使用质粒 DNA 转染和 mRNA 核转染递送在人类细胞中进行 CRISPR 表观基因组编辑

本研究旨在设计表观基因组编辑器并将其递送到人类细胞中。我们通过将染色质效应子与 dCas9 融合以实现靶向基因调节，而不会引入毒性 DNA 断裂。挑战在于有效地将表观基因组编辑器递送到细胞中并确保精确的靶标特异性。

此外，实现稳定或瞬时基因抑制仍然很困难。该方案避免了任何裂解机制，降低了毒性和基因组不稳定性。它描述了两种用于受控基因表达调节的递送方法，无需永久性 DNA 序列改变。

这些方法可用于测试与 dCas9 的不同融合并研究基本的染色质生物学。目前的表观基因组编辑器可用于全基因组筛选，并具有治疗应用的潜力。首先，将 K-562 细胞保存在装有 10% FBS 和青霉素链霉素谷氨酰胺的 RPMI 培养基的培养瓶中。

在成核转染当天，在无菌无 RNAse 微量离心管中解冻 CRISPRoff mRNA，并轻轻涡旋管。在置于冰上的 PCR 条管的每个孔中使用每 2.0 乘以 10 到 5 个细胞的幂 2 μg mRNA。根据制造商的说明准备核转染溶液，并在转染核前将其加热至室温 15 分钟。

使用台盼蓝活/死染色的自动细胞计数仪收获和计数 K-562 细胞。对于在条状比色皿中进行成核转染，将每个样品大约 2 乘以 10 次方的 5 个细胞分装到无菌微量离心管中。在室温下以 500 G 离心细胞 5 分钟。

丢弃上清液。向细胞沉淀中加入室温 PBS，再次以 500 G 离心 5 分钟。丢弃上清液。

将细胞重悬于适量的 nucleofector 溶液中。将计算体积的细胞溶液加入 2 微克 CRISPRoff 溶液中。将细胞和 mRNA 溶液转移到比色皿中，确保不会形成气泡，因为这可能会降低核转染效率。

轻轻敲击 Nucleocuvette 以使细胞稳定在底部。接下来，使用具有适当脉冲代码的 4D-Nucleofector 系统对细胞进行成核。脉冲代码可能需要针对不同的细胞类型进行优化。

如果需要其他优化，请咨询制造商。核转染后，向 Nucleocuvette 的每个使用孔中加入 80 μL RPMI 培养基。将细胞悬液转移到含有 400 μL 预热 RPMI 培养基的 24 孔板的孔中。

将所有流式细胞术标准品或 FSC 文件拖放到新工作表中，将它们加载到 FlowJo 中。单击所有样本开始制作门。双击相应的文件打开控制样本。

使用多边形工具在 FSC-A 与 SSC-A 图中为活细胞创建门。现在，在所有样品列表中的样品名称下方应显示一个 Live cells 选项卡。右键单击此门，然后选择 Copy analysis to group 将此门应用于所有样品。

双击活细胞门以仅选择活细胞。将轴更改为 FSC-H 与 FSC-A。绘制一个多边形以仅针对单个单元格进行门控。

要对向导表达细胞进行门控，请双击单细胞门以仅选择单细胞。将轴更改为 FSC-A 与 PE-CF594-A。使用多边形工具绘制一个门，用于引导表达细胞。

双击最后一个设置门，单个细胞或向导表达细胞。如果在表观基因组编辑器编码蓝色荧光蛋白或 BFP 融合的情况下进行质粒转染，则为第二天样品的 BFP 阳性细胞创建一个门。通过绘制 BB515-A 与 FSC-A 的作图来建立报告基因表达的门控，以识别和设门 GFP 阴性细胞。

然后，将此门应用于所有样品。完成门控设置后，单击上部面板中的 Table Editor。拖动群体进行分析，例如 BFP 阳性和 GFP 阴性细胞。

在表编辑器面板中，单击 create table 并复制数据，然后将其粘贴到电子表格中以进行规范化计算。现在，从所有其他样品中减去对照样品中报告基因阴性细胞的数量，例如 GFP 阴性细胞。这更正了报告者的背景静音。

如果进行转染，则将每个值除以第 2 天测得的 BFP 阳性细胞百分比，将所有值标准化为 BFP 阳性细胞的百分比，然后乘以 100。这产生了编辑细胞的转染效率标准化值。绘制数据以创建表示整个表观基因组编辑时间过程中变化的折线图。

对于所有表观基因组编辑实验，建议使用非靶向指南对照，以确认靶基因座的变化是由表观基因组编辑引起的，而不是表观基因组编辑器的过表达或非特异性结合。考虑表观基因组编辑器的递送方法很重要。考虑到实验环境，质粒 DNA 转染或 mRNA 核转染可能是首选。

对细胞类型、实验时间表、递送读数和递送效率的考虑可能会影响首选的递送方法。转染后 2 天表达高水平 BFP 的细胞表明使用表观基因组编辑器成功转染。CRISPRoff 和 CRISPRi 均显示转染后第 5 天的基因沉默峰值。

在 mRNA 核转染实验中，使用 CRISPRoff 进行成核转染后第 3 天观察到强烈的基因沉默。