缺乏脆性 X 信使核糖核蛋白的人诱导多能干细胞来源的星形胶质细胞的产生和表征
June 6th, 2025
在这里，我们描述了一种促进人诱导多能干细胞分化为功能性前脑特异性星形胶质细胞的方案。这使得研究神经胶质细胞在神经发育障碍（如脆性 X 综合征）发病机制中的作用，以及对其他脑部疾病进行建模。
这项工作重点关注四种大脑特异性人类星形胶质细胞，以及它们如何被脆性 X 综合征等神经发育障碍改变。早期的工作主要使用动物模型来研究神经元，因此这项工作为这一研究领域增加了新的维度。
动物研究的机制见解在临床上取得了有限的成功。主要挑战是获得对人类来源的神经元和星形胶质细胞的类似见解。
我们的方案成功地产生了风特异性星形胶质细胞的功能，这些星形胶质细胞在脆性 X 综合征中表现出失调、糖酵解和线粒体代谢，从而能够研究神经胶质细胞在疾病生物学中的作用。尽管越来越多的证据表明神经胶质细胞在健康和疾病中的神经元功能中的关键作用，但人们对人类星形胶质细胞在神经发育障碍（例如脆性 X 综合征）中如何受到影响知之甚少。
展望未来，我们将在此框架的基础上研究星形胶质细胞及其与神经元的相互作用如何因疾病而改变，以及如何通过治疗干预来纠正这些相互作用。
[导师]首先，在六膨胀培养皿中涂上以 1 比 60 的比例稀释的基质胶，在高级 DMMF 12 中。将涂层盘存放在 2 至 8 摄氏度的温度下。在培养当天，从培养皿中取出包衣材料，加入一毫升完整的必需八培养基，以及终浓度为1 X的岩石抑制剂。将培养皿放入培养箱内。在加入人诱导多能干细胞或 IPSC 之前，设置在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳。将人IPSC接种在含有终浓度为1 X的岩石抑制剂的完整必需八培养基中，以增强菌落粘附性。第二天，用不含岩石抑制剂的新鲜培养基替换完整的基本八培养基。继续每天补充培养基，直到细胞达到 80% 汇合度，这大约需要四到五天。当菌落达到 80% 汇合度时，加入胶原酶和分散酶的混合物，以酶促方式将它们从培养皿中分离出来。一旦菌落开始提升，将培养皿从培养箱中取出并加入两毫升DPBS以中和酶活性。使用DPBS，刮掉菌落，并使用宽板10毫升血清移液器将悬浮液收集到15毫升锥形管中。然后，用10毫升血清移液器轻轻研磨悬浮液两到三次以分解菌落。让殖民地定居。大约两分钟后，吸出 DPBS 酶混合物，同时在管中留下大约一毫升液体。然后将两毫升DPBS加入管中，轻轻敲击混合以重新悬浮菌落。让它们沉淀下来，然后重复此过程两次以去除残留的酶。除去上清液后，将菌落重新悬浮在一毫升完整的必需八培养基中，并将它们接种到新鲜制备的基质胶包被培养皿中。如前所述，酶促提升人诱导多能干细胞。将它们接种到装有化学定义培养基的非贴壁100毫米悬浮培养皿上。在常氧条件下，将细胞悬液以每分钟40转的速度放在轨道振荡器上7天，以促进皮质球的发育。在第八天，将皮质球转移到细胞增殖培养基中并维持7天。为了诱导神经胶质细胞规范，将皮质球在神经胶质细胞富集培养基中孵育两周以获得早期神经胶质细胞球。对于早期胶质细胞球体的成熟，用每毫升20纳克白血病抑制因子代替碱性成纤维细胞生长因子H，并维持球体4周。
在成熟培养基中放置四个星期后，继续在神经胶质富集培养基中长时间保持球体。为防止聚集和活力丧失，请使用无菌工业刀片每两周机械切碎一次神经胶质细胞球。用 DNase 1 替换整个培养基，以去除切碎产生的 DNA 片段。接下来，使用木瓜蛋白酶解离试剂盒将神经胶质细胞球解离成单层星形胶质细胞祖细胞。将解离的细胞接种到细胞培养物上，处理过的贴壁培养皿上，预涂有基质胶，稀释度为1至80。在神经胶质细胞富集培养基中繁殖星形胶质细胞祖细胞，直到它们达到80%的汇合度。传代细胞去除用过的培养基并将其收集在锥形管中。将酶细胞分离培养基加入细胞中，等待一到两分钟。一旦细胞开始分离，加入用过的培养基以中和酶活性。收集细胞悬液并以 800 G 离心两分钟。弃去上清液后，将细胞重新悬浮在神经胶质富集培养基中。以 1 到 80 的稀释度将大约 10 乘以每孔 6 个细胞的幂接种到基质胶包被培养皿上。对于冷冻保存，将细胞沉淀重新悬浮在 90% 皮质球增殖培养基和 10% 冷冻保护剂的冷混合物中。将重悬的细胞转移到冷冻瓶中。立即将冷冻瓶移入冷冻盒中，并在零下 80 摄氏度的冰箱中存放过夜。第二天，将所有冷冻瓶转移到液氮罐中进行长期储存。通过波形子和核因子IAM标记物免疫染色来表征解离的星形胶质细胞祖细胞。为了确认人IPSC衍生APC的四个大脑区域特异性，对人叉头盒G1和人同源盒B4进行实时QPCR分析。将APC分化为星形胶质细胞和星形胶质细胞分化培养基14天。将星形胶质细胞以 5 乘以 10 的密度接种在 35 毫米玻璃底培养皿上，每个培养皿 3 个细胞的幂，以测量它们对五磷酸腺苷的反应。让细胞粘附在玻璃底部 24 小时。用不含钙的汉克平衡盐溶液洗涤粘附的细胞三次。然后将细胞在含有五微摩尔比公制二脲化物的培养基中2：00 AM和0.02%多源F127在室温下孵育一小时。用培养基洗涤细胞两次后，用含有汉克平衡盐溶液的两毫摩尔钙替换培养基。在聚焦漂移补偿倒置显微镜上使用 60 倍油浸物镜，以每秒两帧的速度对细胞进行成像。最后，在25秒标记处以5毫摩尔的终浓度添加ATP后记录ATP诱导的钙反应。人IPSC菌落表达多能标记物选择四和纳米，经免疫染色证实。来自脆性 X 综合征和对照系的 APC 显示出相当比例的波形蛋白和 NFIA 阳性细胞。与 HOXB4 相比，来自对照和脆性 X 综合征人类诱导多能干细胞的星形胶质细胞祖细胞表现出 Fox G1 的上调，表明前脑身份。源自人 IPSC 脆性 X 综合征系的星形胶质细胞显示出 GFAP 表达数量减少。对照和脆性 X 综合征星形胶质细胞表现出 ATP 诱导的钙瞬变，但脆性 X 综合征星形胶质细胞的反应者数量显着降低。与对照细胞相比，脆性 X 综合征星形胶质细胞中第一个 ATP 诱发的钙瞬变的峰值幅度显着降低。与对照星形胶质细胞相比，人类 IPSC 衍生的脆性 X 综合征星形胶质细胞显示糖酵解、糖酵解能力和糖酵解储备增加，但最大呼吸显着降低。
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概述
本研究提出了一种将人类诱导多能干细胞（iPSCs）分化为功能性前脑特异性星形胶质细胞的协议。该分化模型允许探索神经发育障碍（如脆性X综合征）中的神经胶质细胞角色，并增强我们对其他脑部疾病的理解。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经发育障碍
- 干细胞生物学
- 细胞分化
背景
- 神经胶质细胞在健康和疾病中显著影响神经元功能。
- 先前的研究主要利用动物模型，关注神经元。
- 来自动物机制研究的见解在临床应用中成功有限。
- 研究人类星形胶质细胞对于理解它们在神经发育障碍中的作用至关重要。
研究目的
- 开发一种从iPSCs生成前脑特异性星形胶质细胞的可靠协议。
- 研究与脆性X综合征相关的星形胶质细胞代谢变化。
- 为针对星形胶质细胞-神经元相互作用的未来治疗干预提供基础。
使用的方法
- 研究采用利用人类iPSCs的细胞培养方法。
- 星形胶质细胞分化包括几个步骤，包括皮层球体的创建和随后的胶质细胞特异化。
- 该方法详细说明了用于增强细胞粘附和生长的特定试剂制备和条件。
- 关键步骤包括酶解分离、培养基更换和培养过程中的小心处理。
- 星形胶质细胞祖细胞的表征包括免疫染色和QPCR分析。
主要结果
- 该协议成功产生了功能性星形胶质细胞，展示了与脆性X综合征相关的代谢关键失调。
- 这些发现加深了对星形胶质细胞在神经发育障碍中的参与的理解。
- 观察到代谢途径的变化，表明潜在的治疗干预目标。
- 研究强调了研究人类来源的细胞以准确模仿疾病状态的必要性。
结论
- 本研究展示了一种从iPSCs分化星形胶质细胞的稳健方法，使探索它们在疾病中的角色成为可能。
- 获得的见解可以为解决神经发育障碍的未来策略提供信息。
- 理解人类星形胶质细胞中的特定代谢挑战为新的治疗途径铺平了道路。
常见问题
Executive Industry Relevance
Human iPSC-derived astrocyte models lacking FMRP enable mechanistic de-risking of neurodevelopmental disorder targets beyond neuron-centric systems. This platform supports predictive confidence in glial contributions to disease biology, addressing a critical gap in early discovery and translational research for Fragile X syndrome and related disorders. Integrating human astrocyte models into the pipeline enhances portfolio decision-making by clarifying cell-autonomous and non-cell-autonomous mechanisms.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of glial-specific disease mechanisms in a human genetic context.
- Supports functional target validation by linking astrocyte metabolic dysregulation to disease phenotypes.
- Facilitates mechanistic de-risking for glia-targeted therapeutic hypotheses.
- Improves predictive confidence for advancing glial targets in neurodevelopmental pipelines.
Screening & Assay Development
- Provides a reproducible source of forebrain-specific human astrocytes for assay development.
- Enables quantitative measurement of calcium signaling and metabolic outputs in disease-relevant cells.
- Supports standardization of functional assays for compound screening in glial systems.
- Prepares validated cellular models for downstream screening and mechanistic studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro findings with human disease biology for translational biomarker exploration.
- Bridges discovery-stage mechanistic insights to preclinical model selection and validation.
- Enables risk-adjusted advancement of glia-targeted programs based on human-relevant data.
- Supports continuity from early discovery through preclinical evaluation of astrocyte function.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol positions human iPSC-derived astrocytes as a foundational tool from early discovery through preclinical research, enabling hypothesis testing and mechanistic de-risking in neurodevelopmental disorder pipelines.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing of glial involvement in disease mechanisms.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts for functional and metabolic assays.
- Analytics: Enables statistical comparison of calcium signaling and metabolic phenotypes between control and disease lines.
- Translational Research: Provides a human-origin system for aligning in vitro findings with clinical biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reusable platform for diverse neurodevelopmental disorder investigations.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in glial target validation.
- Operational Value: Standardizes astrocyte generation and functional characterization for cross-program comparability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and capital allocation for glia-focused discovery programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neurodevelopmental disorder assets based on human-relevant data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in human iPSC culture, differentiation, and glial biology.
- Demands access to advanced imaging and metabolic analysis instrumentation.
- Necessitates cross-team standardization of differentiation and assay protocols.
- May require adaptation for other brain regions or disease-relevant genetic backgrounds.
- Functional outputs depend on robust quality control of astrocyte identity and maturity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:33
Maintenance and Expansion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)
4:17
Generation and Characterization of Astrocytic Progenitor Cells (APCs)
7:57
Characterization of a Homogeneous Population of Forebrain-Specific Astrocytes
9:22
Results
