Name: HepG2 细胞中代谢调节的 Akt 活化动力学的活细胞 Förster 共振能量转移成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-23T13:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: 了解利用Förster共振能量转移成像技术在活HepG2细胞中实时监测Akt活化动力学的方法。该技术可揭示胰岛素信号通路与肝癌细胞代谢调控的时空动态特征，为靶向癌症治疗研究提供重要工具。

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本工作部分得到了深圳市自然科学基金（JCYJ20240813113606009）、深港科技创新合作区（HZQB-KCZYB-2020056）、国家自然科学基金（32070681）、国家重点研发计划&amp;中国国家重点研发计划（2019YFA0906002）和深圳市孔雀计划（KQTD2016053117035204）。

作者声明无竞争利益。

用于监测HepG2细胞中Akt磷酸化的活细胞FRET成像方案包含多个关键步骤，以确保结果的可靠性和可重复性。第一步是细胞培养，包括常规的细胞维护、成像培养皿的包被以及细胞接种。在时间序列成像实验中，适当的包被对于细胞贴附至关重要，因为它能确保细胞稳定黏附，防止脱落并减少漂移，从而避免数据不一致9,32。细胞厚度或亚细胞结构的差异可能导致细胞部分区域失焦，影响测量准确性。温度、pH值和离子浓度会影响FRET信号并增加变异性33,34,35。良好的细胞贴附有助于维持细胞健康，保持信号通路的完整性，并确保FRET测量的准确性。将基于FRET的Akt生物传感器转染至HepG2细胞是一个关键步骤，因为转染效率直接影响FRET信号的强度和一致性31。然而，瞬时转染本身会导致生物传感器表达的异质性。通过...

糖尿病是一种主要的全球性健康挑战，其特征是胰岛素抵抗和葡萄糖稳态受损1。深入理解胰岛素信号通路对于阐明该疾病的病理生理机制至关重要，因为胰岛素在葡萄糖代谢、细胞生长和存活中发挥关键作用2。大量研究表明，胰岛素信号通路显著影响多种癌症，将胰岛素抵抗与肿瘤进展及患者不良预后联系在一起3,4,5,6。HepG2细胞是一种常用的肝细胞癌细胞系，是研究胰岛素抵抗以及代谢紊乱与癌症发展之间相互作用的有价值模型7。传统上，研究人员将胰岛素反应视为梯度式响应；然而，最近的研究发现，单个细胞可表现出双稳态响应，在特定胰岛素浓度阈值下出现从无响应到完全响应的显著转变8,9。
荧光共振能量转移（FRET）成像是一种用于研究活细胞中生物分子时空分布的有力工具10。通过提取分子动力学信息，FRET能够实时揭示Akt激活等过程，使其成为研究活细胞不可或缺的技术11,12。该成像方法在研究细胞动态过程方面已证明至关重要，特别是在代谢性疾病和癌症研究中，精确的分子相互作用尤为关键13。FRET还可实现对分子相互作用的实时监测，有助于阐明胰岛素抵抗和肿瘤进展等机制14,15。FRET生物传感器在癌症研究中至关重要，可用于研究肿瘤微环境、药物耐药性以及代谢紊乱16。FRET检测方法包括敏化发射（SE）、受体漂白（AB）、荧光寿命成像显微术（FLIM）和光谱学，每种方法在量化分子相互作用方面均具有独特优势17。SE通过测量供体与受体荧光团之间的能量转移，导致发射光谱发生可测量的变化，该变化与相互作用生物分子之间的接近程度相关18。AB利用选择性光漂白受体荧光团，并追踪供体荧光的变化，使研究人员能够评估相互作用的动力学过程和分子间距19。FLIM通过分析供体荧光团的荧光衰减速率，直接反映FRET效率，从而提供分子相互作用的精确纳米级测量结果20。
我们最近利用FRET技术，在C2C12来源的肌管细胞中证明了胰岛素反应的双稳态特性8,9,21,22,23,24。我们发现，Akt激活具有明显不同的开启和关闭阈值，这表明：尽管整体机体对胰岛素的剂量-反应呈梯度变化，但其背后从胰岛素刺激起始的亚细胞信号级联实际上更为复杂，并最终在单细胞水平上表现为“全或无”的响应模式21,22,23,24。为了检验其他细胞类型中是否存在双稳态，我们用不同浓度的胰岛素刺激HepG2细胞，并通过单细胞FRET成像记录其反应。我们使用Akt生物传感器在单细胞水平上监测Akt活性。该Akt生物传感器由增强型青色荧光蛋白（ECFP）25作为供体荧光基团，以及最亮的黄色荧光蛋白变体（YPet）26作为受体荧光基团，两者通过一段包含肽序列SGRPRTTTFADSCKP的Eevee连接子相连。该肽段可作为磷酸化Akt（pAkt）的底物，其序列经优化自人源糖原合酶激酶3β（GSK3β）。在未磷酸化状态下，供体与受体荧光基团之间的空间距离超过福斯特半径，从而抑制能量转移。当受到胰岛素刺激后，Akt发生磷酸化，进而导致SGRPRTTTFADSCKP肽段的磷酸化。这一过程引发构象变化，使供体和受体进入福斯特半径范围内，从而实现FRET27。因此，FRET信号强度与磷酸化Akt分子的数量相关，可实现对胰岛素介导的细胞反应进行实时定量分析。
本方案最初用于研究C2C12细胞系分化的肌管细胞中的胰岛素信号通路，已成功应用于HepG2细胞，并在不同硬件和软件平台上得以实施，从而证明了其适用性、可适应性与多功能性。HepG2细胞表现出组成型Akt活性，使其成为理想的 体外 用于研究肝脏特异性胰岛素信号转导及代谢过程的模型。本方案的关键步骤在方案部分中逐步详细描述。

<table><tbody><tr><td>0.25% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Gibco</td><td>货号#25200-056</td><td>使用预冷的 PBS 缓冲液洗涤细胞</td></tr><tr><td>15 mm 玻璃底细胞培养皿</td><td>NEST</td><td>货号#801001</td><td></td></tr><tr><td>2&amp;nbsp;mL Nalgene 冻存管</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>货号#5012-0020</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 移液管（血清学移液管）</td><td>康宁</td><td>货号#4487</td><td></td></tr><tr><td>95% 乙醇</td><td>Kermel</td><td>货号 C028005</td><td></td></tr><tr><td>A1 HD25/A1R HD25 共聚焦显微镜</td><td>尼康</td><td>https://www.nikon.com/</td><td>放大倍数：40&amp;times;，数值孔径（NA）：1.30，像素驻留时间：2.4 ms，像素尺寸：1024</td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>货号#A9393</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>VWR生命科学</td><td>货号 N208-10g</td><td></td></tr><tr><td>康宁 25&amp;nbsp;厘米&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; 矩形培养瓶</td><td>康宁</td><td>货号#430639</td><td></td></tr><tr><td>Countess 3 自动细胞计数仪</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>http://www.thermofisher.com/#AMQAX2000</td><td></td></tr><tr><td>Countess 细胞计数板载玻片</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>http://www.thermofisher.com/#C10228</td><td></td></tr><tr><td>数字涡旋混合器</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>https://www.thermofisher.com/</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>货号 D2650</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock 离心管 1.5&amp;nbsp;mL</td><td>Eppendorf</td><td>货号#022363204</td><td></td></tr><tr><td>EZ-PCR支原体检测试剂盒</td><td>生物工业公司</td><td>货号 20-700-20</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清，经鉴定，澳大利亚</td><td>Gibco</td><td>货号#10099141</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX 补充剂</td><td>Gibco</td><td>货号#35050061</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 9</td><td>GraphPad Software</td><td>https://www.graphpad.com/</td><td></td></tr><tr><td>HepG2</td><td>国家认证细胞库</td><td>#CSTR:19375.09.3101HUMSCSP510&amp;nbsp; http://www.cellbank.org.cn/</td><td></td></tr><tr><td>37号浸油</td><td>Cargille Laboratories</td><td>货号 #16237</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>货号 I5500-50MG</td><td>37℃预热 &amp;deg;使用前将 C 放置</td></tr><tr><td>LB培养基（1x）</td><td>Invitrogen</td><td>货号#10855001</td><td></td></tr><tr><td>最低必需培养基（MEM）</td><td>Gibco</td><td>货号#11095080</td><td>37℃预热 &amp;deg;使用前置于 C</td></tr><tr><td>mySPIN 12&amp;nbsp;微型离心机</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>https://www.thermofisher.com/</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop One</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>https://www.thermofisher.com</td><td></td></tr><tr><td>尼康 Plan Fluor 40&amp;times;/1.30 油镜</td><td>尼康</td><td>https://www.nikon.com/</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements-AR</td><td>尼康</td><td>https://www.nikon.com/</td><td></td></tr><tr><td>非必需氨基酸（NEAA）（100倍浓缩液）</td><td>Gibco</td><td>Cat#11140050</td><td></td></tr><tr><td>One Shot LB 琼脂平板&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>货号#A55802</td><td></td></tr><tr><td>One Shot Stbl3 化学感受态 E.&amp;nbsp;coli</td><td>Invitrogen</td><td>货号 C737303</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>PARAFILM</td><td>货号#B8R05606</td><td></td></tr><tr><td>PBS（磷酸盐缓冲液）</td><td>Gibco</td><td>货号#10010023</td><td></td></tr><tr><td>pEevee-iAkt-NES（7,033）&amp;nbsp;bp</td><td>三浦等人&amp;nbsp;al&lt;sup&gt;31&lt;/sup&gt;</td><td>https://benchling.com/s/seq-q46zFYCfl0swLAun0t28/edit</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>货号#15070063</td><td></td></tr><tr><td>普乐消炎预防剂</td><td>InvivoGen</td><td>货号#ant-mpp</td><td></td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸氢溴化物&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>货号 P4832</td><td></td></tr><tr><td>精密通用水浴锅</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>https://www.thermofisher.com/</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep 旋转式质粒小提试剂盒</td><td>QIAGEN</td><td>货号#27106</td><td></td></tr><tr><td>SnapGene</td><td>SnapGene by Dotmatics</td><td>https://www.snapgene.com</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠（100 mM）</td><td>Gibco</td><td>货号#11360070</td><td></td></tr><tr><td>注射器滤器，0.22 μm&amp;nbsp;&amp;mu;m</td><td>Millipore</td><td>货号#SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>东海希特载物台培养箱</td><td>TOKAI HIT</td><td>https://www.tokaihit-livecell.com/stagetopincubator</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 无 DNase/RNase 灭菌蒸馏水</td><td>Invitrogen</td><td>货号#10977015</td><td></td></tr><tr><td>Xfect 转染试剂</td><td>Takara Bio</td><td>货号#631317</td><td></td></tr></tbody></table>

活细胞中代谢调控的akt活化动态的förster共振能量转移成像研究

Live-Cell F&#246;rster Resonance Energy Transfer Imaging of Metabolically Regulated Akt Activation Dynamics in HepG2 Cells

代谢调控的Akt激活是胰岛素信号级联中的一个关键节点，为研究糖尿病与癌症之间的关系提供了重要见解。为了精确量化HepG2细胞中的Akt活性，我们开发了一种稳健且可重复的实验方案，利用基于基因编码的Akt特异性生物传感器的荧光共振能量转移（FRET）技术。本方案详细描述了细胞培养、成像培养皿制备以及转染HepG2细胞以表达基于FRET的生物传感器的操作步骤，同时提供了激光扫描共聚焦显微镜硬件和软件配置的具体指南。实验结果揭示了HepG2细胞中独特的胰岛素信号模式：表现为一种不可逆的开关行为，其特征是在达到特定开启阈值后出现持续性Akt激活，但缺乏关闭阈值；相比之下，肌管细胞则表现出可逆的开关行为。HepG2细胞中Akt的持续激活提示了肝细胞胰岛素抵抗和代谢失调的潜在机制，对理解代谢性疾病及癌症的发展进程具有广泛意义。该方案为在多种疾病背景下研究Akt相关信号通路和细胞行为提供了一个有价值的框架。

为研究HepG2细胞中Akt的活化情况，将细胞接种于预先包被的成像培养皿中，并转染基于FRET的生物传感器pEevee-iAkt-NES（图2A），该传感器旨在实现对Akt磷酸化过程的实时监测。转染后，细胞在无血清培养基中饥饿处理4小时，以同步其代谢状态并最小化基础胰岛素信号。
随后将细胞暴露于不同浓度的胰岛素（0 pM、300 pM、400 pM、500 pM、400 pM、100 pM 和 0 pM）中，以系统性地激活胰岛素信号通路。如图10A所示，Akt 磷酸化水平呈现剂量依赖性升高。值得注意的是，在胰岛素浓度为 300 pM 时，磷酸化水平显著上升，标志着 Akt 活化的最大阈值。超过该浓度后，磷酸化水平趋于平稳，在达到 500 pM 的过程中仅观察到缓慢增加。
有趣的是，当胰岛素浓度从 500 pM 逐步降低至 0 pM 时，Akt 的激活状态仍持续存在，其磷酸化水平保持升高，未能恢复至基础水平。这...

本文介绍了一种用于定量活体HepG2细胞中Akt激活及其磷酸化时空动态的实验方案。荧光共振能量转移（FRET）成像是一种强大的工具，可为癌细胞中胰岛素信号通路及代谢调控提供重要见解。

活细胞中代谢调控的Akt活化动态的Förster共振能量转移成像研究

代谢调控的Akt激活是胰岛素信号通路中的关键节点，为深入理解……之间的关系提供了重要线索

细胞异质性是准确描述细胞动力学复杂性的障碍，这些动力学基本上是平均的。这就是我们在这里对单个细胞进行成像的原因。基因编码的 FRET 生物传感器的最新发展提高了特异性，并彻底改变了细胞内 Akt 的实时跟踪，这有助于理解异基因和开发个性化药物疗法。癌症和糖尿病是通过复杂的代谢途径进行的。为了解码癌症中胰岛素信号通路的生物复杂性，我们使用了单细胞分辨率的尖端活细胞 FRET成像。我们发现，优化共聚焦显微镜、硬件和软件配置以及微调激光功率和调整探测器增益对于最大限度地减少FRET信号中的任何噪声和光谱串扰至关重要。蛋白质印迹等传统批量方法缺乏空间时间细节，并掩盖了细胞异质性。我们的方案通过使用活细胞FRET成像以高精度和准确度捕获细胞反应来填补这一空白。首先，将一毫升每毫升0.1毫克的聚-L-赖氨酸溶液加入成像培养皿中，并摇动培养皿以覆盖整个表面。孵育过夜后，从培养皿中吸出多余的聚-左旋赖氨酸溶液。用PBS轻轻冲洗表面3次，每次静置五分钟，以完全去除未结合的聚-左旋赖氨酸。吸出PBS并将包被的成像皿在37摄氏度下风干至少三个小时。接下来，在转染前 24 至 48 小时将 HepG2 细胞接种在预包被成像培养皿中，以确保它们达到 70% 至 90% 的汇合度。解冻并涡旋转染试剂以及编码 Forster 共振能量转移生物传感器的质粒。进行短暂旋转以收集管底部的所有混合物。使用涡旋高速将 8 微克质粒与反应缓冲液混合至最终体积为 100 微升 5 秒钟。短暂旋转以收集管底部的混合物。将 2.4 微升转染聚合物加入装有稀释血浆 DNA 的试管中并充分混合。将生物传感器和聚合物混合物在37摄氏度下孵育15分钟，以形成纳米颗粒复合物。以 5， 000 G 旋转试管 5 秒钟，以收集底部的内容物。将整个 100 微升纳米颗粒复合物溶液滴加到细胞培养基中，并轻轻来回摇动板以混合。将板在37摄氏度下孵育4小时至过夜。从细胞中去除纳米颗粒复合物后，用两毫升新鲜的完全生长培养基代替溶液。将板放回 37 摄氏度的培养箱中，直到分析时间。在荧光显微镜下分析细胞。从成像皿中取出培养基，并用 1X PBS 冲洗培养皿两次，每次冲洗持续五分钟。在盘子边缘的每个盘子中加入两毫升饥饿培养基。将细胞在 37 摄氏度下孵育四个小时。接下来，打开电脑，然后依次打开共聚焦显微镜主机和配件的电源。之后，通过将钥匙转到打开位置并拨动激光发射拨动开关来激活激光系统。然后，顺时针旋转激光锁开关至两条激光线的打开位置。最后，打开系统控制器电源。从桌面启动 NIS-Elements AR 软件。单击 A1 进行采集以启动成像设置并根据实验要求选择适当的光学配置。安装显微镜载物台顶部培养箱并用螺钉固定。用无菌双蒸馏水填充内部水浴。然后，安装顶部加热器并打开舞台加热器、浴缸加热器和镜头加热器的电源。用蘸有95%乙醇的透镜纸擦拭40X油浸透镜，在物镜上滴一小滴浸油。然后，将含有 HepG2 细胞的成像培养皿放置在显微镜载物台上，并用支架固定。关闭腔室并将细胞孵育一到两个小时以实现平衡。从 NIS-Elements AR 的 File 菜单启动 ND 采集窗口。选择“时间”选项卡以设置延时成像的间隔、持续时间和循环。单击 XY 选项卡，然后按 添加 按钮以包括用于聚焦成像的 HepG2 细胞。然后，选中 Z 框以设置 Z 位置。单击浏览以选择目标文件夹。在“文件名”框中输入实验名称。单击立即运行以启动采集并开始延时成像过程。在没有补充胰岛素的培养基的情况下记录长达 30 分钟的基线测量值。定期暂停成像。轻轻地从玻璃底培养皿中取出培养基，并加入一毫升补充有适当胰岛素浓度的培养基。恢复图像采集，并在实验结束时单击“完成”以关闭。最后，备份并安全地存储采集的图像以供分析。在胰岛素刺激下观察到 Akt 磷酸化的剂量依赖性增加，在 300 皮摩尔胰岛素时急剧增加。超过这个浓度，磷酸化水平趋于稳定，即使在胰岛素减少后也没有下降。归一化FRET比值显示出类似的趋势，胰岛素刺激后信号增加，胰岛素停药后未能恢复到基线。在序贯胰岛素刺激后，观察到标准化 FRET 比率逐渐增加，支持剂量依赖性 Akt 激活反应。

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HepG2 细胞中代谢调节的 Akt 活化动力学的活细胞 Förster 共振能量转移成像

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