Name: 使用选定组织区域进行基于质谱的蛋白质组学的简化方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-18T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: 学习基于质谱的蛋白质组学方法，用于分析福尔马林固定石蜡包埋组织中的特定区域。该技术可识别胰腺疾病的蛋白质改变，有助于早期诊断和生物标志物发现。

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本文中的所有图示均使用 BioRender（http://www.biorender.com）制作。本研究工作&#160;由韩国国家研究&#160;基金会（NRF）资助（资助编号：&#160;RS-2023-00253403 和 RS-2024-00454407）。

本研究经首尔国立大学医院机构审查委员会批准（IRB编号：1904-114-1028）。所有参与者均签署书面知情同意书，同意参加本研究。本方案中使用的所有材料的详细信息见于 材料表.
1. 用于蛋白质组学样本制备的FFPE组织抗原修复
注意：确保手术刀及所有材料（如所用试管）均处于无菌状态，以避免任何交叉污染。本研究的方案可根据实验室条件进行微调，适用于任何福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织。
<ol>
	<li>从完整的FFPE组织块上切下10-µm厚的FFPE组织切片，并将其放置于玻璃载玻片上。 
	注意：本研究中使用了人胰腺囊肿FFPE组织（两种不同类型的囊性组织——SCN和IPMN）进行蛋白质组学样品制备。</li>
	<li>小心使用二甲苯洗涤两次以去除FFPE组织中的石蜡（脱蜡）：第一次5分钟，第二次2分钟。</li>
	<li>通过梯度乙醇溶液系列洗涤使组织再水化：依次在100%、85%、70%和50%乙醇中各洗涤3分钟，随后用去离子水冲洗。 
	注意：确保在通风橱内操作二甲苯和乙醇。</li>
</ol>
2. 福尔马林固定石蜡包埋组织蛋白质提取
<ol>
	<li>准备一张由病理学家标记出感兴趣区域（ROI）的HE染色或免疫组化（IHC）染色组织切片。</li>
	<li>将未染色组织切片与染色组织切片背对背贴合，进行对齐，确保可通过玻璃切片观察到ROI区域。</li>
	<li>使用手术刀去除无关组织区域。 
	注意：若需分析邻近的正常组织，应将其收集至其他管中。</li>
	<li>用手术刀将组织ROI区域刮至切片中央，并转移至洁净的1.5 mL低蛋白结合离心管中。</li>
	<li>向每管中加入180 µL十二烷基硫酸钠（SDS）裂解缓冲液（5 % SDS，2 mM 三(2-羧乙基)膦 [TCEP]，300 mM pH 8.5 Tris-HCl，溶于去离子水中）。 
	注意：确保裂解缓冲液体积足以在超声处理过程中溶解组织并悬浮提取的蛋白质。缓冲液不足会导致组织裂解不完全，而过多则可能稀释蛋白裂解液。</li>
	<li>以20%的振幅进行探头式超声处理，执行10个循环，每个循环5秒开启、5秒关闭。</li>
	<li>将样品在100 °C下孵育3.5小时，同时以1,000 × g离心。 
	注意：孵育期间每小时对样品进行1分钟的水浴超声处理，以提高蛋白提取效率。</li>
	<li>孵育结束后，将样品在室温（RT）冷却10分钟，然后在室温下以16,000 × g离心10分钟，以分离组织碎片与上清液。</li>
	<li>将上清液转移至洁净并标记好的离心管中，于-80 °C保存，待后续使用。</li>
</ol>
3. 福尔马林固定石蜡包埋组织裂解液的蛋白质定量
注意：大多数用于蛋白质定量的双辛可宁酸测定步骤均基于制造商说明书进行轻微修改。建议根据制造商指南配制试剂。
<ol>
	<li>通过逐步稀释储备液（2 mg/mL 的牛血清白蛋白，BSA）配制不同浓度的牛血清白蛋白（BSA）标准品。如有必要，将样品按 20 或 40 的稀释倍数进行稀释。</li>
	<li>以去离子水作为空白对照，以 SDS 裂解缓冲液作为样品对照。</li>
	<li>用移液器将 9 µL 的标准品、空白对照、样品对照及待测样品加入微孔板孔的中央。</li>
	<li>向每个孔中的样品加入 4 µL 兼容性试剂溶液。</li>
	<li>盖上板子，在板式摇床上以中等速度振荡混匀 1 分钟，随后将板子在 37 °C 下孵育 15 分钟。</li>
	<li>向每孔中加入 260 µL BCA 工作试剂，然后将板子在 37 °C 下孵育 30 分钟。</li>
	<li>将板子在室温下冷却 3 分钟。</li>
	<li>使用酶标仪在 562 nm 波长下测定各孔的吸光度。</li>
	<li>从所有样品及样品对照的 562 nm 吸光度值中减去空白对照的吸光度值。</li>
	<li>进一步从所有样品的吸光度值中减去已扣除空白的样品对照的 562 nm 吸光度值。</li>
	<li>绘制标准曲线并利用该曲线确定各样品的蛋白浓度。 
	注意：确保从三张福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织切片（每张切片面积约为 1 cm2）中提取的蛋白质量估计为 200–250 µg。</li>
</ol>
4. 蛋白质的丙酮沉淀
注意：用于丙酮沉淀和基于悬浮捕获的蛋白质消化的蛋白质总量应为 100–300 µg。
<ol>
	<li>将蛋白样品（相当于100–300 µg）置于可耐受丙酮的离心管中。</li>
	<li>向管中加入体积为样品体积五倍的-20 °C丙酮。</li>
	<li>在-20 °C条件下孵育混合物18小时。</li>
	<li>在16,000 × g 条件下离心15分钟。</li>
	<li>小心弃去上清液，避免扰动蛋白沉淀。</li>
	<li>加入500 µL的-20 °C丙酮，并重复步骤4.4–4.5。</li>
	<li>将样品空气干燥。</li>
</ol>
基于悬浮捕获的蛋白质消化
注意：基于悬浮捕获滤膜的蛋白质消化步骤根据制造商说明书进行了微小修改。
<ol>
	<li>配制悬浮捕获裂解缓冲液（5 % SDS、5 mM TCEP、50 mM pH 8.5 TEAB，溶于去离子水中）。</li>
	<li>向样品管中加入 40 µL 缓冲液，充分涡旋振荡以溶解风干的蛋白质沉淀。</li>
	<li>将样品在 100 °C 下孵育，同时以 1,000 x g 振荡 35 分钟。</li>
	<li>向样品中加入 10 µL 烷基化试剂（100 mM 氯乙酰胺 [CAA] 溶于 100 mM pH 8.5 四乙基溴化铵 [TEAB] 中）。</li>
	<li>在室温下以 300 x g 振荡孵育 1 小时。</li>
	<li>小心配制酸化剂（10% 三氟乙酸 [TFA] 溶于去离子水中）。确保在通风橱中操作强酸 TFA。</li>
	<li>向样品中加入 5 µL 酸化剂，使终浓度达到 1% TFA（最终样品体积：55 µL）。</li>
	<li>使用 pH 试纸检测样品 pH，确保 pH 小于 1。</li>
	<li>向样品中加入 350 µL 结合/洗涤缓冲液-1（0.1 M pH 8.5 TEAB 溶于 90% 甲醇中），以实现蛋白质捕获。 
	注意：在蛋白质捕获过程中（步骤 5.9）避免涡旋和离心，以防样品损失。足量的蛋白质可形成肉眼可见、呈半透明状的胶体蛋白颗粒。</li>
	<li>将悬浮捕获柱放入 2 mL 管中，并将全部样品（包括任何不溶性物质）转移至悬浮捕获柱中。</li>
	<li>以 4,000 x g 离心 50 秒，完成蛋白质捕获。 
	注意：确保所有样品均通过柱体；若未完全通过，需重复离心直至过滤完全。</li>
	<li>向柱中加入 400 µL 洗涤缓冲液-2（50 % CHCl₃/50 % 甲醇），以 4000 x g 离心 50 秒，弃去穿流液。</li>
	<li>重复步骤 5.12 三次。</li>
	<li>加入 400 µL 缓冲液-1，以 4000 x g 离心 50 秒，弃去穿流液。</li>
	<li>重复步骤 5.14 三次。</li>
	<li>以 4000 x g 离心 1.25 分钟，确保缓冲液-1 完全通过柱体。</li>
	<li>将悬浮捕获柱转移至新的样品管中，用于酶解消化。</li>
	<li>向悬浮捕获柱中加入 125 µL 消化缓冲液（0.16 µg/µL 胰蛋白酶/赖氨酸酶C 溶于 50 mM pH 8.5 TEAB 中），盖紧盖子以防蒸发。 
	注意：胰蛋白酶与赖氨酸酶C 的质量比应为 1:10。确保至少使用 10 µg 胰蛋白酶/赖氨酸酶C 以实现有效消化。</li>
	<li>在 37 °C 下静置孵育 18 小时，不进行振荡。</li>
	<li>配制以下洗脱缓冲液：缓冲液-1（50 mM pH 8.5 TEAB 溶于去离子水中）、缓冲液-2（0.2 % 甲酸溶于去离子水中）和缓冲液-3（50 % 乙腈 [ACN] 溶于去离子水中）。</li>
	<li>向悬浮捕获柱中加入 80 µL 洗脱缓冲液-1，并以 4000 x g 离心 1.25 分钟。</li>
	<li>分别用 80 µL 洗脱缓冲液-2 和缓冲液-3 重复步骤 5.20。</li>
	<li>合并洗脱的肽段，并转移至洁净的新管中。</li>
</ol>
6. 肽段定量
注意：定量比色肽测定的大部分步骤均改编自制造商说明书，仅做了少量修改。建议根据制造商的指南准备试剂。
<ol>
	<li>通过逐步稀释标准品储备液（1 mg/mL）制备一系列标准品溶液。如有需要，使用4或5的稀释倍数对样品进行稀释。</li>
	<li>以去离子水作为空白对照，以等比例混合的洗脱缓冲液-1、缓冲液-2和缓冲液-3作为样品对照。</li>
	<li>将20 µL的标准品、空白对照、样品对照及待测样品分别加入各微孔板孔的中央位置。</li>
	<li>向每个孔中加入180 µL工作试剂，并将微孔板置于板式振荡器上充分混匀1分钟。</li>
	<li>用盖子封板，在37 °C条件下孵育20分钟。</li>
	<li>将板置于室温下冷却3分钟。</li>
	<li>使用酶标仪在480 nm波长下测定各孔的吸光度值。</li>
	<li>从所有样品及样品对照的480 nm吸光度值中减去空白对照的吸光度值。</li>
	<li>进一步从各待测样品的吸光度值中减去经空白校正后的样品对照的吸光度值。</li>
	<li>绘制标准曲线，并利用该曲线计算各样品的肽浓度。</li>
</ol>
7. 液相色谱-质谱分析
<ol>
	<li>肽段定量后，将 20 µg 肽段进行冻干。</li>
	<li>将肽段重新溶解于 40 µL 水相缓冲液（含 3% 乙腈的 0.1% 甲酸水溶液）中，置于超声水浴中处理 10 分钟。所得肽段浓度为 0.5 µg/µL。</li>
	<li>以 16,000 x g 离心 60 分钟，随后将样品转移至进样小瓶，用于质谱分析。</li>
	<li>使用纳米液相色谱-串联质谱系统（nano LC-MS/MS）的自动进样器，每份样品进样 2 µL。</li>
	<li>在反相色谱柱（内径 0.075 mm × 长度 150 mm，填充 3 µm C18 材料）上分离肽段，采用流速 100 nL/min、5%-35% 乙腈的 127 分钟梯度洗脱。通过纳米电喷雾离子源对肽段进行离子化，并将其导入基于轨道阱的质谱仪。</li>
	<li>采用窄范围数据非依赖性采集方法进行肽段分析21。</li>
	<li>应用以下质谱参数设置：MS m/z 范围：495–745，分辨率目标：15000，自动增益控制（AGC）目标：3 × 10E6，最大注入时间：自动；MS/MS 窗口：用户自定义（补充文件 1），分辨率目标：45000，AGC 目标：3 × 10E6，最大注入时间：自动，HCD 碰撞能量：22%、26%、30%。 
	注意：建议在分析前先通过分析标准样品对仪器进行初步质量检查。使用质谱数据采集软件配置参数（参见 材料表）。</li>
</ol>
8. 蛋白质组学搜索的数据分析
注意：对于质谱原始数据的蛋白质组学搜索，使用了开源工具来转换液相色谱-质谱（LC-MS）数据格式并进行蛋白质组搜索（参见材料表）。数据分析所用参数详见补充文件2。有关开源工具的基本使用说明，请参阅材料表中提供的链接。
<ol>
	<li>使用开源软件将液相色谱-质谱（LC-MS）获得的原始 MS/MS 谱图文件（*.raw）转换为 *.mzML 格式。</li>
	<li>将格式转换后的原始文件（*.mzML）作为输入，使用开源搜索引擎进行蛋白质组搜索。</li>
	<li>根据补充文件 2中指定的参数启动蛋白质组搜索。</li>
</ol>
9. 统计分析
注意：为了进行差异表达蛋白的统计分析，使用了一个开源工具进行单变量分析（例如，Student t检验；参见材料表）。建议通过材料表中提供的链接查阅该开源工具的基本使用说明。
<ol>
	<li>将已鉴定蛋白质列表（*.txt）导入开源工具中。</li>
	<li>将样本分为若干组。本研究中设定了两组：SCN 和 IPMN。</li>
	<li>对丰度值进行 Log2 转换，以调整数据分布，使其接近正态分布。</li>
	<li>进行过滤处理，去除存在缺失值的蛋白质。本研究中，要求每组至少有两个有效值方可纳入分析。</li>
	<li>采用基于正态分布的方法对缺失值进行填补，以生成用于后续单变量分析的完整定量蛋白质列表。</li>
	<li>进行 Student's t 检验，以鉴定两组间差异表达的蛋白质。本研究中采用了 Benjamini-Hochberg 错误发现率（FDR）校正。</li>
	<li>提取满足以下条件的差异表达蛋白质：Benjamini-Hochberg FDR &#60; 0.05 且 |倍数变化| ≥ 2。</li>
</ol>
10. 生物信息学分析
注意：本研究使用商业生物信息学工具进行富集分析（例如，Ingenuity 通路分析，参见材料表）。在使用该工具前，建议参考生产商提供的使用说明。
<ol>
	<li>将差异表达蛋白（DEPs）列表（*.txt）导入商业分析工具中。</li>
	<li>启动核心分析，进行通路富集分析（over-representation analysis）。</li>
	<li>使用Fisher精确检验导出由差异表达蛋白显著富集的典型通路（校正后p值 &#60; 0.05），筛选出与研究相关的感兴趣通路。</li>
</ol>

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作者声明无利益冲突

本方案介绍了一种快速高效的蛋白质组学方法，该方法利用固定于载玻片上的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织切片中分离出的感兴趣区域（ROI），用于病理学诊断。当外科干预有利时，实体肿瘤（如癌症和囊肿）会被手术切除并保存用于病理学评估。为实现长期储存，组织经福尔马林固定并包埋于石蜡中（FFPE）。随后将FFPE组织块切成4-10 µm厚度的切片，置于载玻片上，进行抗原修复，并用HE或IHC染色。病理学家通过评估细胞形态及分子诊断标志物（如HER2、ER和PR）的表达情况，辅助做出诊断决策。
现代蛋白质组学能够在各种组织中对人类蛋白质组进行全面的定性和定量分析，并进一步开展全系统的分子研究。超高分辨率、超快速质谱仪以及高度可重复的液相色谱技术的进步在这些发展中起到了关键作用。此外，本方案整合了基于悬浮捕获（suspension trapping）装置的样品制备方法，显著缩短了实验时间，并结合了无需标记的数据非依赖性采集质谱技术（label-free data-independent acquisition-mass spectrometry, DIA-MS），实现了对福尔马林固定石蜡包埋...

几十年来，手术切除的人体组织一直以甲醛固定、石蜡包埋（FFPE）的形式存档。这些组织块最初可保持嵌入石蜡中的三维（3D）结构。随后使用切片机将组织切成薄片，贴附于载玻片上，并进行染色——通常采用苏木精-伊红（HE）染色或免疫组织化学（IHC）染色——以便经验丰富的病理学家进行组织病理学诊断1,2。由于甲醛引起的蛋白质交联能够抑制酶活性和蛋白水解作用，FFPE组织在长期保存方面具有显著优势3。因其支持构建大规模且保存完善的研究样本库，FFPE组织已被视为包括基因组学在内的多个领域生物标志物发现的基石4,5,6,7。
然而，它们在基于液相色谱-质谱法（LC-MS）的蛋白质组学中的应用在历史上一直存在挑战。其中一个主要限制是福尔马林引起的蛋白质交联，会干扰胰蛋白酶消化——这是全局蛋白质组分析中的关键步骤8。此外，从组织切片中可提取的蛋白质含量通常较少，使得传统的样品制备方法难以适用。尽管存在这些挑战，已有研究进展表明，通过长时间高温处理可以逆转蛋白质交联9,10,11。同时，针对微量蛋白质样品优化的样品制备方法也拓展了福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织在蛋白质组学研究中的应用12,13,14,15。
在蛋白质组学研究中使用福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织切片的一个显著优势在于其能够实现区域特异性分析。FFPE切片通常同时包含病变组织和邻近的正常组织（ANT）。若对整个组织进行无差别分析，可能因混合的分子特征而导致结果混淆。相比之下，分离并分别分析感兴趣区域（ROIs）——即病变组织与ANT——能够更精确地刻画病理区域特有的分子特征。因此，基于FFPE的研究方法在蛋白质组学研究中日益受到重视16,17,18,19,20。尽管其应用日益广泛，但目前仍缺乏系统描述整个蛋白质组学实验各步骤的标准化操作流程，尤其尚未发表基于视频的实验方案。
本研究建立了一种基于液相色谱-质谱联用（LC-MS）的稳健蛋白质组学工作流程，专为精确分析病灶特异性区域内的分子变化而设计。利用经两名病理学家诊断的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织样本，对良性浆液性囊性肿瘤（SCN）和癌前病变导管内乳头状黏液性肿瘤（IPMN）的感兴趣区域（ROI）进行大体解剖分离、收集并分析。该方案包括对感兴趣区域进行大体解剖、基于悬浮捕获法的样本制备（针对极低蛋白投入量优化）以及窄范围数据非依赖性采集（DIA-MS）质谱分析。该方法实现了从约1 cm²组织区域中鉴定出超过9,000种蛋白质，揭示了与SCN和IPMN相关的特异性蛋白质组特征。

<table><tbody><tr><td>乙腈中0.1%甲酸（LC-MS级）</td><td>Fisher Chemical</td><td>LS120-212</td><td></td></tr><tr><td>水中0.1%甲酸（LC-MS级）</td><td>Fisher Chemical</td><td>LS118-4</td><td></td></tr><tr><td>0.5M TCEP</td><td>Thermo Scientific</td><td>77720</td><td></td></tr><tr><td>10% SDS</td><td>Invitrogen</td><td>2679093</td><td></td></tr><tr><td>1M TEAB（pH 8.5）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>102545001</td><td></td></tr><tr><td>1M Tris-cl（pH 8.5）</td><td>BIOSOLUTION</td><td>BTO21</td><td></td></tr><tr><td>A-14C离心机</td><td>Satorious</td><td>167709</td><td></td></tr><tr><td>丙酮（HPLC级）</td><td>Fisher Scientific</td><td>A949-4</td><td></td></tr><tr><td>乙腈（HPLC级）</td><td>J.T.Baker</td><td>9017-88</td><td></td></tr><tr><td>氯仿（HPLC级）</td><td>Thermo Scientific</td><td>022920.k2</td><td></td></tr><tr><td>CR滤纸</td><td>ADVANTEC</td><td>70406001</td><td></td></tr><tr><td>DIA-NN ver 1.9&amp;nbsp;</td><td>开源&amp;nbsp;</td><td>https://github.com/vdemichev/DiaNN</td><td>蛋白质组学搜索引擎&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>EPOCH2酶标仪</td><td>Agilent&amp;nbsp;</td><td>2106208</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>MERCK</td><td>K50505283 836</td><td></td></tr><tr><td>甲酸（LC-MS级）</td><td>Fisher Chemical</td><td>A117-50</td><td></td></tr><tr><td>Ingenuity信号通路分析（IPA）</td><td>QIAGEN</td><td>830018</td><td>生物信息学工具</td></tr><tr><td>冷冻干燥仪（SRF110R+蒸气捕集器）</td><td>Thermo Scientific</td><td>SRF-110-115</td><td></td></tr><tr><td>甲醇（HPLC级）</td><td>MERCK</td><td>UN1230</td><td></td></tr><tr><td>Microplate BCA蛋白检测试剂盒-兼容还原剂</td><td>Thermo Scientific</td><td>23252</td><td></td></tr><tr><td>MSConvert&amp;nbsp;</td><td>开源&amp;nbsp;</td><td>http://proteowizard.sourceforge.net/tools.shtml</td><td>质谱数据转换软件</td></tr><tr><td>Orbitrap Exploris 480</td><td>Thermo Scientific</td><td>MA10813C</td><td>质谱仪</td></tr><tr><td>PepMAP RSLC C18分离柱&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>ES903</td><td></td></tr><tr><td>Perseus</td><td>开源</td><td>https://cox-labs.github.io/coxdocs/perseus_instructions.html</td><td>统计分析工具</td></tr><tr><td>PIERCE氯乙酰胺无称量格式</td><td>Thermo Scientific</td><td>A39270</td><td></td></tr><tr><td>PIERCE定量比色肽检测试剂盒</td><td>Thermo Scientific</td><td>23275</td><td></td></tr><tr><td>微孔板振荡器&amp;nbsp;</td><td>Green SSeriker</td><td>VS-202D</td><td></td></tr><tr><td>探头式超声破碎仪</td><td>VibraCellTM</td><td>VCX750</td><td></td></tr><tr><td>蛋白质低吸附管 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>QSP 10 &amp;micro;L移液器吸头</td><td>Thermo Scientific</td><td>TLR102RS-Q</td><td></td></tr><tr><td>QSP 300 &amp;micro;L移液器吸头</td><td>Thermo Scientific</td><td>TLR106RS-Q</td><td></td></tr><tr><td>手术刀</td><td>Bard-Parker</td><td>372615</td><td></td></tr><tr><td>S-Trap：快速通用质谱样品制备试剂盒</td><td>PROTIFI</td><td>CO2-mini-40</td><td></td></tr><tr><td>SureSTART小瓶 0.2 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>6pk1655</td><td></td></tr><tr><td>三氟乙酸（TFA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>102614284</td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer C</td><td>Eppendorf</td><td>5382</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶/Lys-C（LC-MS级）</td><td>Promega</td><td>V5073</td><td></td></tr><tr><td>Vanquish NEO</td><td>Thermo Scientific</td><td>8348249</td><td>液相色谱系统</td></tr><tr><td>水（HPLC级）</td><td>Honeywell</td><td>AH365-4</td><td></td></tr><tr><td>Xcalibur ver 4.7</td><td>Thermo Scientific</td><td>30966</td><td>质谱数据采集软件</td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>102033629</td><td></td></tr></tbody></table>

一种利用选定组织区域进行质谱法蛋白质组学的简化方法

A Streamlined Approach for Mass Spectrometry-Based Proteomics Using Selected Tissue Regions

基于质谱（MS）的蛋白质组学能够对包括细胞、组织和体液在内的多种生物样本进行全面的蛋白质组分析。常用于长期存档的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织切片，已成为蛋白质组学研究的宝贵资源。除了其存储优势外，研究人员还可通过与病理学家合作，从正常组织区域中分离出感兴趣的区域（ROIs）。尽管具有这些潜力，目前仍缺乏涵盖ROIs分离、蛋白质组样本制备及质谱分析的标准化实验流程。本方案介绍了一种整合了ROIs宏观解剖、基于悬浮液捕获的样本制备以及高通量质谱分析的一体化工作流程。通过该方法，对病理学家诊断为良性浆液性囊性肿瘤（SCN）和癌前病变导管内乳头状黏液性肿瘤（IPMN）的患者FFPE组织中的ROIs进行了宏观解剖、收集和分析，实现了高覆盖率的蛋白质组检测。此外，成功鉴定了这两种不同类型的胰腺囊性肿瘤之间的分子差异，从而证明了该方法在推进基于FFPE组织的蛋白质组学研究中的适用性。

采用基于悬浮捕获滤膜的蛋白质组学样品制备方法，并结合单次数据非依赖性采集的无标记定量策略，应用于胰腺囊性福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织的分析（图1）。在不同胰腺囊性FFPE组织的处理过程中，实现了精确的感兴趣区域（ROI）分离（图2A），从而获得各类胰腺囊性肿瘤生物学三重复样本间可重复的总离子色谱图（图2B）。液相色谱-质谱（LC-MS）分析共鉴定出9,703种蛋白质，在浆液性囊性肿瘤（SCN）和导管内乳头状黏液性肿瘤（IPMN）中分别平均定量到7,886和8,273种蛋白质（图2C）。此外，在全部六个样本中总共鉴定出80,245个前体离子和75,412个肽段，SCN和IPMN的前体离子/肽段平均数量分别为55,729/51,488和63,573/59,519（图2D）。所有鉴定蛋白质的丰度跨越6.25个数量级，显示出全面的蛋白质组覆盖...

本文建立了一种基于质谱的蛋白质组学方法，利用福尔马林固定、石蜡包埋组织切片中分离出的特定区域进行分析。该方案用于分析存档的福尔马林固定、石蜡包埋组织切片中特定组织区域的蛋白质组。

基于质谱（MS）的蛋白质组学能够对包括细胞、组织在内的多种生物样本进行全面的蛋白质组分析，……

我们开发了一种利用质谱技术研究高阶组织样本特定区域蛋白质组的简化方法。本研究的目标是优化蛋白质组学技术，包括样本制备和质谱分析，以实现高准确性和高可靠性。基于福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织的空间蛋白质组学面临的一个挑战是蛋白质消化不完全，这会降低整体蛋白质覆盖度。克服这些挑战需要优化的消化方案和增强的质谱分析策略，以提高蛋白质组的覆盖深度和准确性。我们鉴定了不同类型胰腺疾病中独特的蛋白质改变，揭示了良性病变与癌前病变之间的差异。这些发现可能有助于胰腺癌的早期诊断。我们的目标是推进患者样本蛋白酶方法，以实现组织区域内高分辨率的蛋白质图谱绘制。通过采用基于质谱的蛋白质组学技术，我们致力于鉴定与生物标志物发现相关的区域特异性分子特征。本方法将患者样本的捕获与前处理步骤，结合数据非依赖型采集模式的质谱技术，从而快速从选定的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织区域获得高质量的蛋白质组数据。该方法可实现对空间蛋白质组的精确定量。首先，准备一张由病理学家标记出感兴趣区域的苏木精-伊红染色或免疫组织化学染色组织切片。将未染色的组织切片与染色的组织切片背对背放置，确保两者正确对齐。使用手术刀去除不需要的组织区域，并将感兴趣的组织区域刮向载玻片中央。将收集的组织转移至洁净的1.5毫升低蛋白结合离心管中，每管加入180 µL SDS裂解缓冲液。以20%的振幅进行探头超声处理，每次超声5秒，间隔5秒，共循环10次。将样品在100摄氏度下孵育3.5小时，同时保持1,000 G的转速。孵育结束后，让样品在室温下冷却10分钟。然后在室温下以16,000 G离心10分钟，以分离组织碎片与上清液。将上清液收集至干净并标记好的离心管中，于-80摄氏度保存，直至后续使用。进行丙酮沉淀时，将含有100至300微克蛋白质的样品置于可耐受丙酮的离心管中。然后加入预冷至-20°C的冰丙酮，丙酮体积为样品体积的5倍。将混合物在-20°C下孵育18小时。孵育后，将离心管在 16,000 G 条件下离心 15 分钟。小心弃去上清液，避免扰动蛋白质沉淀。加入 500 µL 预冷至 -20 °C 的丙酮，再次离心。倒出上清液后，将样品空气干燥。用去离子水配制悬浮捕获裂解缓冲液。然后，向样品管中加入40微升已配制的缓冲液，充分涡旋振荡以溶解空气干燥的蛋白质沉淀。将样品置于摇床培养箱中，在100摄氏度、1,000 G条件下振荡35分钟。接着，向样品中加入10微升烷基化试剂，并在室温、300 G条件下孵育1小时。在化学通风橱内，向样品中加入5微升10%三氯乙酸，使总体积达到55微升。使用 pH 试纸检测样品的 pH 值，确保其小于 1。接着，向样品中加入 350 微升结合缓冲液一，以捕获蛋白质。将悬浮液捕获柱放入一个 2 毫升离心管中，并将全部样品（包括任何不溶性物质）转移至柱中。将离心柱在4,000 G下离心50秒以截留蛋白质。然后加入400微升洗涤缓冲液二。离心后，弃去穿流液。最后一次洗涤后，以4,000 G离心1.25分钟，以确保缓冲液一完全通过。向悬浮捕获柱中加入125微升消化缓冲液，并盖上盖子以防止蒸发。将样品在37摄氏度孵育18小时，期间不进行震荡。现在，向悬浮捕获柱中加入 80 微升洗脱缓冲液一，以 4,000 G 离心 1.25 分钟。收集洗脱的肽段并转移至一支干净的新离心管中。在进行肽段定量后，冻干 20 微克肽段。将冻干的多肽重新溶解于40微升含有0.1%甲酸水溶液和3%乙腈的水相缓冲液中，在超声水浴中超声处理10分钟。以16,000 G离心60分钟，将上清液转移至小瓶中用于质谱分析。使用纳米液相色谱-质谱系统的自动进样器，每份样品进样2微升。使用填充有3微米C18材料的反相色谱柱，以每分钟100纳升的流速进行5%至35%乙腈的127分钟梯度洗脱，分离肽段。通过纳米喷雾离子源对肽段进行电离，并将其引入基于Orbitrap的质谱仪。采用窄范围数据非依赖性采集方法分析肽段。在不同胰腺囊性福尔马林固定石蜡包埋组织的处理过程中，实现了对目标区域的精确分离。每种类型的胰腺囊性肿瘤在生物学三重复实验中均获得了可重复的总离子色谱图。液相色谱-质谱分析共鉴定出 9,703 种蛋白质。所有已鉴定蛋白质的丰度跨越了6.25个数量级，表明实现了全面的蛋白质组覆盖，并对已知的胰腺癌蛋白质标志物进行了定量。共鉴定出933种差异表达蛋白，其中在导管内乳头状黏液性肿瘤中，457种表达上调，476种表达下调。生物信息学分析显示，这些差异表达蛋白与多个胰腺癌相关通路相关。

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Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

使用选定组织区域进行基于质谱的蛋白质组学的简化方法

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源自液体和实体肿瘤的癌细胞蛋白质组的定量质谱分析

介绍了一种利用单个样品对生物组织中的脂质、代谢物和蛋白质进行综合提取的实验方案。...

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通过同重标记、深度液相色谱、质谱分析及软件辅助定量进行深度蛋白质组分析

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二维凝胶电泳联合质谱法分析人类垂体腺瘤组织蛋白质组

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时间分辨电喷雾电离氢氘交换质谱法用于研究蛋白质结构与动力学

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