Sprague-Dawley （SD） 大鼠原代视网膜 Müller 细胞的分离和培养

该协议描述了从 Sprague-Dawley SD 大鼠中分离和培养原代视网膜穆勒细胞，这可以帮助科学界的视网膜研究。该协议涵盖、视网膜夹层、CI 提取和鉴定以及关键控制注意事项。该协议建立了一种高效、标准化且具有成本效益的方法，用于从合法的 SD 机架中提取和回收 RMC。RMC模型可用于模拟糖尿病、正常等病理状况，辅助药物效果。

[旁白]首先，将 D-Hank 的溶液倒入两个 10 厘米的玻璃培养皿中。对新生SD大鼠实施安乐死和消毒后，将其放在无菌弯曲的培养皿上。使用牙镊子沿着睑裂撕裂眼睑皮肤，露出大鼠的眼球。将无齿镊子打开并平行于睑裂以压下眼眶。一旦到达视神经并暴露眼球，合上镊子以提起并取出眼球。现在将眼球放入装有 D-Hank 溶液的玻璃培养皿中。冲洗眼球并将其转移到另一个装有新鲜 D-Hank 溶液的盘子中。然后使用弯曲的眼科微型镊子，轻轻固定角膜和视神经之间的区域，以暴露角膜。使用微型角膜剪刀刺穿角膜巩膜交界处，并沿角膜缘以圆形方式切割。在松开镊子并在视神经和巩膜的交界处重新夹紧之前，做两个长度约为两毫米的对称巩膜切口。然后，使用第二个镊子轻轻按压视神经根部附近，将压力引导至角膜视神经界面。当晶状体组织出现时，小心地将其取下并继续按压，直到视网膜组织出现。使用镊子，将分离的视网膜组织转移到另一个无菌培养皿中。打开培养皿盖，用吸头一毫升的移液器将视网膜组织上下移液约15次，将其打碎成小块。然后，将组织与一毫升0.25%胰蛋白酶在37摄氏度下孵育五分钟。从培养箱中取出培养皿并将其放在干净的工作台上。加入两毫升完全培养基，轻轻移液以停止消化。现在通过 300 目尼龙筛网将细胞悬液过滤到 15 毫升离心机中。用准备好的PBS清洗培养皿并收集剩余的悬浮液。然后在室温下以 878 G 旋转试管五分钟。离心后，吸出并弃去上清液。将沉淀重悬于两毫升完全培养基中，并再次以 878 G 离心五分钟以纯化细胞。弃去上清液后，将细胞重悬于两毫升完全培养基中。取一个装有三毫升完全培养基的T25烧瓶，加入一毫升细胞悬液。在将烧瓶放入培养箱之前，以十字模式摇动烧瓶。孵育 48 小时后，将烧瓶从培养箱中取出并将其放在洁净的工作台上。弃去用过的培养基，用一毫升PBS洗涤细胞粘附表面3次，PBS含有1%青霉素和链霉素。然后加入五毫升新鲜的完全培养基，继续孵育，直到细胞汇合度超过90%。用一毫升含有1%青霉素链霉素的PBS洗涤细胞三次。然后将细胞与一毫升0.25%胰蛋白酶EDTA溶液孵育1分30秒。现在，在倒置显微镜下观察烧瓶。当细胞呈圆形、分离并开始漂浮时，向烧瓶中加入两毫升完全培养基以终止消化。然后使用移液器吸出细胞悬液，并将整个细胞悬液转移到15毫升离心管中。用两毫升含有 1% 青霉素链霉素的 PBS 冲洗烧瓶壁，并将其添加到同一管中。在室温下以 878 G 离心管五分钟。弃去上清液并将细胞沉淀重悬于适当体积的完全培养基中。最后，根据需要以一比二或一比三的比例传代细胞。第二代视网膜穆勒细胞或RMC表现出星形或纺锤形形态，具有圆形或椭圆形细胞核和丰富的细胞质。 苏木精和伊红染色显示梭形和星形细胞，具有丰富的粉红色细胞质和位于中央的椭圆形细胞核，通过细丝状结构相互连接。RMCs的免疫荧光染色显示，在标记谷氨酰胺合成酶和水通道蛋白-4的细胞中发出强烈的红色荧光，CRALBP、Kir4.1和波形蛋白发出亮绿色荧光。NeuN，免疫荧光分析未检测到阴性对照，证实了RMC分离的特异性。流式细胞术分析显示，98.7%的细胞谷氨酰胺合成酶呈阳性，97%的细胞CRALBP呈阳性，表明RMCs的纯度很高。