复杂粪便菌群连续培养的生物反应器组装

我们研究宿主与细菌的相互作用，以及内在和外在因素如何影响健康，重点关注细菌对癌症发生、发展及治疗反应的作用。我们研究了细菌群落在抗PD-1免疫检查点抑制剂中的作用，发现细菌代谢产物可增强抗PD-1治疗的疗效。

在体内分离宿主因素对微生物组的影响具有挑战性，因为存在多种影响因素。微生物反应器阵列可对特定过程进行受控研究，从而明确其对微生物群落的直接作用。本方案提供了一种经济高效的方法，可在受控条件下培养粪便菌群，同时使研究人员能够相对快速地并行开展实验。

[讲师] 首先，取一个3D打印的六孔反应器阵列。从1/8英寸的PTFE管中截取十二段25毫米长的管条，并用剃刀修整两端。将每段管条的一端插入带有25至28螺纹接头的雄性鲁尔接头的螺纹开口中。将接头牢固地拧入阵列上指定的废液和取样孔中。接着，将微型搅拌子放入每个反应器孔中。将一个雄性1/4-28螺纹接头拧入每个反应器孔的进样孔中。将雌性鲁尔软管接头适配器拧入废液和进样连接的螺纹接头中。然后将雌性鲁尔X转3-32/2英寸软管接头适配器拧入1/4-28螺纹接头中，用于取样口。在软管接头适配器上放置橡胶隔垫，并将顶部翻折覆盖。接下来，为废液和进样管线分别裁剪两组E-LFL 2.06毫米管。使用热水软化管材以便于连接。将管材连接至雌性鲁尔X转1/8英寸软管接头适配器，用于进样和废液连接。现在，在管材另一端固定一个带锁环的雄性鲁尔X转1/8英寸软管接头适配器。再将一个雌性鲁尔X转1/16英寸软管接头适配器拧入其中。将相应尺寸的双止动管连接至对应的进样和废液连接口。然后在管材另一端再固定一个雌性鲁尔X转1/16英寸软管接头适配器。对所有进样和废液接头重复上述步骤后，将一个带锁环的雄性鲁尔X转1/8英寸软管接头适配器连接至一段E-LFL 2管。将一端连接至每段双止动管末端未使用的雌性鲁尔X转1/16英寸软管接头适配器上。对所有进样和废液接头重复此操作后，使用雌性鲁尔T型接头的两端，将第一和第二反应器孔的进样管线E-LFL 2.06毫米管连接起来。然后，在T型接头的中间出口连接一段5厘米长的管，其两端均配有带锁环的雄性鲁尔X转1/8英寸适配器，通向第二个T型接头。现在，将第三个反应器的E-LFL 2.06毫米进样管连接至第二个T型接头的另一侧。连接另一段5厘米长的管段，一端为带锁环的雄性鲁尔X转1/8英寸适配器，另一端为带锁环的雌性鲁尔X转1/8英寸适配器。接着，将一个带锁环的雄性鲁尔X转1/8英寸软管接头适配器连接至一段25厘米长的E-LFL 2.06毫米管的一端。在另一端固定一个雌性鲁尔X转1/8英寸软管接头适配器，并用铝箔封口。为组装废液收集瓶，将一个双孔瓶盖松松地固定在2升瓶上。将雄性1/4-28螺纹接头插入瓶盖的两个孔中。然后，将一个带1/8英寸软管接头的雌性鲁尔适配器连接至瓶盖中未连接预装PTFE管的雄性螺纹接头。将一段5厘米长的E-LFL 2.06毫米管连接至瓶上的软管接头。在管材另一端连接一个带锁环的雄性鲁尔X转1/8英寸软管接头适配器，再用铝箔覆盖。最后，在121°C和15 psi条件下，用铝箔完全包裹整个瓶盖并高压灭菌45分钟。高压灭菌完成后，拧紧接头和铝箔密封，将反应器放入厌氧室中静置48小时后再使用。在厌氧室内，将反应器阵列对准设定为1,600 RPM的磁力搅拌器。然后将进样和废液管线的双止动管安装到相应蠕动泵的夹具中。如果在使用前不到25小时完成此操作，则锁紧夹具；否则保持松动，以减少管材磨损。现在，取下进样瓶的铝箔盖。将接头拧入雄性鲁尔转1/4-28螺纹接头，确保这些开口与瓶盖内部的PTFE管相连。取下铝箔盖，在进样瓶和废液瓶的5厘米通气管上各连接一个0.22微米的注射器滤器。以中等流速开始进液，使反应器开始填充。确保每个反应器孔内的排液管位置低于进样管，以防止过度填充或完全排空。当反应器开始填充时，检查所有孔是否达到相同体积，并确认培养基先进入排液管再流出反应器，以进行过夜脱气。首先，将实验材料转移至厌氧室中静置24小时。在计算所需粪便接种物的量后，将冷冻保存的粪便样本转移至厌氧室，并使其解冻15分钟。使用宽口移液器吸头，将粪便材料从冷冻管转移至一个50毫升锥形管中。将密封的管在200 ×g条件下离心5分钟，使颗粒沉淀。将管重新放回厌氧室，然后移除上清液。使用高压灭菌的实验室刮刀，将5.7克粪便固体转移至一个新的50毫升锥形管中。向管中加入17.1毫升厌氧无菌生理盐水，并紧密密封。现在，将管涡旋振荡5分钟，然后按前述方法进行离心。使用含10%次氯酸钠的实验室擦拭巾对每个反应器顶部的隔垫进行至少两分钟的灭菌处理。将样本重新放回厌氧室后，用移液器将上清液转移至新的50毫升锥形管中。现在，将3.8毫升粪便悬液上清液分别加入六个配有16号1.5英寸针头的5毫升注射器中。从反应器隔垫上移除次氯酸钠擦拭巾。然后将针头穿过隔垫，缓慢向每个反应器中注入3.8毫升粪便悬液，之后让反应器静置过夜。经过16至18小时的孵育后，开始向反应器供液。在注入粪便悬液后，立即将磁力搅拌器调至最高速度。两个重复反应器中的微生物群落组成随时间发生变化，不同物种在各时间点的相对丰度表现出差异。一些难养的厌氧菌，如梭菌属（Clostridium genera），在所有时间点的每个反应器中均被持续检测到。