><tr><td>甲萘醌（维生素K3）</td><td>Sigma</td><td>M5625</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&amp;nbsp;&amp;middot; 7H2O（七水合硫酸镁）</td><td>Sigma</td><td>M1880-500G&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q 水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl（氯化钠）</td><td>Sigma</td><td>S9888-500G&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3（碳酸氢钠）</td><td>Sigma</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>Omnifi t Q系列双孔瓶盖</td><td>Cole-Parmer</td><td>00945Q-2</td><td>构建1个6孔阵列需要1个</td></tr><tr><td>PMP IPC-N L 24CHNL 8RLR 115V</td><td>MasterFlex</td><td>ISM939C-115V</td><td>24通道蠕动泵，需各1台用于进样和废液</td></tr><tr><td>Precision Seal&amp;reg; 橡胶隔垫，白色，7 mm 外径玻璃管（100个/包）</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z553905-100EA</td><td>构建1个6孔阵列需要6个隔垫</td></tr><tr><td>丙酸</td><td>Sigma</td><td>P5561&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>泵管，双止口，Tygon S3 E-Lab，内径1.02 mm；12根/包</td><td>VWR</td><td>MFLX96460-28</td><td>构建1个6孔阵列需要6根&amp;nbsp;（1包）</td></tr><tr><td>泵管，双止口，Tygon S3 E-Lab，内径1.14 mm；12根/包</td><td>VWR</td><td>MFLX96460-30</td><td>构建1个6孔阵列需要6根（1包）</td></tr><tr><td>Puritan Cary-Blair 培养基，5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-029-646</td><td></td></tr><tr><td>PYREX 2L 圆形培养基储存瓶，带GL45螺口盖</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-414-1E</td><td></td></tr><tr><td>剃须刀片</td><td>Genesee</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>刃天青钠盐</td><td>ACROS Organics from ThermoFisher</td><td>AC41890-0010</td><td></td></tr><tr><td>可溶性淀粉</td><td>Sigma</td><td>S9765-100G</td><td></td></tr><tr><td>不锈钢微型刮勺，勺状刀头</td><td>Fisher Scientific</td><td>S50823</td><td></td></tr><tr><td>TBNG TYGON ELFL 2.06MMID 100英尺</td><td>VWR</td><td>MFLX06449-42</td><td>构建1个6孔阵列需要205.5 cm</td></tr><tr><td>微量元素补充剂</td><td>ATCC</td><td>MD-TMS</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨（BBL）</td><td>Fisher Scientific</td><td>B11921</td><td></td></tr><tr><td>PTFE管，1/8&amp;Prime;（3.2 mm）外径 &amp;times; 1.5 mm 内径，10 米</td><td>Cole-Parmer</td><td>008 T32-150-10</td><td>构建1个6孔阵列需要300 mm</td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Sigma</td><td>P1754&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>维生素补充剂</td><td>ATCC</td><td>MD-VS</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物（Bacto）</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0127-17-9</td><td></td></tr></tbody></table>

复杂粪便菌群连续培养的生物反应器组装

Bioreactor Assembly for Continuous Culture of Complex Fecal Communities

微生物群，尤其是细菌，会对多种环境暴露因素产生响应，例如微量和宏量营养素、药理学化合物以及炎症介质，这些因素会动态改变菌群组成和微生物的代谢产物。了解生理培养条件如何影响微生物群落及其多样性，以及其代谢能力，将有助于深入认识它们对健康和疾病的影响。本文介绍了一种基于Auchtung等人发表的模板改进而来的实验方案，用于构建微型生物反应器阵列，可在精确控制的条件下（包括营养物质可利用性、温度、流速、pH值和氧气含量）培养复杂的粪便菌群、定义细菌共养群落或单一菌株。我们详细描述了微型生物反应器系统的构建过程，并介绍了对已发表方案中存在局限性的若干改进措施。我们还讨论了在厌氧条件下使用MEGA培养基（改编自Han等人）搭建微型生物反应器系统的方法，该培养基是一种营养丰富的培养基，可支持多种细菌的生长。本文进一步描述了将人源化小鼠粪便样本接种至微型生物反应器系统中的操作流程，以及在系统内建立复杂菌群培养的过程；该系统支持连续流动培养，并可通过无菌取样监测菌群组成的变化。该系统可灵活适应饮食变化及其他培养条件的调整。本文所述技术能够在动态条件下，或在排除宿主来源因素干扰的情况下，对种类多样且难培养的粪便微生物群落进行表征研究。

在接种人粪便悬液2周后，采集小鼠的粪便样本，并于-80 °C保存。使用连续流动的MEGA培养基建立生物反应器系统，设置两个重复的反应器孔（图3A）。根据步骤6所述方案，将小鼠粪便颗粒制备成粪便悬液，并通过进样口将应答小鼠的粪便悬液接种至两个反应器中。粪便菌群在反应器孔中于37 °C静态条件下过夜培养后，重新启动培养基流速，并持续维持6天。在恢复流速后的第1、2、3、4和6天分别采集两个反应器孔的样本，并于-80 °C保存以用于后续分析。
为评估随时间变化及不同重复反应器之间微生物群落组成差异， 100 µL 采用珠磨破碎均质化，随后进行苯酚:氯仿分离及DNeasy Blood提取每份样品中的DNA &amp; 按照制造商的建议，如前所述进行组织试剂盒纯化9,10使用通用Illu...

本方案详细介绍了用于在厌氧条件下进行复杂粪便菌群连续流培养的微型生物反应器阵列的组装方法。我们还讨论了反应器的组装、接种以及取样方法，以便后续分析。

微生物群，尤其是细菌，会对多种环境暴露因素产生响应，例如微量和宏量营养素、药物化合物以及……

我们研究宿主与细菌的相互作用，以及内在和外在因素如何影响健康，重点关注细菌对癌症发生、发展及治疗反应的作用。我们研究了细菌群落在抗PD-1免疫检查点抑制剂中的作用，发现细菌代谢产物可增强抗PD-1治疗的疗效。在体内分离宿主因素对微生物组的影响具有挑战性，因为存在多种影响因素。微生物反应器阵列可对特定过程进行受控研究，从而明确其对微生物群落的直接作用。本方案提供了一种经济高效的方法，可在受控条件下培养粪便菌群，同时使研究人员能够相对快速地并行开展实验。[讲师] 首先，取一个3D打印的六孔反应器阵列。从1/8英寸的PTFE管中截取十二段25毫米长的管条，并用剃刀修整两端。将每段管条的一端插入带有25至28螺纹接头的雄性鲁尔接头的螺纹开口中。将接头牢固地拧入阵列上指定的废液和取样孔中。接着，将微型搅拌子放入每个反应器孔中。将一个雄性1/4-28螺纹接头拧入每个反应器孔的进样孔中。将雌性鲁尔软管接头适配器拧入废液和进样连接的螺纹接头中。然后将雌性鲁尔X转3-32/2英寸软管接头适配器拧入1/4-28螺纹接头中，用于取样口。在软管接头适配器上放置橡胶隔垫，并将顶部翻折覆盖。接下来，为废液和进样管线分别裁剪两组E-LFL 2.06毫米管。使用热水软化管材以便于连接。将管材连接至雌性鲁尔X转1/8英寸软管接头适配器，用于进样和废液连接。现在，在管材另一端固定一个带锁环的雄性鲁尔X转1/8英寸软管接头适配器。再将一个雌性鲁尔X转1/16英寸软管接头适配器拧入其中。将相应尺寸的双止动管连接至对应的进样和废液连接口。然后在管材另一端再固定一个雌性鲁尔X转1/16英寸软管接头适配器。对所有进样和废液接头重复上述步骤后，将一个带锁环的雄性鲁尔X转1/8英寸软管接头适配器连接至一段E-LFL 2管。将一端连接至每段双止动管末端未使用的雌性鲁尔X转1/16英寸软管接头适配器上。对所有进样和废液接头重复此操作后，使用雌性鲁尔T型接头的两端，将第一和第二反应器孔的进样管线E-LFL 2.06毫米管连接起来。然后，在T型接头的中间出口连接一段5厘米长的管，其两端均配有带锁环的雄性鲁尔X转1/8英寸适配器，通向第二个T型接头。现在，将第三个反应器的E-LFL 2.06毫米进样管连接至第二个T型接头的另一侧。连接另一段5厘米长的管段，一端为带锁环的雄性鲁尔X转1/8英寸适配器，另一端为带锁环的雌性鲁尔X转1/8英寸适配器。接着，将一个带锁环的雄性鲁尔X转1/8英寸软管接头适配器连接至一段25厘米长的E-LFL 2.06毫米管的一端。在另一端固定一个雌性鲁尔X转1/8英寸软管接头适配器，并用铝箔封口。为组装废液收集瓶，将一个双孔瓶盖松松地固定在2升瓶上。将雄性1/4-28螺纹接头插入瓶盖的两个孔中。然后，将一个带1/8英寸软管接头的雌性鲁尔适配器连接至瓶盖中未连接预装PTFE管的雄性螺纹接头。将一段5厘米长的E-LFL 2.06毫米管连接至瓶上的软管接头。在管材另一端连接一个带锁环的雄性鲁尔X转1/8英寸软管接头适配器，再用铝箔覆盖。最后，在121°C和15 psi条件下，用铝箔完全包裹整个瓶盖并高压灭菌45分钟。高压灭菌完成后，拧紧接头和铝箔密封，将反应器放入厌氧室中静置48小时后再使用。在厌氧室内，将反应器阵列对准设定为1,600 RPM的磁力搅拌器。然后将进样和废液管线的双止动管安装到相应蠕动泵的夹具中。如果在使用前不到25小时完成此操作，则锁紧夹具；否则保持松动，以减少管材磨损。现在，取下进样瓶的铝箔盖。将接头拧入雄性鲁尔转1/4-28螺纹接头，确保这些开口与瓶盖内部的PTFE管相连。取下铝箔盖，在进样瓶和废液瓶的5厘米通气管上各连接一个0.22微米的注射器滤器。以中等流速开始进液，使反应器开始填充。确保每个反应器孔内的排液管位置低于进样管，以防止过度填充或完全排空。当反应器开始填充时，检查所有孔是否达到相同体积，并确认培养基先进入排液管再流出反应器，以进行过夜脱气。首先，将实验材料转移至厌氧室中静置24小时。在计算所需粪便接种物的量后，将冷冻保存的粪便样本转移至厌氧室，并使其解冻15分钟。使用宽口移液器吸头，将粪便材料从冷冻管转移至一个50毫升锥形管中。将密封的管在200 ×g条件下离心5分钟，使颗粒沉淀。将管重新放回厌氧室，然后移除上清液。使用高压灭菌的实验室刮刀，将5.7克粪便固体转移至一个新的50毫升锥形管中。向管中加入17.1毫升厌氧无菌生理盐水，并紧密密封。现在，将管涡旋振荡5分钟，然后按前述方法进行离心。使用含10%次氯酸钠的实验室擦拭巾对每个反应器顶部的隔垫进行至少两分钟的灭菌处理。将样本重新放回厌氧室后，用移液器将上清液转移至新的50毫升锥形管中。现在，将3.8毫升粪便悬液上清液分别加入六个配有16号1.5英寸针头的5毫升注射器中。从反应器隔垫上移除次氯酸钠擦拭巾。然后将针头穿过隔垫，缓慢向每个反应器中注入3.8毫升粪便悬液，之后让反应器静置过夜。经过16至18小时的孵育后，开始向反应器供液。在注入粪便悬液后，立即将磁力搅拌器调至最高速度。两个重复反应器中的微生物群落组成随时间发生变化，不同物种在各时间点的相对丰度表现出差异。一些难养的厌氧菌，如梭菌属（Clostridium genera），在所有时间点的每个反应器中均被持续检测到。

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