Name: 缺乏脆性 X 信使核糖核蛋白的人诱导多能干细胞来源的星形胶质细胞的产生和表征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-06T14:35:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: 了解如何利用人诱导多能干细胞分化生成前脑特异性星形胶质细胞，并表征脆性X综合征相关的代谢异常。该方法为研究神经发育障碍中胶质细胞功能提供了可靠的人类细胞模型。

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感谢Sumantra Chattarji教授提供的内部经费支持。感谢Gaiti Hasan教授提供钙成像设备的使用权限，感谢国家生物科学中心中央成像与流式平台、Padmanabh Singh和Prangya Hota在稿件校对和建议方面提供的帮助，并感谢Labmate Asia团队在开展Seahorse XF检测过程中给予的协助。

所有使用人诱导性多能干细胞（hiPSCs）（表1）的实验均在获得相应的机构监管批准后进行。图1A展示了hiPSCs向成熟的前脑特异性星形胶质细胞分化的完整方案。
1. 人类诱导性多能干细胞的维持与扩增
<ol>
	<li>铺板iPSC前一天，用1:60稀释的Matrigel（一种细胞外基质[ECM]）在Advanced Dulbecco改良Eagle培养基/Ham's F-12（DMEM/F12）中包被6孔板，置于2–8 °C保存 &#176;C. 
	注意：避免储存已包被 Matrigel 的培养皿 &#62;2-8℃下5天 &#176;C，因为这可能会随时间推移导致细胞外基质（ECM）中的蛋白质降解。为防止培养皿干燥，每6孔板的一个孔中至少加入1 mL以1:60稀释的Matrigel，并均匀铺展至整个孔底。若当天使用，将培养板置于37℃湿润培养箱中保存。 &#176;C 和 5% CO₂2 1小时。</li>
	<li>培养 hiPSCs 当天，去除包被材料，加入 1 mL 完全 Essential 8 培养基（E8 基础培养基加 Essential 8 添加剂）以及终浓度为 1x 的 ROCK 抑制剂，并将培养皿置于 37 &#176;C 和 5% CO2 在添加hiPSCs之前，先将培养箱预热。</li>
	<li>将hiPSCs重悬于含ROCK抑制剂（终浓度为1x）的完全E8培养基中，以促进细胞集落更好地贴壁。 
	注意：不要配制大量培养基。最多仅配制3-4天的用量，并于2-8℃保存。 &#176;C.</li>
	<li>次日，更换不含ROCK抑制剂的完全E8培养基，直至细胞汇合度达到80%（约4-5天）。</li>
	<li>当细胞达到80%融合度时，通过酶法解离集落。
	<ol>
		<li>传代iPSC时，移除培养皿中的耗尽培养基，并向每孔加入1 mL预热（37 °C）的PBS。 &#176;C) 胶原酶（2 mg/mL）与分散酶（1 mg/mL）按1:1比例混合，在37℃孵育 &#176;在室温下孵育超过20-30分钟，以使iPSC集落脱落。 
		注意：切勿将培养皿置于 37 &#176;C 超过 20–30 分钟；超过此时间，细胞集落将解体，细胞会死亡。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>当菌落开始隆起时，将培养皿从培养箱中取出，并加入 2 mL 磷酸盐缓冲液（DPBS）以中和酶活性。</li>
	<li>用DPBS刮下菌落，并使用宽口10 mL移液管将悬液收集至15 mL锥形管中。</li>
	<li>使用10 mL血清移液管将悬液轻柔吹打2-3次以分散细胞集落，随后静置使集落沉降。 
	注意：不要将细胞集落消化成单细胞，这可能导致细胞无法贴壁并增加细胞死亡。此外，也不要让集落过大，否则后续会导致更多的细胞发生分化。</li>
	<li>待菌落沉降后（约2分钟后），吸除DPBS酶混合液，保留约1 mL于管中。</li>
	<li>向管中加入 2 mL DPBS，通过轻弹管壁混匀细胞团块，静置使其沉降。重复此步骤 2 次，以彻底去除细胞团块中残留的酶。第二次洗涤后，尽可能吸除上清液。nd 洗涤，将集落重悬于1 mL完全E8培养基中，并按照步骤1.2-1.3所述接种至新制备的培养皿中。</li>
	<li>或者，使用含10%二甲基亚砜（DMSO）的冷冻保护液对部分克隆进行冷冻保存，以备后续扩增和使用。
	<ol>
		<li>新鲜配制冻存培养基，将90%完全E8培养基与10% DMSO混合作为冷冻保护液，并置于2-8℃ &#176;C，直至使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为进行冷冻保存，请遵循步骤 1.5–1.10。</li>
	<li>在步骤 1.10 中，经过 2nd 洗涤，静置使细胞团沉降，移除上清液。向细胞团中加入1 mL新鲜配制的预冷冻存液，转移至冻存管中。 
	注意：在将冻存培养基加入菌落之后，需迅速将内容物转移至冻存管中。延迟操作可能导致复苏率降低，因为二甲基亚砜（DMSO）是一种冷冻保护剂，可&#160;损伤细胞。</li>
	<li>立即将冻存管转移至冻存盒中，并置于 -80 &#176;-80°C 冰箱中过夜。</li>
	<li>第二天，将所有冻存管转移至液氮罐（LN2 储液罐）以备将来使用。 
	注意：应使用G显带技术对hiPSCs进行常规核型分析（补充图 S1）是否存在任何异常，使用免疫细胞化学方法对多能性进行表征（图1B，并进行支原体检测。
	<ol>
		<li>为通过免疫细胞化学表征人诱导多能干细胞（hiPSCs），将细胞集落接种于经1:60 Matrigel包被并高压灭菌的13 mm圆形玻璃盖玻片上。&#160;当细胞融合度达到40%时，用PBS-T（PBS-0.1% Tween 20）洗涤细胞，随后用4%多聚甲醛固定10分钟，再用含0.3% Triton X-100的PBS溶液透化处理10分钟，最后用含3%牛血清白蛋白（BSA）的PBS溶液封闭1小时，以防止非特异性结合。</li>
		<li>封闭后，将培养物与一抗在室温下孵育1小时，随后用PBS-T洗涤3次&#160;5 分钟，随后加入相应的二抗（材料表在暗处孵育1小时。</li>
		<li>将盖玻片用封片剂固定于载玻片上，使用共聚焦激光扫描显微镜在405 nm、488 nm、561 nm和633 nm波长下采集图像；设置图像分辨率为512 × 512像素，Z轴步长为0.5 &#181;m，针孔直径为1 airy单位。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 星形胶质前体细胞（APCs）的生成与表征
<ol>
	<li>按照步骤1.5-1.10所述，用酶法消化hiPSCs，并将其接种至非黏附性悬浮培养皿（100 mm）中，加入化学成分明确的培养基14&#160;含50% Iscove改良Dulbecco培养基（IMDM）、50% Ham's F-12营养混合物（F12）、5 mg/mL BSA、1% 化学成分确定脂质浓缩液（CD-Lipid）、450 &#181;M 单硫代甘油，7 &#181;微克/毫升胰岛素，15 &#181;微克/毫升转铁蛋白，1%青霉素-链霉素，添加前脑模式化有丝分裂原 N乙酰半胱氨酸（1 mM），LDN 193189（0.1 &#181;M）和 SB431542（10 &#181;7天 
	注意：小分子抑制剂 SB431542 和 LDN-193189（LDN）分别为骨形态发生蛋白和转化生长因子-β 信号通路的抑制剂。 
	从此时起，每隔两天更换一次培养基，或按照周一/周三/周五的方案进行更换。</li>
	<li>将细胞悬液置于常氧条件下，以40 rpm的速度在轨道摇床上孵育7天，以促进皮质球的发育（图1A).</li>
	<li>第8天，将皮质类球体转移至细胞增殖培养基中培养7天，培养基包含Advanced DMEM/F12、1% 抗生素-抗真菌剂、1% N2添加剂、1% 谷氨酰胺替代物、0.1% B27添加剂以及2.5 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）。</li>
	<li>通过将类球体置于胶质细胞富集培养基中诱导其向胶质细胞定向分化，培养基包含Advanced DMEM/F12，添加1% 抗生素-抗真菌剂、1% N2、1% 谷氨酰胺替代物、0.1% B27添加剂、20 ng/mL 表皮生长因子（EGF）、bFGF-H（20 ng/mL bFGF-5 mg/mL 肝素），持续培养2周，获得早期胶质类球体（图1A).</li>
	<li>为促进早期胶质球成熟，将bFGF-H替换为20 ng/mL白血病抑制因子（LIF），并将胶质球维持培养4周。</li>
	<li>在成熟培养基中培养4周后，将类球体转入胶质细胞富集培养基中进行长期维持。为防止聚集和细胞活力丧失，每2周使用无菌工业刀片对胶质类球体进行机械切割，并用含DNase I的培养基完全更换原有培养基，以清除切割过程中产生的DNA片段。</li>
	<li>使用木瓜蛋白酶解离试剂盒将神经胶质球解离为星形胶质前体细胞的单层，接种至经1:80稀释Matrigel包被的细胞培养处理过的贴壁培养皿中。</li>
	<li>在胶质细胞富集培养基中培养APCs，直至细胞融合度达到80%，然后使用酶解细胞解离培养基进行酶消化传代（参见 材料表).</li>
	<li>传代：
	<ol>
		<li>吸除废液并收集至锥形管中。向细胞中加入酶解细胞解离液，静置1-2分钟。待细胞开始脱落时，加入上述废液以中和酶活性。</li>
		<li>收集细胞悬液，在800 x&#160;ɡ 2 分钟。</li>
		<li>吸弃上清液，将细胞重悬于胶质细胞富集培养基中，并接种约 1 x&#160;106 每孔接种于经1:80 Matrigel包被的6孔板中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用于冷冻保存：
	<ol>
		<li>将细胞重悬于冰冷的90%皮质球增殖培养基（不含bFGF）与10%冷冻保护剂的混合液中。将重悬的细胞转移至冻存管中。</li>
		<li>立即将冻存管转移至冻存盒中，并置于 -80 &#176;C冰箱过夜</li>
		<li>第二天，将所有冻存管转移至液氮罐（LN2 储液罐）以备将来使用。 
		注意：APCs 使用 10% DMSO 冻存，直至第 6 代。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过波形蛋白（vimentin）和核因子 IA（Nuclear Factor IA, NFIA）标记物对解离的星形胶质前体细胞（APCs）进行免疫染色表征（如步骤 1.15.1–1.15.3 所述）图1C，D）（参见 材料表 用于稀释。</li>
	<li>为确认由hiPSC衍生的APC具有前脑区域特异性，可采用实时定量qPCR检测前脑标志物（如人叉头盒G1（hFOXG1），预期为阳性）和后脑标志物（如人同源框B4（hHOXB4），预期为阴性）图1E，F). 
	注意：本实验所用引物序列已列于下文 补充表 S1.</li>
</ol>
3. 生成并表征均一的前脑特异性星形胶质细胞群体
<ol>
	<li>星形胶质细胞从星形胶质前体细胞的分化
	<ol>
		<li>使用星形胶质细胞分化培养基（ADM）培养14天，将星形胶质细胞前体细胞（APCs）分化为星形胶质细胞。星形胶质细胞分化培养基包含Neurobasal、1% 抗生素-抗真菌剂、1% 谷氨酰胺替代物、1% N2添加剂、0.2% B27添加剂、1% 非必需氨基酸培养基（NEAA）以及10 ng/mL睫状神经营养因子（CNTF）。</li>
		<li>通过胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和 S100 的免疫染色（如步骤 1.15.1–1.15.3 所述）确认星形胶质细胞身份&#946; 表达标志物（图2A,B).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从头合成 APCs 和星形胶质细胞中的蛋白质合成
	<ol>
		<li>将hiPSC来源的前脑APC和星形胶质细胞培养在无菌高压灭菌的13 mm玻璃盖玻片上，并按照步骤1.15.1-1.15.3中所述进行免疫染色。</li>
		<li>对于 从头合成 蛋白质合成，使用荧光非经典氨基酸标记（FUNCAT）方法，简要说明见步骤 3.2.3-3.2.6（图3A).</li>
		<li>为确保甲硫氨酸缺乏，将培养物中的生长培养基移除，并替换为含1 mM L-叠氮高丝氨酸（AHA）的无甲硫氨酸和无半胱氨酸培养基，于37℃孵育30分钟 &#176;C 和 5% CO2.</li>
		<li>用 PBS-T 洗涤细胞，4% 多聚甲醛固定 10 分钟，PBS 中含 0.3% Triton X-100 透化处理 10 分钟，再用 PBS 中含 3% BSA 封闭 1 小时，以防止非特异性结合。</li>
		<li>在室温下避光孵育培养物1小时，加入Click化学反应混合液和炔烃标记的Alexa Fluor 647，随后加入一抗孵育1小时，再加入相应的二抗材料表）孵育1小时（图3B).</li>
		<li>将盖玻片用封片剂封固于载玻片上，并用于后续图像分析。
		<ol>
			<li>使用共聚焦激光扫描显微镜在405 nm、488 nm、561 nm和633 nm波长下采集图像。</li>
			<li>以 512 × 512 像素采集图像；将 Z 步长设为 0.5 &#181;m，针孔直径为1 airy unit。</li>
			<li>在不同细胞类型间保持显微镜和成像参数的设置恒定。在同一实验批次中采集每个生物学重复的图像。</li>
			<li>使用任何标准图像分析软件（例如 Fiji 或 Imaris）进行强度测量。在 Imaris 中，使用 SURFACES 模块对表达荧光非经典氨基酸标记（FUNCAT）信号且分别表达波形蛋白（Vimentin，APCs）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP，星形胶质细胞）的细胞体进行体积测量，并将体素范围限定在 250–350 以去除碎片。 
			注意：针对两种细胞类型的所有生物学重复，均需保持参数一致。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>腺苷 5&#8242;三磷酸腺苷（ATP）诱导的振荡性钙波
	<ol>
		<li>将星形胶质细胞接种于玻璃底培养皿（35 mm）中，密度为 5 &#215; 103 每皿细胞用于检测对ATP的细胞反应。</li>
		<li>让细胞在玻璃底部黏附 24 小时，用 HBSS（20 mM HEPES、137 mM NaCl、5 mM KCl、10 mM 葡萄糖、1 mM MgCl₂）洗涤 3 次2，pH = 7.3）中不含钙，并在含 5 的培养基中孵育 &#181;M比值法使用荧光染料Fura-2AM及0.02% Pluronics F127，在室温下孵育1小时。 
		注意：Fura-2AM 是一种对光和温度敏感的化学物质，需在 -20 ℃ 下保存 &#176;C.</li>
		<li>孵育结束后，用培养基洗涤2次，并更换为含2 mM Ca的培养基2+ 使用含HBSS的溶液，在具备焦点漂移补偿功能的倒置显微镜下，采用60倍油镜（1.35 NA）以每秒2帧的速度对细胞进行成像。</li>
		<li>通过浴式施加终浓度为 5 mM 的 ATP，记录 ATP 诱导的钙反应，温度为 25th s (图4A).</li>
		<li>使用 Fiji/ImageJ 在每个细胞周围绘制感兴趣区域，并计算所有时间点的 F340/F380 比值（图4B).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞代谢检测 
	注意：活细胞的耗氧率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR）按照制造商的说明书进行测定（参见 材料表).
	<ol>
		<li>实验前一天，让星形胶质细胞贴附于微孔板（1.5 &#215; 104 在CNTF培养基中以特定的接种密度接种，并在37℃下孵育 &#176;C，5% CO₂2.</li>
		<li>对于糖酵解应激实验：
		<ol>
			<li>将细胞培养基更换为添加了 2 mM 谷氨酰胺（pH 调至 7.4）的基础培养基，并在非 CO₂2 37℃培养箱 &#176;C，1 小时。 
			注意：pH 必须在 37 &#176;C 水浴</li>
			<li>将 cartridge 板插入仪器以校准传感器。校准完成后，将 cartridge 板替换为细胞培养板，并加入以下试剂盒组分，终浓度为：10 mM 葡萄糖，1 &#181;M 寡霉素和 50 mM 2-脱氧葡萄糖（2-DG）（图 5A).</li>
			<li>测试结束时，裂解细胞并测定总蛋白含量。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>对于线粒体应激检测：
		<ol>
			<li>将含CNTF的培养基更换为添加了2 mM谷氨酰胺、1 mM丙酮酸、10 mM葡萄糖（pH调整至7.4）的基础培养基，并于37℃水浴中孵育 &#176;C.</li>
			<li>将培养板置于非 CO₂ 培养箱中孵育2 37℃培养箱 &#176;C 反应 1 小时。同时，将 cartridge plate 插入仪器以校准传感器。</li>
			<li>校准后，将试剂盒组分以终浓度为1.5的细胞培养板替换卡盒板 &#181;M 寡霉素，1 &#181;M 羰基氰化物-4（三氟甲氧基）苯腙（FCCP），以及 0.5 &#181;M 罗滕酮/抗霉素 A（图 5C).</li>
			<li>测试结束时，裂解细胞并测定总蛋白含量。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

本文描述了一种生成人诱导多能干细胞（iPSC）来源的星形胶质细胞的方法，该细胞可作为表征脆性X综合征（FXS）诱导的功能性变化的检测平台。这些星形胶质细胞在培养中具有功能活性，并表现出多种特性，本研究通过一系列测量手段对此进行了验证。本方案中的关键步骤是利用酶消化法将iPSC初始转化为皮质球状体（corticospheres）。在此阶段，优化IV型胶原酶和分散酶的孵育时间至关重要。若未优化，可能导致iPSC解体或形成单细胞，从而阻碍皮质球状体的形成。这些皮质球状体通过双SMAD抑制法诱导其向端脑特异性方向分化15，并进一步分化为星形胶质细胞前体细胞（APC）。为获得高比例的APC群体，胶质球状体的机械切割至关重要。可通过实时定量qPCR验证其端脑特异性：与脊髓标志物HOXB4相比，我们观察到端脑标志物FOXG1的表达显著升高。
然后使用CNTF（JAK-STAT信号通路的激活剂）将APC分化为星形胶质细胞16。本研究的结果表明，由脆性X综合征（FXS）...

脆性X综合征（FXS）是一种常见的遗传性智力障碍和自闭症谱系障碍（ASD），由脆性X智力低下1号基因（FMR1）所编码的脆性X信使核糖核蛋白（FMRP）缺失所致。FMR1) 基因（OMIM: #300624,&#160;https://www.omim.org/entry/300624)。FMRP 在 mRNA 翻译调控、mRNA 颗粒的形成与运输以及 microRNA 介导的基因表达调控中发挥重要作用。1因此，FMRP的缺失不仅影响大脑发育，还影响成年大脑的功能。两种mRNA转录水平 FMR1 脑组织中FMRP的免疫染色显示神经元表达水平较高，同时胶质细胞中也有显著表达2然而，以往在脆性X综合征动物模型中的大多数研究主要集中在神经元及其功能异常上。因此，关于胶质细胞在脆性X综合征中的作用，目前知之甚少。3传统上被认为 &#34;被动支持&#34; 细胞4，越来越多的证据表明星形胶质细胞在介导多种神经元功能中起着关键作用5,6，包括促进突触生成7，发育中神经回路的精细化8，以及神经递质再循环9与此同时，越来越多的证据表明星形胶质细胞在疾病发病机制中发挥重要作用，许多神经系统疾病已被证实与星形胶质细胞功能障碍相关10.
尽管早期利用脆性X综合征（FXS）动物模型的研究主要集中在鉴定和验证用于治疗FXS的多种神经元分子靶点上，但这些临床前研究结果并未始终转化为成功的临床疗效。此外，近期临床试验中的挫折也凸显了建立基于人类的模型系统的重要性。基于人类干细胞来源的脑细胞所构建的神经系统疾病模型，为弥合动物研究中获得的机制性认识与患者临床疗效有限之间的鸿沟提供了一种强有力的策略。然而，仅有少数研究关注星形胶质细胞，且其中大多数研究的星形胶质细胞来源于脊髓。这一点尤为重要，因为已有研究表明，星形胶质细胞的结构和功能在不同脑区之间存在差异11，12。因此，要更深入地理解疾病引起的人类星形胶质细胞变化，也必须考虑这些脑区特异性的差异。然而，针对前脑特异性的人类干细胞来源星形胶质细胞在神经发育障碍模型中的研究仍相对不足13。因此，为初步填补这一空白，本文描述了从携带FXS突变的患者来源诱导多能干细胞（iPSCs）分化生成前脑特异性星形胶质细胞的技术方案；此外，我们还证明了这些星形胶质细胞具有功能性，并表现出代谢异常。

<table><tbody><tr><td>1-硫代甘油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>Accutase&amp;nbsp;溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6964</td><td>酶解细胞脱离培养基&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>5&amp;prime;-三磷酸腺苷镁盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F-12</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12634010</td><td></td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌素（100倍浓缩）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>B-27添加剂（50倍浓缩），无血清</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>化学成分明确的脂质浓缩液</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11905031</td><td></td></tr><tr><td>IV型胶原酶，粉末</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>脱氧核糖核酸酶I</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LK003170</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II，粉末</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>无钙无镁DPBS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Essential 8培养基</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1517001</td><td></td></tr><tr><td>FXS1, FXS2&amp;nbsp;</td><td>Coriell医学研究所&amp;nbsp;</td><td>GM07072, GM05848</td><td>FXS患者细胞</td></tr><tr><td>GlutaMAX添加剂</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>35050061</td><td>谷氨酰胺替代物</td></tr><tr><td>Ham's F-12营养混合物</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11765054</td><td></td></tr><tr><td>健康对照细胞&amp;nbsp;</td><td>西达斯-西奈医学中心&amp;nbsp;</td><td>ND30625</td><td>健康对照细胞&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>猪肠黏膜来源肝素钠盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12440053</td><td></td></tr><tr><td>人胰岛素</td><td>Roche</td><td>11376497001</td><td></td></tr><tr><td>LDN 193189&amp;nbsp;</td><td>Stratech Scientific</td><td>S2618-SEL</td><td></td></tr><tr><td>人白血病抑制因子</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5283</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel&amp;nbsp;生长因子减少型（GFR）基底膜基质</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>MEM非必需氨基酸溶液（100倍浓缩）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>小鼠碱性成纤维细胞生长因子（FGF-2/bFGF）重组蛋白</td><td>Peprotech</td><td>450-33</td><td></td></tr><tr><td>Mr. Frosty冷冻容器</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>5100-0001</td><td>冻存盒</td></tr><tr><td>N-2添加剂（100倍浓缩）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>N-乙酰-L-半胱氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal培养基</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Nunc生物样本库与细胞培养用冻存管</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>377267</td><td></td></tr><tr><td>Nunc细胞培养处理6孔板</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>木瓜蛋白酶解离系统</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LK003150</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>重组人CNTF蛋白，CF&amp;nbsp;</td><td>R&amp;D Systems</td><td>257-NT-010</td><td></td></tr><tr><td>重组人EGF蛋白，CF</td><td>R&amp;D Systems</td><td>236-EG-01M</td><td></td></tr><tr><td>RevitaCell添加剂（100倍浓缩）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A2644501</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Tocris</td><td>1614</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XFe24分析仪&amp;nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XF细胞线粒体应激测试试剂盒</td><td>Agilent Technologies</td><td>103015-100</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XF糖酵解应激测试试剂盒</td><td>Agilent Technologies</td><td>103020-100</td><td></td></tr><tr><td>组织培养皿-100 cm</td><td>Biostar Lifetech</td><td>TCD000100</td><td></td></tr><tr><td>转铁蛋白</td><td>Roche</td><td>10652202001</td><td></td></tr><tr><td>VWR剃刀刀片</td><td>VWR International</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;抗体&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;一抗&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;稀释比例&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Oct4 (C-10)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-5279</td><td>稀释比例：1:250&lt;br/&gt; 二抗：山羊抗小鼠IgG，Alexa Fluor 568</td></tr><tr><td>Nanog</td><td>R &amp; D Systems</td><td>AF1997</td><td>稀释比例：1:100&lt;br/&gt; 二抗：驴抗山羊IgG，Alexa Fluor 488</td></tr><tr><td>Vimentin</td><td>Abcam</td><td>Ab5733</td><td>稀释比例：1:500&lt;br/&gt; 二抗：山羊抗鸡IgY，Alexa Fluor 488</td></tr><tr><td>NFIA</td><td>Abcam</td><td>Ab41851</td><td>稀释比例：1:500&lt;br/&gt; 二抗：山羊抗兔IgG，Alexa Fluor 568</td></tr><tr><td>GFAP-cy3</td><td>Sigma</td><td>C9205</td><td>稀释比例：1:500&lt;br/&gt; 二抗：无</td></tr><tr><td>GFAP</td><td>DAKO</td><td>Z0334</td><td>稀释比例：1:500&lt;br/&gt; 二抗：山羊抗兔IgG，Alexa Fluor 568</td></tr><tr><td>S100&amp;beta;</td><td>DAKO</td><td>IR504</td><td>稀释比例：1:500&lt;br/&gt; 二抗：山羊抗兔IgG，Alexa Fluor 488</td></tr><tr><td>抗核抗体，克隆号235-1</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB1281</td><td>稀释比例：1:1000&lt;br/&gt; 二抗：山羊抗小鼠IgG1，Alexa Fluor 555</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;二抗&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;稀释比例&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠IgG，Alexa Fluor 568</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>A11004</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>驴抗山羊IgG，Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>A11055</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>山羊抗鸡IgY，Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>A11039</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>山羊抗兔IgG，Alexa Fluor 568</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>A11011</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>山羊抗兔IgG，Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>A11034</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠IgG1，Alexa Fluor 555</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>A21127</td><td>1:1000</td></tr></tbody></table>

生成与表征缺失脆性x智力低下核糖核蛋白的人诱导多能干细胞来源星形胶质细胞

Generation and Characterization of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Astrocytes Lacking Fragile X Messenger Ribonucleoprotein

脆性X综合征（FXS）是导致自闭症谱系障碍和智力障碍的主要遗传性病因，已通过啮齿类动物模型得到广泛研究。近年来，人类干细胞来源的模型系统也被用于深入探讨FXS病理生理机制。然而，这些研究几乎完全集中于神经元。此外，尽管越来越多的证据表明胶质细胞在健康和疾病状态下的神经功能中起关键作用，但关于FXS如何影响人类星形胶质细胞，目前仍知之甚少。
因此，在本研究中，我们成功建立了一种方案，该方案能够捕捉大脑发育过程中的关键时空节点，同时也与胶质细胞生成过程相一致。这一方案为研究神经发育障碍提供了一个有用的框架。首先，我们通过双抑制母亲抗十胜肽（Suppressor of Mothers&#160;against Decapentaplegic, SMAD）信号通路并结合小分子化合物，将人诱导性多能干细胞定向分化为神经外胚层谱系。随后，我们利用特定的生长因子和细胞因子，生成了对照组（CTRL）以及脆性X综合征（FXS）患者来源的星形胶质前体细胞（APCs）。使用睫状神经营养因子（ciliary neurotrophic factor）——一种促分化细胞因子——处理APCs，可调控并驱动前体细胞向星形胶质细胞成熟方向分化，最终获得表达前脑特异性胶质纤维酸性蛋白的星形胶质细胞。
我们发现，这些星形胶质细胞具有功能活性，表现为对ATP刺激产生钙离子反应，并且在脆性X综合征（FXS）中表现出糖酵解和线粒体代谢的失调。综上所述，这些发现提供了一个来源于人类的有用实验平台，可用于研究神经发育障碍导致的星形胶质细胞功能改变所引发的细胞自主性和非细胞自主性后果。

采用市售的确定性培养基维持人诱导性多能干细胞（hiPSC）集落，并对多能性标志物 Oct4 和 Nanog 进行免疫染色（图1B）。脆性X综合征（FXS）和对照（CTRL）神经前体细胞（APC）中，波形蛋白（vimentin）和 NFIA 免疫阳性细胞的比例均高度富集且相当（图1C、D）。我们发现，来源于健康人和FXS患者的hiPSC所获得的APC中，FOXG1 相较于 HOXB4 表达显著上调（图1F），表明其具有以端脑为主的细胞身份。与对照星形胶质细胞相比，FXS组中表达GFAP的星形胶质细胞数量显著减少，但表达S100β的星形胶质细胞数量未受影响（图2B）。Western blot分析显示，由两种FXS细胞系生成的星形胶质细胞均缺乏FMRP蛋白的表达（<stro...

本文介绍了一种促进人诱导性多能干细胞分化为功能性前脑特异性星形胶质细胞的实验方案。该方法可用于研究胶质细胞在神经发育障碍（如脆性X综合征）发病机制中的作用，并可用于其他脑部疾病的建模。

生成与表征缺失脆性X智力低下核糖核蛋白的人诱导多能干细胞来源星形胶质细胞

脆性X综合征（Fragile X syndrome, FXS）是导致自闭症谱系障碍和智力障碍的主要遗传性病因之一，已利用啮齿类动物进行了广泛研究……

本研究聚焦于四种特定的人类脑星形胶质细胞，以及脆性X综合征等神经发育障碍如何改变这些细胞。以往的研究主要利用动物模型来研究神经元，因此本工作为该研究领域增添了新的维度。来自动物研究的机制性见解在临床应用中取得的成功有限。主要挑战在于如何获得与人类来源的神经元和星形胶质细胞相关的类似认知。本方案成功生成了功能性星形胶质细胞，这些细胞在脆性X综合征中表现出糖酵解和线粒体代谢的失调，从而能够深入探究胶质细胞在疾病生物学中的作用。尽管越来越多的证据表明胶质细胞在健康和疾病状态下的神经元功能中起关键作用，但目前对脆性X综合征等神经发育障碍中人类星形胶质细胞如何受影响仍知之甚少。展望未来，我们将在此框架基础上进一步研究疾病如何改变星形胶质细胞及其与神经元的相互作用，以及这些改变如何通过治疗干预得以纠正。[指导教师] 首先，用 Matrigel 按 1:60 的比例在高级 DMMF 12 培养基中稀释后包被六孔板。将包被好的培养板置于 2 至 8 摄氏度的环境中保存。在细胞培养当天，从培养板中移除包被液，加入 1 毫升完全必需八培养基，并添加终浓度为 1 X 的 ROCK 抑制剂。将培养板放入培养箱中，于 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下预平衡，然后再接种人诱导性多能干细胞（iPSCs）。将人 iPSCs 接种于含 ROCK 抑制剂（终浓度为 1 X）的完全必需八培养基中，以增强细胞集落的贴附能力。次日，更换为不含 ROCK 抑制剂的新鲜完全必需八培养基。此后每日更换培养基，直至细胞达到约 80% 汇合度，此过程通常需要 4 至 5 天。当细胞集落达到 80% 汇合度时，加入胶原酶与分散酶的混合液，通过酶法使集落从培养板上脱离。待集落开始隆起后，将培养板从培养箱中取出，加入 2 毫升 DPBS 以中和酶活性。使用 DPBS 轻轻刮下集落，并用宽口 10 毫升移液管将悬液收集至 15 毫升锥形管中。随后，用 10 毫升移液管轻柔吹打悬液 2 至 3 次，使集落分散。静置让集落沉降。约 2 分钟后，吸除上清液中的 DPBS 酶混合液，保留约 1 毫升液体在管中。然后向管中加入 2 毫升 DPBS，通过轻弹管壁重新悬浮集落。再次静置沉降后，重复此洗涤步骤两次，以彻底去除残留酶。去除上清液后，将集落重悬于 1 毫升完全必需八培养基中，并接种至新制备的 Matrigel 包被培养板中。按照前述方法酶法消化人诱导性多能干细胞。将其接种至无黏附性的 100 毫米悬浮培养皿中，使用化学成分明确的培养基。将细胞悬液置于轨道摇床上，在常氧条件下以每分钟 40 转的速度振荡培养 7 天，以促进皮质类球体的形成。第 8 天，将皮质类球体转移至细胞增殖培养基中，继续培养 7 天。为诱导胶质细胞特化，将皮质类球体在胶质细胞富集培养基中孵育 2 周，获得早期胶质类球体。为促进早期胶质类球体成熟，将基础成纤维细胞生长因子（bFGF）替换为 20 纳克/毫升的白血病抑制因子（LIF），并继续维持培养 4 周。在成熟培养基中培养四周后，继续将球体在胶质细胞富集培养基中维持更长时间。为防止聚集和活力丧失，每两周使用无菌工业刀片机械切割胶质球体。用DNase I（脱氧核糖核酸酶I）完全更换培养基，以去除切割过程中产生的DNA片段。接下来，使用木瓜蛋白酶解离试剂盒将胶质球体解离为星形胶质细胞前体细胞的单层细胞。将解离后的细胞接种至经Matrigel以1:80稀释预包被的细胞培养处理过的贴壁培养皿中。在胶质细胞富集培养基中培养星形胶质细胞前体细胞，直至其融合度达到80%。传代时，移除耗尽的培养基并收集至锥形管中。向细胞中加入酶解细胞解离培养基，静置1至2分钟。待细胞开始脱落时，加入先前收集的耗尽培养基以中和酶活性。收集细胞悬液，在800 × g条件下离心2分钟。弃去上清液后，将细胞重新悬浮于胶质细胞富集培养基中。以每孔约1×10⁶个细胞的密度接种至Matrigel包被（1:80稀释）的培养皿中。进行冷冻保存时，将细胞沉淀重悬于冰冷的冷冻保护剂混合液中（90%皮质球体增殖培养基和10%冷冻保护剂）。将重悬的细胞转移至冻存管中。立即将冻存管放入冻存盒，并于-80摄氏度冰箱中过夜保存。次日，将所有冻存管转移至液氮罐中进行长期储存。通过波形蛋白（Vimentin）和核因子IA（NFIA）标记物的免疫染色对解离后的星形胶质细胞前体细胞进行表征。为确认人诱导多能干细胞（iPSC）来源的星形胶质细胞前体细胞（APCs）的四种脑区特异性，进行针对人叉头框G1（FoxG1）和人同源盒B4（HOXB4）的实时定量PCR分析。将APCs在星形胶质细胞分化培养基中分化14天。以每皿5×10³个细胞的密度将星形胶质细胞接种至35毫米玻璃底培养皿中，用于检测其对三磷酸腺苷（ATP）的反应。让细胞在玻璃底部贴附24小时。用不含钙离子的Hank's平衡盐溶液洗涤贴壁细胞三次。随后，在室温下用含有5 μM比率型荧光染料Fluo-2 AM和0.02% Pluronic F-127的培养基孵育细胞1小时。用培养基洗涤细胞两次后，更换为含2 mmol/L钙离子的Hank's平衡盐溶液。使用配备60倍油镜的聚焦漂移补偿倒置显微镜，以每秒2帧的速度对细胞成像。最后，在第25秒加入ATP至终浓度为5 mmol/L，记录ATP诱导的钙离子反应。人iPSC克隆经免疫染色证实表达多能性标志物Oct4和Nanog。来自脆性X综合征及对照细胞系的APCs中，波形蛋白和NFIA阳性细胞的比例相当。来自对照和脆性X综合征人诱导多能干细胞的星形胶质细胞前体细胞均表现出FoxG1相对于HOXB4的上调，提示其具有前脑特征。源自人iPSC脆性X综合征细胞系的星形胶质细胞中GFAP表达数量减少。对照组与脆性X综合征星形胶质细胞均表现出ATP诱导的钙瞬变，但脆性X综合征星形胶质细胞中的响应细胞数量显著降低。与对照细胞相比，脆性X综合征星形胶质细胞中首次ATP诱发的钙瞬变峰值幅度显著降低。与对照星形胶质细胞相比，人iPSC来源的脆性X综合征星形胶质细胞表现出糖酵解、糖酵解能力和糖酵解储备增加，但最大呼吸能力显著下降。

generation-characterization-human-induced-pluripotent-stem-cell

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

缺乏脆性 X 信使核糖核蛋白的人诱导多能干细胞来源的星形胶质细胞的产生和表征

该视频展示了一种利用人多能干细胞的前体细胞生成星形胶质球体的方法。该方法包括在含有生长因子和激酶抑制剂的营养培养基中培养并扩增干细胞。随后这些细胞聚集并分化为星形胶质细胞，形成星形胶质球体。...

利用人多能干细胞生成与维持星形胶质细胞球

星形胶质细胞已被确认为多功能细胞，参与多种基本生物学过程，在正常脑发育、功能维持及中枢神经系统修复中发挥重要作用。本文介绍一种快速获取纯化小鼠星形胶质细胞培养物的实验流程，用于研究这类主要中枢神经系统细胞的生物学特性。...

小鼠皮层星形胶质细胞的分离与培养

星形胶质细胞是中枢神经系统（CNS）中最重要的关键细胞之一。本文报道了一种实用的按性别分离的海马星形胶质细胞培养方案，用于研究新生雄性和雌性幼鼠星形胶质细胞功能背后的机制 体外...

小鼠海马星形胶质细胞的性别差异 体外 缺血

我们修改并实施了一项先前发表的方案，该方案描述了将人 诱导 多能干细胞（hiPSCs）快速、可重复且高效地分化为兴奋性皮层神经元的方法12。具体而言，我们的改进可实现对神经元细胞密度的控制，并可在微电极阵列上应用，以在神经网络水平上检测其电生理特性。...

利用微电极阵列测量网络活性的诱导多能干细胞快速神经元分化

我们描述了一种将人皮肤来源的成纤维细胞重编程为诱导性神经前体细胞（iNPCs），并进一步将其分化为诱导性星形胶质细胞（iAs）的实验方案。该方法可快速、可重复地大量生成iNPCs和iAs。...

利用成纤维细胞直接转化为神经祖细胞并分化为星形胶质细胞的体外神经疾病建模

我们开发了一种方法，可从新鲜冷冻组织中富集并分离人星形胶质细胞群体，用于后续分子分析。...

利用荧光激活细胞核分选技术从新鲜冷冻皮层中分离成人人类星形胶质细胞群体

我们描述了一种用于诱导人源多能干细胞分化为脊髓星形胶质细胞和神经元，并将其共培养以进行电生理记录的方法。...

建立用于模拟肌萎缩侧索硬化症的电生理平台：采用区域特异性人多能干细胞来源的星形胶质细胞与神经元

描述了两种相关方法，用于可视化突触传递所需的亚细胞事件。这些方案通过活细胞成像技术，实现对突触前钙离子内流和突触囊泡膜融合动态过程的实时监测。 体外...

肌萎缩侧索硬化症模型中突触功能的实时荧光检测

本文介绍了一种详细的实验方案，用于培养出生后小鼠中枢神经系统不同区域来源的高度富集的星形胶质细胞，并通过强制表达转录因子将其直接转化为功能性神经元。...

小鼠星形胶质细胞的分离与直接神经元重编程

我们基于发育生物学知识和已发表的研究，开发了一种优化的方案，可高效地从人类胚胎干细胞和人类诱导多能干细胞中生成A9型中脑多巴胺能神经元，该技术将有助于帕金森病的疾病建模及细胞替代治疗。...

由人类多能干细胞定向分化为多巴胺能神经元

了解如何利用人诱导多能干细胞分化生成前脑特异性星形胶质细胞，并表征脆性X综合征相关的代谢异常。该方法为研究神经发育障碍中胶质细胞功能提供了可靠的人类细胞模型。

生成与表征缺失脆性X智力低下核糖核蛋白的人诱导多能干细胞来源星形胶质细胞

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