利用质粒DNA转染和mRNA核转染递送在人类细胞中进行CRISPR表观基因组编辑

本研究旨在设计并将表观基因组编辑工具递送至人类细胞中。我们通过将染色质效应因子与dCas9融合，实现靶向基因调控，同时避免引入具有毒性的DNA断裂。该研究面临的主要挑战包括如何高效地将表观基因组编辑工具递送至细胞内，以及确保其靶向特异性的精确性。

此外，实现稳定的或瞬时的基因抑制仍然具有挑战性。本实验方案避免了任何切割机制，从而降低了毒性及基因组不稳定性。该方案描述了两种可在不引起DNA序列永久性改变的情况下，实现基因表达调控的递送方法。

这些方法可用于测试与 dCas9 的不同融合蛋白，并用于研究基础染色质生物学。目前的表观基因组编辑工具可用于全基因组筛选，并具有治疗应用的潜力。首先，将 K-562 细胞培养于含有 10% FBS 以及青霉素-链霉素-谷氨酰胺的 RPMI 培养基的培养瓶中。

在进行核转染的当天，将CRISPRoff mRNA在无RNA酶的无菌微量离心管中解冻，并轻轻涡旋混匀。每2.0 × 10⁵个细胞使用2微克mRNA，加入置于冰上的PCR条状管的每个孔中。根据制造商说明书配制核转染溶液，并在核转染前将其置于室温下温育15分钟。

使用自动细胞计数器结合台盼蓝活死染色法收集并计数 K-562 细胞。对于在条形比色皿中进行的核转染，将每份样品约 2 × 10⁵ 个细胞分装至无菌微量离心管中。在室温下以 500 × g 离心 5 分钟。

弃去上清液。向细胞沉淀中加入室温的磷酸盐缓冲液（PBS），在500 ×g离心5分钟。弃去上清液。

将细胞重悬于适量的核转染溶液中。将计算好的细胞悬液体积加入到两微克的CRISPRoff溶液中。将细胞与mRNA混合溶液转移至电转杯中，确保不产生气泡，因为气泡可能会影响核转染效率。

轻轻敲击电转杯，使细胞沉降至底部。随后使用4D-Nucleofector系统并选择适当的电转程序对细胞进行核转染。不同细胞类型可能需要优化相应的电转程序。

如果需要进一步优化，请咨询试剂生产商。核转染后，向所用的每个核转染杯孔中加入 80 微升 RPMI 培养基。将细胞悬液转移至含有 400 微升预热 RPMI 培养基的 24 孔板孔中。

通过将所有流式细胞术标准文件（FSC 文件）拖放到新工作表中，将其加载到 FlowJo 软件内。单击所有样本以开始设门。通过双击相应的文件来打开一个对照样本。

使用多边形工具在 FSC-A 与 SSC-A 图中创建活细胞门控。此时，在所有样本列表中，样本名称下方应出现一个活细胞标签。右键单击此门控，然后选择“复制分析至组”，以将此门控应用于所有样本。

双击活细胞门以仅选择活细胞。将坐标轴更改为FSC-H与FSC-A。绘制多边形以圈选单细胞。

为了圈选表达向导的细胞，双击单细胞门以仅选择单个细胞。将坐标轴更改为FSC-A与PE-CF594-A。使用多边形工具圈选表达向导的细胞群。

双击最后一个设门步骤，即单细胞门或引导表达细胞门。如果进行质粒转染，且表观基因组编辑器编码蓝色荧光蛋白（BFP）融合蛋白，则针对第二天的样本创建BFP阳性细胞门。通过将BB515-A对FSC-A作图，识别并圈选GFP阴性细胞，以建立报告基因表达的门控。

然后，将此门控应用于所有样本。完成门控设置后，点击上方面板中的表格编辑器。拖拽待分析的细胞群，例如BFP阳性且GFP阴性的细胞。

在表格编辑器面板中，点击创建表格，并在将数据粘贴到电子表格进行归一化计算之前复制数据。接下来，从所有其他样本中减去对照样本中报告基因阴性细胞（例如GFP阴性）的数量。此步骤可校正报告基因的背景沉默效应。

若进行转染实验，将每个数值除以第2天测得的BFP阳性细胞百分比，以将所有数值归一化至BFP阳性细胞比例，然后乘以100。由此得到转染效率归一化的编辑细胞数值。绘制数据以生成折线图，表示表观基因组编辑时间过程中的变化。

在所有表观基因组编辑实验中，建议使用非靶向引导对照，以确认在靶位点发生的变化是由表观基因组编辑引起的，而非由表观基因组编辑因子的过表达或非特异性结合所致。需要考虑表观基因组编辑工具的递送方式。根据实验的具体情况，可优先选择质粒DNA转染或mRNA电穿孔转染。

细胞类型、实验时间线、递送检测指标和递送效率的考量可能影响首选的递送方法。转染后两天表达高水平BFP的细胞表明表观基因组编辑器转染成功。CRISPRoff和CRISPRi均在转染后第五天达到基因沉默的峰值。

在mRNA核转染实验中，使用CRISPRoff进行核转染后第三天即可观察到强烈的基因沉默效应。