Name: Sprague-Dawley （SD） 大鼠原代视网膜 Müller 细胞的分离和培养 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-17T14:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: 学习从新生Sprague-Dawley大鼠分离和培养原代视网膜Müller细胞的标准化实验方案。该方法通过胰酶消化和离心纯化获得高纯度细胞，经免疫荧光验证可用于视网膜疾病建模及药物效应研究。

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本工作得到四川省自然科学基金（2023NSFSC0690）的支持。

所有动物实验均遵循《眼科与视觉研究中动物使用ARVO声明》的规定，并经成都中医药大学动物伦理委员会批准（伦理编号：2024069）。本研究共使用50只无特定病原体（SPF）级Sprague-Dawley大鼠（3–5日龄，性别未指定，体重7–10 g）。实验动物由商业途径获得，并饲养于成都中医药大学实验动物中心（实验动物使用许可证号：SYXK [四川] 2024-049），环境条件符合标准实验室要求。本研究中所用试剂与设备的详细信息见于 材料表.
1. 原代肾小球系膜细胞的分离与培养
<ol>
	<li>实验物品准备
	<ol>
		<li>使用前，在超净工作台内将以下物品置于紫外线下灭菌至少30分钟：T25培养瓶、离心管及管架、移液器及支架、废液容器、打火机、酒精灯和记号笔。</li>
		<li>使用前，通过高压灭菌对以下物品进行灭菌处理：1 mL移液器吸头、弯板、带盖玻璃培养皿、弯头镊子、45 µm尼龙筛网（300目）、齿状镊子、无齿镊子和微型角膜剪。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>环境准备：对眼球解剖所用的环境和操作台进行紫外线消毒，时间超过30分钟。每次进入或离开超净工作台前，均需向实验人员手部喷洒酒精。将培养箱设置为37 °C和5% CO2。每次打开或关闭培养箱前后，均需向实验人员手部喷洒酒精。</li>
	<li>溶液配制：配制D-Hank's溶液、磷酸盐缓冲液（PBS）、杜氏改良伊格尔培养基（DMEM高糖）、胎牛血清（FBS，热灭活）、青霉素/链霉素溶液（100倍浓度）和0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液。 
	注意：使用前将DMEM和FBS在37 °C水浴中预热。
	<ol>
		<li>通过向10 mL D-Hank's或PBS溶液中分别加入100 µL青霉素/链霉素溶液，配制含1%青霉素/链霉素的D-Hank's和PBS溶液。</li>
		<li>向10 mL高糖DMEM中加入100 µL青霉素/链霉素溶液和2 mL FBS，配制完全培养基。 
		注意：在实验室超净工作台中配制溶液，并尽可能立即使用。完全培养基应于4 °C保存，每次使用前预热至37 °C。若保存超过一周，则应弃用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>眼球摘除
	<ol>
		<li>根据机构批准的实验方案，在已灭菌的工作台上通过颈椎脱位法（不使用CO2&#160;窒息法）处死新生SD大鼠。将尸体浸入75%酒精中5分钟以消毒，然后转移至无菌弯盘中。</li>
		<li>将D-Hank's溶液倒入两个10 cm玻璃培养皿中。</li>
		<li>使用齿状镊子沿睑裂方向撕开眼睑，暴露眼球。</li>
		<li>使用无齿镊子张开并平行于睑裂方向按压眼眶。当触及视神经并暴露眼球时，闭合镊子以提起并摘除眼球。</li>
		<li>将眼球放入盛有D-Hank's溶液的玻璃培养皿中，冲洗后转移至另一盛有新鲜D-Hank's溶液的培养皿中。 
		注意：确保眼球保持完整。理想情况下，应保留部分视神经，以便于视网膜组织的分离。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>视网膜解剖
	<ol>
		<li>准备一个已灭菌且带盖的空培养皿，并调节显微镜。</li>
		<li>将步骤1.4.5中的玻璃培养皿置于显微镜下。使用弯头眼科显微镊轻轻固定角膜与视神经之间的区域，以暴露角膜。</li>
		<li>使用微型角膜剪刺穿角膜巩膜交界处。沿角膜缘作环形切割，然后在对称位置作长约2 mm的巩膜切口。松开镊子，重新夹持于视神经与巩膜交界处。</li>
		<li>使用第二把镊子轻轻按压视神经根部附近，施力方向朝向角膜-视神经界面。当晶状体组织出现时，小心将其移除，并继续按压直至视网膜组织显露。 
		注意：小心移除晶状体，避免意外带出视网膜组织。</li>
		<li>使用镊子将分离的视网膜组织转移至另一无菌培养皿中。盖上皿盖，喷洒酒精，并置于超净工作台上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>原代RMCs的提取
	<ol>
		<li>打开超净工作台通风开关。</li>
		<li>打开培养皿盖。使用装有1 mL吸头的移液器将视网膜组织上下吹打约15次，使其分散成小块。加入1 mL 0.25%胰蛋白酶，在37 °C孵育5分钟。</li>
		<li>将培养皿从培养箱中取出并置于超净工作台上。加入2 mL完全培养基，轻轻吹打以终止消化。 
		注意：使用胰蛋白酶体积两倍的完全培养基终止消化。例如，若使用1 mL胰蛋白酶，则用2 mL完全培养基终止。</li>
		<li>将细胞悬液通过300目尼龙筛网过滤至15 mL离心管中。用预先配制的PBS冲洗培养皿，并收集残留悬液。</li>
		<li>在室温（RT）下以878 x&#160;g 离心5分钟。吸除并弃去上清液。将沉淀重悬于2 mL完全培养基中，再次以878 x&#160;g离心5分钟以纯化细胞。</li>
		<li>离心后弃去上清液。将细胞重悬于2 mL完全培养基中。预先向每个T25培养瓶中加入3 mL完全培养基，然后加入1 mL细胞悬液。以十字形方式轻轻摇晃培养瓶，随后放入培养箱中。</li>
		<li>孵育48小时后进行首次换液。将培养瓶从培养箱中取出并置于超净工作台上。弃去旧培养基，并用1 mL PBS对贴壁细胞表面清洗三次。
		<ol>
			<li>加入5 mL新鲜完全培养基。此后每隔一天更换一次培养基，直至细胞融合度超过90%，然后进行传代培养。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. RMCs 的传代
注意：当细胞融合度超过90%时进行传代。在本方案中，原代培养物通常在分离后5-6天需要传代。首次传代的时间可能因接种密度而异。将细胞密度调整至4 ×&#160;103&#160;个细胞/mL，并将细胞接种至T25培养瓶中。当3-4天后细胞融合度达到&#62;90%时，进行传代操作。
<ol>
	<li>从培养箱中取出T25培养瓶，弃去培养基，用含1%青霉素/链霉素的1 mL PBS溶液洗涤细胞三次。</li>
	<li>向培养瓶中加入1 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，于培养箱中孵育1分30秒。</li>
	<li>在倒置显微镜下观察培养瓶，当细胞呈现变圆、脱落并开始漂浮时，将培养瓶从培养箱中取出，转移至超净工作台，加入2 mL完全培养基以终止消化。</li>
	<li>用移液器吸取细胞悬液，轻轻吹打培养瓶壁，以使残留的贴壁细胞脱落。</li>
	<li>将全部细胞悬液转移至15 mL离心管中，用含1%青霉素/链霉素的2 mL PBS冲洗培养瓶壁，并将冲洗液加入同一离心管中。在室温下以878 ×&#160;g离心5分钟。</li>
	<li>弃去上清液，用适量完全培养基重悬细胞沉淀。根据需要按1:2或1:3的比例传代细胞。 
	注意：后续实验请使用第2代（P2）细胞（图1）。</li>
</ol>
3. 苏木精和伊红（H&amp;#38;E）染色
<ol>
	<li>将第2代（P2）细胞以每孔2×&#160;105&#160;个细胞的密度接种于6孔板中，孔内预先放置无菌盖玻片。每孔加入2 mL完全培养基。当细胞融合度达到约80%时，弃去培养基，用1 mL PBS轻轻冲洗每个孔两次。</li>
	<li>每孔加入1 mL 4%多聚甲醛固定液，室温孵育30 min以固定细胞。弃去固定液，用1 mL PBS洗涤细胞两次。</li>
	<li>每孔加入1 mL苏木精染液，孵育15 min。弃去染液，用1 mL PBS冲洗各孔2–3次。</li>
	<li>在显微镜下观察细胞。若苏木精染色过深，可用1%盐酸酒精进行分化，去除多余的胞质着色。用1 mL PBS洗涤2–3次。</li>
	<li>每孔加入1 mL伊红染色液。在显微镜下观察染色情况，约30秒或直至达到理想的颜色强度为止。用1 mL PBS冲洗各孔2–3次。用中性树胶将盖玻片封片于载玻片上。</li>
</ol>
4. 免疫荧光染色
<ol>
	<li>将P2细胞以每孔2 ×&#160;105&#160;个细胞的密度接种于6孔板中，孔内预先放置无菌盖玻片。每孔加入2 mL完全培养基。
	<ol>
		<li>当细胞融合度达到约80%时，弃去培养基。取出盖玻片并置于染色缸中，用1 mL PBS洗涤3次，每次5分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>加入约50 µL透化溶液（Triton X-100 : PBS = 1 : 200），覆盖细胞。室温孵育5分钟，然后用1 mL PBS洗涤3次，每次5分钟。加入约50 µL 3% BSA封闭液，室温孵育20分钟。</li>
	<li>轻轻弃去封闭液。加入约200 µL用PBS配制的一抗溶液，覆盖盖玻片：AQP4（1:100）、Kir4.1（1:200）、GS（1:200）、CRALBP（1:50）或Vimentin（1:200）。将盖玻片置于湿盒中，4 °C过夜孵育。</li>
	<li>用1 mL PBS洗涤盖玻片3次，每次5分钟。</li>
	<li>加入约200 µL FITC标记的羊抗兔IgG二抗17，避光室温孵育50分钟。然后用1 mL PBS洗涤3次，每次5分钟。</li>
	<li>用DAPI染核10分钟，再用1 mL PBS洗涤3次，每次5分钟。</li>
	<li>在载玻片上滴加一滴抗荧光淬灭封片剂，将盖玻片细胞面朝下封片。封固后在荧光显微镜下观察。</li>
</ol>
5. 流式细胞术
<ol>
	<li>使用流式细胞术染色缓冲液将细胞浓度调整至 1.0 x 107&#160;个细胞/mL。</li>
	<li>将单细胞悬液每份 100 µL 分装至每个实验条件下的两个独立样品管中。指定其中一管作为阴性（未染色）对照。</li>
	<li>向每管中加入 100 µL 通透化溶液 A（来自商品化试剂盒，参见 材料表）。轻轻混匀，并在室温避光孵育 15 分钟。</li>
	<li>向每管中加入 3 mL 预冷的流式细胞术染色缓冲液。在室温下以 300 x&#160;g 离心 5 分钟，弃去上清液。</li>
	<li>向每管中加入 100 µL 通透化溶液 B（来自商品化试剂盒），涡旋混匀。向指定的样品管中加入 0.1 µL CRALBP 抗体，向对应的管中加入 0.8 µL GS 抗体。阴性对照管中不加任何抗体。在 4 °C 避光孵育 30–60 分钟。</li>
	<li>向每管中加入 3 mL 流式细胞术染色缓冲液。在室温下以 300 x&#160;g 离心 5 分钟，弃去上清液。</li>
	<li>将每管重悬于 100 µL 流式细胞术染色缓冲液中。向每管 CRALBP 染色样品中加入 1 µL FITC 标记的山羊抗兔 IgG (H&amp;#38;L)，向每管 GS 染色样品中加入 1 µL PE 标记的山羊抗兔 IgG (H&amp;#38;L)。阴性对照管中不加任何抗体。在 4 °C 避光孵育 30–60 分钟。</li>
	<li>向每管中加入 3 mL 流式细胞术染色缓冲液。以 300 x g 离心 5 分钟，弃去上清液。</li>
	<li>将每管重悬于 300 µL 流式细胞术染色缓冲液中。立即进行流式细胞术分析；或者将细胞重悬于 500 µL 1%–4% 多聚甲醛中，于 2–8 °C 避光保存，并在 24 小时内完成分析。</li>
	<li>使用流式细胞术软件分析阴性和阳性样品。</li>
</ol>

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所有作者均无与本文内容相关的利益冲突。

本文提供了一种从新生SD大鼠中分离原代视网膜微血管细胞（RMCs）的详细实验方案。该方案涵盖了实验前准备、眼球摘除、视网膜组织分离，以及RMCs提取、培养、传代和鉴定的逐步操作流程。同时强调了在整个细胞培养过程中需注意的关键事项，为相关研究提供了标准化的技术指导。
为提取RMC，选择3至5日龄的SD大鼠。由于该年龄段大鼠眼球体积较小，眼球分离和视网膜组织提取的操作难度显著增加，需要较高的技术水平。值得注意的是，组织体积小导致原代细胞得率较低。此外，随着传代次数的增加，细胞在培养过程中活力逐渐下降27，通常需要使用更多的实验动物才能获得后续研究所需的细胞数量。
实验动物的选择标准在不同研究之间存在显著差异：在视网膜胶质细胞研究中，出生后第1-3天的SD大鼠幼鼠已被用于建立可维持成熟星形胶质细胞表型的培养体系28，而出生后第7-10天的SD大鼠幼鼠则更适用于研究视网膜Müller细胞（RMC）向视网膜神经节细胞的转分化<sup clas...

视网膜穆勒胶质细胞（RMCs）是视网膜中的主要大胶质细胞，构成视网膜神经血管单元的核心1,2。RMCs 几乎贯穿整个视网膜厚度，包绕几乎所有视网膜神经元和微血管系统。其突起向上延伸至内界膜（ILM），形成顶端足突，向下延伸至外界膜（OLM），并在该处发育出特化的微绒毛3。这种独特的结构使 RMCs 能够作为视网膜组织的主要结构支架4,5。
RMC富含离子通道、配体、受体、跨膜转运蛋白和酶6，它们参与视网膜的葡萄糖代谢 通过 糖酵解7钾离子通道（Kir2.1、Kir4.1）与水通道蛋白（AQP4、AQP9、AQP11）协同调控细胞膜上的离子与水分稳态，维持视网膜生理平衡7此外，放射状胶质细胞（RMCs）能够吸收并清除神经元释放的神经递质，包括谷氨酸、γ-氨基丁酸（GABA）和甘氨酸。7,8.
糖尿病视网膜病变7、青光眼9和视网膜色素变性10等病理状态可损伤视网膜Müller细胞（RMCs），破坏血-视网膜屏障，引发炎症反应，增加血管通透性，并损害视网膜功能。RMCs还被公认为视网膜再生细胞的潜在内在来源11,12。在鱼类和某些两栖类动物中，RMCs可去分化为视网膜前体细胞，以替代因损伤而丢失的神经元13。在成年哺乳动物视网膜中，RMCs表达干细胞相关标志蛋白14,15，因而具有分化为视网膜神经元的潜能，可用于替代年龄相关性黄斑变性、青光眼和糖尿病视网膜病变等退行性疾病中受损的细胞16。原代RMCs能高度模拟其体内（in vivo）状态，在视网膜退行性疾病的机制研究与治疗探索中具有重要价值。然而，现有文献中关于原代RMCs的分离与培养方法报道较少，尤其是来自新生Sprague-Dawley（SD）大鼠的RMCs。
本方案采用3至5日龄的新生SD大鼠，无性别偏好。在无菌条件下摘除眼球，使用胰蛋白酶消化视网膜组织，随后分离原代视网膜微血管细胞（RMCs）。 通过 离心和纯化以用于后续培养和传代。采用倒置光学显微镜结合苏木精和伊红（H&amp;#38;E) 染色显示，分离的细胞表现出典型的视网膜Müller细胞（RMC）特征。免疫荧光染色证实了RMC特异性蛋白标志物的表达，包括谷氨酰胺合成酶（GS）、细胞视黄醛结合蛋白（CRALBP）、波形蛋白（Vimentin）、水通道蛋白-4（AQP4）以及内向整流钾通道4.1（Kir4.1）。使用GS和CRALBP抗体标记后的流式细胞术分析显示细胞纯度≥90%，符合基于RMC的生物学实验的既定标准，确保了其适用于后续功能研究。在实验过程中，第4代细胞表现出对培养瓶贴附能力下降、形态改变以及衰老迹象，最终导致细胞死亡。因此，后续实验仅使用前3代细胞。

<table><tbody><tr><td>0.1% Triton X-100</td><td>Solarbio</td><td>T8200</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Hyclone&amp;nbsp;</td><td>SH30042.01B</td><td></td></tr><tr><td>1% 盐酸酒精</td><td>BIOSYSTEMS</td><td>3803651E</td><td></td></tr><tr><td>4% 多聚甲醛</td><td>Solarbio</td><td>P1110</td><td></td></tr><tr><td>45&amp;mu;m 尼龙筛网（300目）</td><td>Solarbio</td><td>YA0926</td><td></td></tr><tr><td>6孔板</td><td>Servicebio</td><td>IMC202302001</td><td></td></tr><tr><td>6 cm 玻璃培养皿</td><td>Normax</td><td>5058541</td><td></td></tr><tr><td>75% 酒精</td><td>KESHI</td><td>GEA004</td><td></td></tr><tr><td>水通道蛋白-4（AQP4）</td><td>Proteintech Group, Inc</td><td>16473-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Servicebio</td><td>GC305010</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养箱</td><td>Thermo</td><td>FORMA311</td><td></td></tr><tr><td>细胞视黄醛结合蛋白（CRALBP）</td><td>HUABOI</td><td>HA721330</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>湖南湘仪</td><td>TDZ5-WS</td><td></td></tr><tr><td>超净工作台</td><td>智城</td><td>ZHJH-C12</td><td></td></tr><tr><td>角膜剪</td><td>金钟</td><td>BXGJ</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Solarbio</td><td>G1012</td><td></td></tr><tr><td>D-Hank 溶液</td><td>Solarbio</td><td>H1045</td><td></td></tr><tr><td>DMEM&amp;nbsp;高糖培养基</td><td>Gibco</td><td>C11995500BT</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Sbjbio生命科学</td><td>BC-SE-FBS01</td><td></td></tr><tr><td>FIX&amp;PERM 试剂A</td><td>MultiSciences</td><td>GAS006/2</td><td></td></tr><tr><td>FIX&amp;PERM 试剂B</td><td>MultiSciences</td><td>GAS006/2</td><td></td></tr><tr><td>流式细胞术染色缓冲液</td><td>MultiSciences</td><td>S1001</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G 荧光封片剂</td><td>SourthernBiotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>谷氨酰胺合成酶多克隆抗体</td><td>Proteintech Group, Inc</td><td>PTG-11037-2-AP-50ul</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗兔IgG H&amp;L PE</td><td>Bioss</td><td>bs-0295G-PE</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗兔IgG H&amp;L FITC</td><td>Bioss</td><td>bs-0295G-FITC</td><td></td></tr><tr><td>苏木精-伊红（HE）染色试剂盒</td><td>Solarbio</td><td>G1120</td><td></td></tr><tr><td>高压灭菌器</td><td>厦门泽朗仪器有限公司</td><td>GI80DS</td><td></td></tr><tr><td>倒置荧光显微镜</td><td>Nikon&amp;nbsp;</td><td>SMZ1500</td><td></td></tr><tr><td>倒置相差显微镜</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>DMIL</td><td></td></tr><tr><td>内向整流性钾通道4.1（Kir4.1）</td><td>Proteintech Group, Inc</td><td>12503-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>中性树脂</td><td>Solarbio</td><td>G8590-100</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液（100&amp;times;）</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）（pH 7.2–7.4）</td><td>Solarbio</td><td>P1020-500ml</td><td></td></tr><tr><td>二抗（FITC标记的山羊抗兔）</td><td>Servicebio</td><td>GB22303</td><td></td></tr><tr><td>Sprague-Dawley 大鼠&amp;nbsp;</td><td>成都大硕实验动物有限公司</td><td>生产许可证号：SCXK（四川）2020-0030</td><td></td></tr><tr><td>T25 培养瓶</td><td>Cornning&amp;nbsp;</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>Tornado 管：15 mL</td><td>WHB&amp;nbsp;</td><td>WHB-15-1</td><td></td></tr><tr><td>Tornado 管：50 mL</td><td>WHB&amp;nbsp;</td><td>WHB-50-1</td><td></td></tr><tr><td>紫外消毒灭菌器</td><td>GEMEISI</td><td>xd06</td><td></td></tr><tr><td>波形蛋白（Vimentin）</td><td>Abcam</td><td>ab92547</td><td></td></tr></tbody></table>

从sprague-dawley（sd）大鼠中分离与原代培养视网膜müller细胞

Isolation and Culture of Primary Retinal M&#252;ller Cells from Sprague-Dawley (SD) Rats

视网膜穆勒细胞（RMCs）在维持视网膜结构支持和调控多种视网膜功能中发挥关键作用。作为视网膜微环境的核心组成部分，RMCs执行多项重要功能。通过其丰富的离子通道、配体、受体、跨膜转运蛋白及酶系统，这些细胞参与神经递质和营养因子的分泌，调节视网膜代谢，并维持水离子稳态。值得注意的是，近期研究发现RMCs是内源性视网膜再生干细胞的重要来源，为治疗视网膜变性疾病提供了新的治疗靶点。因此，研究RMCs对于理解视网膜疾病病理机制至关重要。本研究系统建立了一套标准化实验方案，包括胰酶消化法分离与纯化原代RMCs、倒置光学显微镜和苏木精-伊红（HE）染色进行形态学观察、免疫荧光染色鉴定特异性蛋白，以及细胞纯度分析 通过 流式细胞术。本方案为与视网膜微血管细胞（RMCs）相关的基础研究和临床应用提供了有价值的参考，有助于探索其在视网膜疾病中的作用机制，并推动治疗策略的开发。

原代细胞接种至培养瓶后，通过后续的换液和传代操作可去除贴壁能力较差的视网膜Müller细胞（RMCs）以及传代过程中产生的细胞碎片，从而富集培养物中的RMC群体。RMCs通过倒置光学显微镜观察其形态特征进行鉴定（图1），并采用苏木精-伊红（H&amp;E）染色进一步确认（图2）。通过免疫荧光染色检测谷氨酰胺合成酶（GS）、波形蛋白（Vimentin）、细胞视黄醇结合蛋白（CRALBP）、水通道蛋白4（AQP4）和内向整流钾通道4.1（Kir4.1）的特异性抗体标记，以观察蛋白表达情况（图3）。此外，采用GS和CRALBP抗体标记进行流式细胞术分析，以确定RMC群体的纯度（图4）。
如图所示 <strong class...

本文介绍了一种从新生Sprague-Dawley（SD）大鼠中分离原代视网膜穆勒细胞的详细方案。该操作流程包括眼球摘除、视网膜组织解剖、细胞提取与鉴定，以及后续细胞培养的关键注意事项。

从Sprague-Dawley（SD）大鼠中分离与原代培养视网膜Müller细胞

视网膜穆勒细胞（RMCs）在为视网膜提供结构支持以及调控其多种功能方面发挥着关键作用。作为视网膜中的核心……

本方案描述了从 Sprague-Dawley SD 大鼠中分离和培养原代视网膜穆勒细胞的方法，可为科学界视网膜研究提供支持。该方案涵盖了视网膜解剖、细胞提取与鉴定，以及关键的对照注意事项。本方案建立了一种高效、标准化且成本效益高的方法，用于从合法的 SD 大鼠中提取和回收 RMCs。RMC 模型可用于模拟糖尿病等病理状态、正常生理状态，并辅助药物效应研究。[旁白] 首先，将D-Hank's溶液倒入两个10厘米的玻璃培养皿中。在处死并消毒新生SD大鼠后，将其置于无菌弯盘上。使用齿镊沿睑裂撕开眼睑皮肤，暴露大鼠眼球。用无齿镊夹持并平行于睑裂方向下压眼眶。当到达视神经并暴露眼球后，闭合镊子以提起并摘除眼球。随后将眼球放入盛有D-Hank's溶液的玻璃培养皿中。冲洗眼球后，将其转移至另一盛有新鲜D-Hank's溶液的培养皿中。接着使用弯头眼科显微镊，轻轻固定角膜与视神经之间的区域，以暴露角膜。用显微角膜剪刺穿角膜巩膜交界处，并沿角膜缘作环形剪切。在释放镊子前，于巩膜处作两条长约2毫米的对称切口，然后在视神经与巩膜交界处重新夹持。随后，使用第二把镊子轻压视神经根部，施加压力朝向角膜-视神经界面。当晶状体组织出现时，小心将其移除，并继续按压直至视网膜组织显露。使用镊子将分离的视网膜组织转移至另一个无菌培养皿中。打开培养皿盖，用带有1毫升枪头的移液器将视网膜组织上下吹打约15次，使其破碎成小块。然后，加入1毫升0.25%胰蛋白酶，在37摄氏度下孵育5分钟。从孵箱中取出培养皿，置于洁净工作台上。加入2毫升完全培养基，轻轻吹打以终止消化反应。接着将细胞悬液通过300目尼龙筛网过滤至15毫升离心管中。用预冷的PBS冲洗培养皿，并收集残留悬液。随后在室温下以878 G离心5分钟。离心结束后，吸除上清液并弃去。将沉淀物重悬于2毫升完全培养基中，再次在878 G下离心5分钟以纯化细胞。弃去上清液后，将细胞重悬于2毫升完全培养基中。取一个含有3毫升完全培养基的T25培养瓶，加入1毫升细胞悬液。以十字形方式轻轻摇晃培养瓶，然后放入孵箱中培养。48小时后，从孵箱中取出培养瓶，置于洁净工作台上。弃去用过的培养基，并用含1%青霉素-链霉素的1毫升PBS洗涤贴壁细胞表面三次。然后加入5毫升新鲜完全培养基，继续培养直至细胞融合度超过90%。用含1%青霉素-链霉素的1毫升PBS洗涤细胞三次。随后加入1毫升0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，孵育1分30秒。此时，在倒置显微镜下观察培养瓶。当细胞呈现圆形、脱离并开始漂浮时，向瓶中加入2毫升完全培养基以终止消化。然后用移液器吸取细胞悬液，将全部细胞悬液转移至15毫升离心管中。用含1%青霉素-链霉素的2毫升PBS冲洗培养瓶壁，并将冲洗液加入同一离心管中。在室温下以878 G离心5分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于适量体积的完全培养基中。最后根据需要以1:2或1:3的比例进行传代。第二代视网膜Müller细胞（RMCs）呈现星形或梭形形态，具有圆形或椭圆形细胞核及丰富的细胞质。苏木精-伊红染色显示细胞呈梭形和星形，胞质丰富呈粉红色，细胞核位于中央呈椭圆形，细胞间由细丝状结构相互连接。RMCs的免疫荧光染色结果显示，谷氨酰胺合成酶（Glutamine Synthetase）和水通道蛋白-4（Aquaporin-4）标记的细胞呈现强红色荧光，而CRALBP、Kir4.1和波形蛋白（Vimentin）则呈现明亮的绿色荧光。阴性对照NeuN在免疫荧光分析中未被检测到，证实了RMC分离的特异性。流式细胞术分析显示，98.7%的细胞谷氨酰胺合成酶阳性，97%的细胞CRALBP阳性，表明所获得的RMCs纯度较高。

isolation-culture-primary-retinal-mller-cells-from-sprague-dawley-sd

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

Sprague-Dawley （SD） 大鼠原代视网膜 Müller 细胞的分离和培养

在本视频中，我们将演示如何从小鼠眼球的睫状上皮中分离视网膜干细胞，并在体外培养以形成克隆性视网膜球体。所获得的球状细胞集落具有干细胞的核心特性：自我更新能力与多向分化潜能。...

从小鼠眼球中分离视网膜干细胞

数百万人患有导致不可逆失明的视网膜退行性疾病。这些疾病的一个共同特征是视网膜神经节细胞（RGCs）的丧失。本详细实验方案描述了通过流式细胞术结合阳性与阴性筛选方法分离原代小鼠RGCs的技术。...

通过流式细胞术分离原代小鼠视网膜神经节细胞（RGCs）

视网膜色素上皮（RPE）是眼部一种具有多种功能的上皮组织。本文介绍一种从小鼠RPE中建立原代细胞培养的实验方案。...

小鼠视网膜色素上皮原代细胞培养

本方案最初由 Fernandez-Godino 等人于 2016 年报道1，描述了一种高效分离和培养小鼠 RPE 细胞的方法，这些细胞在 Transwell 培养板上一周内即可形成具有功能性和极性的 RPE 单层。该操作过程约需 3...

高效分离与原代培养小鼠视网膜色素上皮细胞

本文描述了一种从小鼠眼球中逐步分离视网膜色素上皮（RPE）细胞的简化方案。该方案包括小鼠眼球的摘除与解剖，随后进行RPE细胞的分离、接种与培养。...

原代小鼠视网膜色素上皮细胞的分离

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分离原代猪视网膜色素上皮细胞用于 体外 建模

本文描述了一种从小鼠眼球中分离视网膜胶质穆勒细胞的详细实验方案。该方案从小鼠眼球的摘除和解剖开始，随后进行穆勒细胞的分离、接种和培养。...

原代小鼠视网膜胶质穆勒细胞的分离

视网膜色素上皮（RPE）在脉络膜和视网膜之间起着至关重要的屏障作用，有助于维持视网膜细胞类型（如光感受器细胞）的健康与功能。本文中，我们描述了一种简单且有效的成年小鼠RPE分离与培养方案。...

一种简化的小鼠成年视网膜色素上皮细胞分离与培养方法

从特定脑区分离并培养细胞有助于研究细胞和生理参数。我们描述了一种原代细胞培养方法，可在无血清环境中获得富含神经元的培养物。...

新生大鼠（P0）海马神经元的原代培养

原代肝细胞为在生理相关的实验体系中评估生化、分子及代谢功能提供了有价值的工具。本文描述了一种可靠的大鼠原位肝脏灌注方案，该方法可稳定地从每次制备中获得高达 1.0 × 108 个细胞的肝细胞，细胞活力维持在 88 ~ 96%...

大鼠肝细胞的分离与原代培养

学习从新生Sprague-Dawley大鼠分离和培养原代视网膜Müller细胞的标准化实验方案。该方法通过胰酶消化和离心纯化获得高纯度细胞，经免疫荧光验证可用于视网膜疾病建模及药物效应研究。

从Sprague-Dawley（SD）大鼠中分离与原代培养视网膜Müller细胞

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