生成与表征缺失脆性X智力低下核糖核蛋白的人诱导多能干细胞来源星形胶质细胞

本研究聚焦于四种特定的人类脑星形胶质细胞，以及脆性X综合征等神经发育障碍如何改变这些细胞。以往的研究主要利用动物模型来研究神经元，因此本工作为该研究领域增添了新的维度。

来自动物研究的机制性见解在临床应用中取得的成功有限。主要挑战在于如何获得与人类来源的神经元和星形胶质细胞相关的类似认知。

本方案成功生成了功能性星形胶质细胞，这些细胞在脆性X综合征中表现出糖酵解和线粒体代谢的失调，从而能够深入探究胶质细胞在疾病生物学中的作用。尽管越来越多的证据表明胶质细胞在健康和疾病状态下的神经元功能中起关键作用，但目前对脆性X综合征等神经发育障碍中人类星形胶质细胞如何受影响仍知之甚少。

展望未来，我们将在此框架基础上进一步研究疾病如何改变星形胶质细胞及其与神经元的相互作用，以及这些改变如何通过治疗干预得以纠正。

[指导教师] 首先，用 Matrigel 按 1:60 的比例在高级 DMMF 12 培养基中稀释后包被六孔板。将包被好的培养板置于 2 至 8 摄氏度的环境中保存。在细胞培养当天，从培养板中移除包被液，加入 1 毫升完全必需八培养基，并添加终浓度为 1 X 的 ROCK 抑制剂。将培养板放入培养箱中，于 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下预平衡，然后再接种人诱导性多能干细胞（iPSCs）。将人 iPSCs 接种于含 ROCK 抑制剂（终浓度为 1 X）的完全必需八培养基中，以增强细胞集落的贴附能力。次日，更换为不含 ROCK 抑制剂的新鲜完全必需八培养基。此后每日更换培养基，直至细胞达到约 80% 汇合度，此过程通常需要 4 至 5 天。当细胞集落达到 80% 汇合度时，加入胶原酶与分散酶的混合液，通过酶法使集落从培养板上脱离。待集落开始隆起后，将培养板从培养箱中取出，加入 2 毫升 DPBS 以中和酶活性。使用 DPBS 轻轻刮下集落，并用宽口 10 毫升移液管将悬液收集至 15 毫升锥形管中。随后，用 10 毫升移液管轻柔吹打悬液 2 至 3 次，使集落分散。静置让集落沉降。约 2 分钟后，吸除上清液中的 DPBS 酶混合液，保留约 1 毫升液体在管中。然后向管中加入 2 毫升 DPBS，通过轻弹管壁重新悬浮集落。再次静置沉降后，重复此洗涤步骤两次，以彻底去除残留酶。去除上清液后，将集落重悬于 1 毫升完全必需八培养基中，并接种至新制备的 Matrigel 包被培养板中。按照前述方法酶法消化人诱导性多能干细胞。将其接种至无黏附性的 100 毫米悬浮培养皿中，使用化学成分明确的培养基。将细胞悬液置于轨道摇床上，在常氧条件下以每分钟 40 转的速度振荡培养 7 天，以促进皮质类球体的形成。第 8 天，将皮质类球体转移至细胞增殖培养基中，继续培养 7 天。为诱导胶质细胞特化，将皮质类球体在胶质细胞富集培养基中孵育 2 周，获得早期胶质类球体。为促进早期胶质类球体成熟，将基础成纤维细胞生长因子（bFGF）替换为 20 纳克/毫升的白血病抑制因子（LIF），并继续维持培养 4 周。

在成熟培养基中培养四周后，继续将球体在胶质细胞富集培养基中维持更长时间。为防止聚集和活力丧失，每两周使用无菌工业刀片机械切割胶质球体。用DNase I（脱氧核糖核酸酶I）完全更换培养基，以去除切割过程中产生的DNA片段。接下来，使用木瓜蛋白酶解离试剂盒将胶质球体解离为星形胶质细胞前体细胞的单层细胞。将解离后的细胞接种至经Matrigel以1:80稀释预包被的细胞培养处理过的贴壁培养皿中。在胶质细胞富集培养基中培养星形胶质细胞前体细胞，直至其融合度达到80%。传代时，移除耗尽的培养基并收集至锥形管中。向细胞中加入酶解细胞解离培养基，静置1至2分钟。待细胞开始脱落时，加入先前收集的耗尽培养基以中和酶活性。收集细胞悬液，在800 × g条件下离心2分钟。弃去上清液后，将细胞重新悬浮于胶质细胞富集培养基中。以每孔约1×10⁶个细胞的密度接种至Matrigel包被（1:80稀释）的培养皿中。进行冷冻保存时，将细胞沉淀重悬于冰冷的冷冻保护剂混合液中（90%皮质球体增殖培养基和10%冷冻保护剂）。将重悬的细胞转移至冻存管中。立即将冻存管放入冻存盒，并于-80摄氏度冰箱中过夜保存。次日，将所有冻存管转移至液氮罐中进行长期储存。通过波形蛋白（Vimentin）和核因子IA（NFIA）标记物的免疫染色对解离后的星形胶质细胞前体细胞进行表征。为确认人诱导多能干细胞（iPSC）来源的星形胶质细胞前体细胞（APCs）的四种脑区特异性，进行针对人叉头框G1（FoxG1）和人同源盒B4（HOXB4）的实时定量PCR分析。将APCs在星形胶质细胞分化培养基中分化14天。以每皿5×10³个细胞的密度将星形胶质细胞接种至35毫米玻璃底培养皿中，用于检测其对三磷酸腺苷（ATP）的反应。让细胞在玻璃底部贴附24小时。用不含钙离子的Hank's平衡盐溶液洗涤贴壁细胞三次。随后，在室温下用含有5 μM比率型荧光染料Fluo-2 AM和0.02% Pluronic F-127的培养基孵育细胞1小时。用培养基洗涤细胞两次后，更换为含2 mmol/L钙离子的Hank's平衡盐溶液。使用配备60倍油镜的聚焦漂移补偿倒置显微镜，以每秒2帧的速度对细胞成像。最后，在第25秒加入ATP至终浓度为5 mmol/L，记录ATP诱导的钙离子反应。人iPSC克隆经免疫染色证实表达多能性标志物Oct4和Nanog。来自脆性X综合征及对照细胞系的APCs中，波形蛋白和NFIA阳性细胞的比例相当。来自对照和脆性X综合征人诱导多能干细胞的星形胶质细胞前体细胞均表现出FoxG1相对于HOXB4的上调，提示其具有前脑特征。源自人iPSC脆性X综合征细胞系的星形胶质细胞中GFAP表达数量减少。对照组与脆性X综合征星形胶质细胞均表现出ATP诱导的钙瞬变，但脆性X综合征星形胶质细胞中的响应细胞数量显著降低。与对照细胞相比，脆性X综合征星形胶质细胞中首次ATP诱发的钙瞬变峰值幅度显著降低。与对照星形胶质细胞相比，人iPSC来源的脆性X综合征星形胶质细胞表现出糖酵解、糖酵解能力和糖酵解储备增加，但最大呼吸能力显著下降。