使用选定组织区域进行基于质谱的蛋白质组学的简化方法
April 18th, 2025
在这里，我们建立了一种基于质谱的蛋白质组学方法，使用福尔马林固定、石蜡包埋的组织切片中的分离感兴趣区域。该方案用于分析存档的福尔马林固定、石蜡包埋的组织切片中特定组织区域的蛋白质组。
我们开发了一种使用质谱法研究高等组织样品特定区域的蛋白质组的简化方法。我们的目标是增强蛋白质组学技术，包括样品制备和质谱分析，以实现高准确性和可靠性。基于 FFPE 的空间蛋白质组学的一个挑战是蛋白质消化不完全，这会降低整体蛋白质覆盖率。
克服这些问题需要优化的酶解方案和增强的质谱策略，以提高蛋白质组的深度和准确性。我们确定了不同类型胰腺疾病的不同蛋白质改变，从而深入了解良性和癌前病变之间的差异。这些发现可能有助于胰腺癌的早期诊断。
我们的目标是推进患者蛋白酶方法，以实现组织区域内的高分辨率蛋白质定位。利用基于质谱的蛋白质组学，我们试图识别有助于生物标志物发现的区域特异性分子特征。我们的方法将这些患者捕获和预准备与数据无关的场合质谱相结合，以从选定的 FFPE 组织区域快速生成高质量的蛋白质组数据。
这种方法能够对空间蛋白质组进行大量定量。首先，准备苏木精和伊红染色或免疫组织化学染色的组织载玻片，其感兴趣区域由病理学家指示。将未染色的组织载玻片和染色的组织载玻片背靠背放置，确保正确对齐。
使用手术刀去除不感兴趣的组织区域，并将感兴趣的组织区域刮向载玻片中心。将收集的组织转移到干净的 1.5 ml 低蛋白结合管中，并向每个管中加入 180 μL SDS 裂解缓冲液。以 20% 的振幅进行探针超声处理，持续 10 个周期，每次开 5 秒，关 5 秒。
现在，将样品在 100 摄氏度下孵育 3.5 小时，同时保持 1， 000 G 的速度，孵育后，让样品在室温下冷却 10 分钟。然后，在室温下以 16， 000 G 离心 10 分钟，以分离上清液中的组织碎片。将上清液收集到干净、贴有标签的试管中，并在零下 80 摄氏度下储存直至进一步使用。
对于丙酮沉淀，将相当于 100 至 300 μg 的蛋白质样品放入与丙酮兼容的试管中。然后，加入冰冷的丙酮，预冷至零下 20 摄氏度，体积为样品体积的五倍。将混合物在零下 20 摄氏度下孵育 18 小时。
孵育后，将试管以 16， 000 G 离心 15 分钟。小心处理上清液，不要干扰蛋白质沉淀。加入 500 微升丙酮，在零下 20 摄氏度下回火并离心。
倾析上清液后，将样品风干。在去离子水中制备悬浮捕获裂解缓冲液。然后，向样品管中加入 40 微升制备的缓冲液并彻底涡旋以溶解风干的蛋白质沉淀。
将样品置于 100 摄氏度、1， 000 G 的振荡培养箱中 35 分钟。接下来，向样品中加入 10 μL 烷基化试剂，并在室温下以 300 G 孵育样品 1 小时。在化学通风橱内，向样品中加入 5 微升 10% 三氯乙酸，使总体积为 55 微升。
使用 pH 试纸检查样品的 pH 值，确保其小于 1。接下来，向样品中加入 350 μL 结合缓冲液 1 以捕获蛋白质。将悬浮捕获柱放入 2 mL 试管中，并将整个样品（包括任何不溶性物质）转移到色谱柱中。
将色谱柱以 4， 000 G 离心 50 秒以捕获蛋白质。然后，加入 400 微升洗涤缓冲液 2。离心后，丢弃流出液。
最后一次洗涤后，将色谱柱以 4， 000 G 离心 1.25 分钟，以确保缓冲液 1 完全通过。向悬浮捕获柱中加入 125 μL 消化缓冲液并加盖以防止蒸发。将样品在 37 摄氏度下孵育 18 小时，不要摇晃。
现在，向悬浮捕获柱中加入 80 μL 洗脱缓冲液 1，并以 4， 000 G 离心 1.25 分钟。拉出洗脱的肽并将其转移到干净的新试管中。肽定量后，冻干 20 μg 肽。
将冻干肽重新溶解在 40 μL 含 3% 乙腈的水性缓冲液中，溶于 0.1% 甲酸水中，并在超声处理浴中超声处理 10 分钟。将样品以 16， 000 G 离心 60 分钟，然后将上清液转移到样品瓶中进行质谱分析。使用纳米液相色谱质谱系统的自动进样器，每个样品注入 2 微升。
在填充有 3 微米 C18 材料的反相色谱柱上以 100 纳升/分钟的速度，梯度为 5% 至 35%，分离肽。通过纳喷雾离子源电离肽，并将其转移到基于 Orbitrap 的质谱仪中。使用窄范围数据非依赖型采集方法分析肽。
在 FFPE 组织处理过程中，在不同的胰腺囊性福尔马林固定石蜡包埋组织中实现了精确的感兴趣区域分离。在每种类型的胰腺囊性肿瘤的生物三重复之间获得可重现的总离子色谱图。液相色谱质谱分析鉴定出 9， 703 种蛋白质。
所有鉴定蛋白的丰度跨越 6.25 个数量级，表明蛋白质组覆盖度全面，并且已知的胰腺癌蛋白标志物被量化。共鉴定出 933 种差异表达蛋白，其中 457 种在导管内状粘液性肿瘤中上调，476 种下调。生物信息学分析显示，差异表达蛋白与几种胰腺癌相关通路相关。
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概述
本研究提出了一种基于质谱的蛋白质组学方法，用于分析甲醛固定、石蜡包埋组织切片中的特定感兴趣区域。该方案旨在提高对存档组织样本进行蛋白质组学分析的准确性和可靠性。
主要研究组成部分
科学领域
- 蛋白质组学
- 质谱
- 病理学
背景
- 甲醛固定、石蜡包埋 (FFPE) 组织常用于研究。
- 研究特定组织区域的蛋白质组可以深入了解疾病机制。
- 挑战包括不完全的蛋白质消化影响蛋白质覆盖率。
- 需要优化的方案来进行准确的分析。
研究目的
- 开发一种用于特定组织区域的蛋白质组学分析的简化方法。
- 改善样本制备和质谱技术。
- 识别胰腺疾病中的蛋白质变化。
使用的方法
- 质谱用于蛋白质组学分析。
- 从 FFPE 样本中分离特定组织区域。
- 蛋白质分析的优化消化方案。
- 比较胰腺疾病中蛋白质变化的分析。
主要结果
- 在不同类型的胰腺疾病中，已经识别出不同的蛋白质变化。
- 对良性和癌前病情的差异有了了解。
- 该方法提高了蛋白质组学分析的深度和准确性。
- 研究结果可能有助于胰腺癌的早期诊断。
结论
- 所开发的方法改进了对 FFPE 组织中蛋白质组的研究。
- 优化的方案可以克服蛋白质消化方面的挑战。
- 这项研究有助于了解胰腺疾病和潜在的诊断应用。
常见问题解答
Executive Industry Relevance
Spatially resolved proteomics using FFPE tissue regions addresses a critical need for high-resolution molecular profiling in discovery-stage oncology research. This streamlined workflow enables robust quantitation and comparative analysis of protein expression across disease-relevant tissue microenvironments, supporting predictive confidence in early biomarker and target validation. Integrating pathologist-guided region selection with optimized sample preparation and high-throughput MS analysis enhances portfolio decision-making at the interface of discovery and translational research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of region-specific proteomic alterations in disease and benign tissue contexts.
- Supports functional target validation by quantifying known and novel protein markers in situ.
- Facilitates mechanistic de-risking through pathway-level analysis of differentially expressed proteins.
- Improves predictive confidence for biomarker discovery and early triage of candidate targets.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, spatially defined tissue samples for downstream quantitative proteomics workflows.
- Standardizes sample preparation and MS analysis to ensure reproducibility and scalability across studies.
- Generates high-quality, quantitative proteome data suitable for comparative screening of disease states.
- Enables reliable evaluation of protein expression changes for assay development and optimization.
Translational & Preclinical Research
- Aligns molecular findings from FFPE tissues with disease-relevant pathways implicated in cancer progression.
- Provides continuity from discovery-stage proteomic profiling to preclinical model validation.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by linking molecular signatures to clinical phenotypes.
- Enhances translational biomarker alignment through comprehensive protein quantification in archived tissues.
Pipeline & Workflow Integration
This integrated protocol bridges early discovery, target validation, and translational research by enabling spatially resolved proteomic analysis of FFPE tissues.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification by quantifying region-specific protein expression.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for robust comparison of disease and control tissue regions.
- Analytics: Provides comprehensive protein abundance measurements and differential expression analysis across conditions.
- Translational Research: Connects proteomic signatures to disease mechanisms and potential clinical biomarkers.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, scalable workflow for repeated use across diverse tissue types and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target and biomarker validation.
- Operational Value: Streamlines sample preparation, enhances reproducibility, and supports high-throughput scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust molecular profiling early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery and translational programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue macrodissection, proteomics sample preparation, and mass spectrometry operation.
- Demands access to high-resolution MS instrumentation and robust bioinformatics infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization for region selection and data analysis protocols.
- Adaptable to various FFPE tissue types and disease models with appropriate optimization.
- Potential limitations include protein recovery variability and the need for pathologist collaboration for ROI identification.
