一种利用选定组织区域进行质谱法蛋白质组学的简化方法

我们开发了一种利用质谱技术研究高阶组织样本特定区域蛋白质组的简化方法。本研究的目标是优化蛋白质组学技术，包括样本制备和质谱分析，以实现高准确性和高可靠性。基于福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织的空间蛋白质组学面临的一个挑战是蛋白质消化不完全，这会降低整体蛋白质覆盖度。

克服这些挑战需要优化的消化方案和增强的质谱分析策略，以提高蛋白质组的覆盖深度和准确性。我们鉴定了不同类型胰腺疾病中独特的蛋白质改变，揭示了良性病变与癌前病变之间的差异。这些发现可能有助于胰腺癌的早期诊断。

我们的目标是推进患者样本蛋白酶方法，以实现组织区域内高分辨率的蛋白质图谱绘制。通过采用基于质谱的蛋白质组学技术，我们致力于鉴定与生物标志物发现相关的区域特异性分子特征。本方法将患者样本的捕获与前处理步骤，结合数据非依赖型采集模式的质谱技术，从而快速从选定的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织区域获得高质量的蛋白质组数据。

该方法可实现对空间蛋白质组的精确定量。首先，准备一张由病理学家标记出感兴趣区域的苏木精-伊红染色或免疫组织化学染色组织切片。将未染色的组织切片与染色的组织切片背对背放置，确保两者正确对齐。

使用手术刀去除不需要的组织区域，并将感兴趣的组织区域刮向载玻片中央。将收集的组织转移至洁净的1.5毫升低蛋白结合离心管中，每管加入180 µL SDS裂解缓冲液。以20%的振幅进行探头超声处理，每次超声5秒，间隔5秒，共循环10次。

将样品在100摄氏度下孵育3.5小时，同时保持1,000 G的转速。孵育结束后，让样品在室温下冷却10分钟。然后在室温下以16,000 G离心10分钟，以分离组织碎片与上清液。将上清液收集至干净并标记好的离心管中，于-80摄氏度保存，直至后续使用。

进行丙酮沉淀时，将含有100至300微克蛋白质的样品置于可耐受丙酮的离心管中。然后加入预冷至-20°C的冰丙酮，丙酮体积为样品体积的5倍。将混合物在-20°C下孵育18小时。

孵育后，将离心管在 16,000 G 条件下离心 15 分钟。小心弃去上清液，避免扰动蛋白质沉淀。加入 500 µL 预冷至 -20 °C 的丙酮，再次离心。

倒出上清液后，将样品空气干燥。用去离子水配制悬浮捕获裂解缓冲液。然后，向样品管中加入40微升已配制的缓冲液，充分涡旋振荡以溶解空气干燥的蛋白质沉淀。

将样品置于摇床培养箱中，在100摄氏度、1,000 G条件下振荡35分钟。接着，向样品中加入10微升烷基化试剂，并在室温、300 G条件下孵育1小时。在化学通风橱内，向样品中加入5微升10%三氯乙酸，使总体积达到55微升。

使用 pH 试纸检测样品的 pH 值，确保其小于 1。接着，向样品中加入 350 微升结合缓冲液一，以捕获蛋白质。将悬浮液捕获柱放入一个 2 毫升离心管中，并将全部样品（包括任何不溶性物质）转移至柱中。

将离心柱在4,000 G下离心50秒以截留蛋白质。然后加入400微升洗涤缓冲液二。离心后，弃去穿流液。

最后一次洗涤后，以4,000 G离心1.25分钟，以确保缓冲液一完全通过。向悬浮捕获柱中加入125微升消化缓冲液，并盖上盖子以防止蒸发。将样品在37摄氏度孵育18小时，期间不进行震荡。

现在，向悬浮捕获柱中加入 80 微升洗脱缓冲液一，以 4,000 G 离心 1.25 分钟。收集洗脱的肽段并转移至一支干净的新离心管中。在进行肽段定量后，冻干 20 微克肽段。

将冻干的多肽重新溶解于40微升含有0.1%甲酸水溶液和3%乙腈的水相缓冲液中，在超声水浴中超声处理10分钟。以16,000 G离心60分钟，将上清液转移至小瓶中用于质谱分析。使用纳米液相色谱-质谱系统的自动进样器，每份样品进样2微升。

使用填充有3微米C18材料的反相色谱柱，以每分钟100纳升的流速进行5%至35%乙腈的127分钟梯度洗脱，分离肽段。通过纳米喷雾离子源对肽段进行电离，并将其引入基于Orbitrap的质谱仪。采用窄范围数据非依赖性采集方法分析肽段。

在不同胰腺囊性福尔马林固定石蜡包埋组织的处理过程中，实现了对目标区域的精确分离。每种类型的胰腺囊性肿瘤在生物学三重复实验中均获得了可重复的总离子色谱图。液相色谱-质谱分析共鉴定出 9,703 种蛋白质。

所有已鉴定蛋白质的丰度跨越了6.25个数量级，表明实现了全面的蛋白质组覆盖，并对已知的胰腺癌蛋白质标志物进行了定量。共鉴定出933种差异表达蛋白，其中在导管内乳头状黏液性肿瘤中，457种表达上调，476种表达下调。生物信息学分析显示，这些差异表达蛋白与多个胰腺癌相关通路相关。